Los autores desean agradecer la asistencia de Harvard Apparatus, especialmente Stephanie Pazniokas, MS (Fisiología de Sistemas y Medicina Regenerativa) por su ayuda en el circuito de montaje, modificación y resolución de problemas del circuito de perfusión y XVIVO perfusión (Daniel Martinelli, CCP, CTP) para proporcionando un uso no clínico plejia pulmonar.

NOTA: Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con la guía de las líneas del Cuidado de Animales institucional y el Manual del Consejo Superior de Investigaciones para el Cuidado Humano y Uso de Animales de Laboratorio (IACUC) y ha sido objeto de aprobación por el Comité de Ohio State University IACUC. 1. Configuración inicial <ol><li> Monte el circuito EVLP y tienen tibia (37 ° C) perfundido que circula por el sistema antes de incorporar el pulmón ex plantado (Figura 1). </li><li> Ajuste el baño caliente de agua, que se utiliza para la chaqueta del depósito líquido de perfusión, intercambiador de calor, y el tórax artificial, a 37 ° C y en circulación (Figura 1). </li><li> Ejecutar una solución de-oxigenación (por ejemplo, 6% O 2, 8% de CO 2, 84% N 2) en sentido contrario actualmente a través del líquido de perfusión en el filtro de gas para asegurar el perfundido tiene ~ 6% de oxígeno disuelto para el experimento. NOTA: Este perfundido de-oxigenada permite la evaluación of la función pulmonar midiendo el oxígeno se introduce en el líquido de perfusión, post-órgano. </li><li> Abrir el programa de adquisición de datos y conectar el transductor de presión de la arteria pulmonar, transductor de presión diferencial traqueal, transductor de presión diferencial del flujo respiratorio, transductor de peso del pulmón, y el transductor de velocidad de la bomba al circuito EVLP y la caja del convertidor de adquisición de datos / de analógico a digital ( la Figura 2). </li><li> Configure la mesa de operaciones y herramientas de operación en el circuito EVLP (Figura 3). </li><li> Establecer un pequeño contenedor de nitrógeno líquido cerca del circuito EVLP si se pueden obtener muestras. NOTA: El sistema de autor ha sido modificado para recoger pre-órgano y perfundido post-órgano sin interrumpir la dinámica de presión-flujo que pueden potencialmente dañar el pulmón. </li></ol> 2. Preparación de anestésicos y heparina, anestesia de la Rata <ol><li> Ponga en el siguiente equipo de protección personal(PPE) antes de manipular las ratas y los tejidos de rata: máscara quirúrgica, guantes quirúrgicos, y bata desechable. </li><li> Pese la rata y registrar el peso. </li><li> Preparar 1.200 U / kg de heparina. </li><li> Preparar tanto 60 mg / kg de ketamina y 5 mg / kg de xilazina en la misma jeringa, la preparación de la primera ketamina. </li><li> Por vía intraperitoneal inyectar la mezcla de ketamina y xilazina en la rata y permiten 5 min para que la rata se convierten inconsciente. </li><li> Confirme anestesia adecuada marcando reflejo pizca dedo del pie. Si la rata no retira su dedo del pie, no se siente dolor. </li><li> Mueva rata para mesa de operaciones, asegurar en posición supina, y rociar con alcohol para la esterilización. </li></ol> 3. Extracción y ventilación inicial de los pulmones de ratas <ol><li> Preparar 20.4 cm suturas de seda largo (3-0 o 4-0 debería ser suficiente). </li><li> Comienza la grabación de datos utilizando el programa de adquisición de datos. </li><li> Entradas para la profundidad adecuada de la anestesia, utilizando tijeras quirúrgicas entran ca peritonealvidad por una laparotomía media e inyectar heparina en la vena cava inferior. </li><li> Llevar la incisión cranealmente pasado del manubrio en el cuello hasta que se expone la tráquea. No romper la cavidad torácica (Figura 4A). </li><li> Diseccionar posterior a la tráquea en la línea media posterior y deslice una sutura de seda a la tráquea (Figura 4B). </li><li> Levante la sección anterior de la tráquea y hacer una incisión transversal entre los anillos cartilaginosos, altas en la tráquea. No corte a través de la porción membranosa posterior de la tráquea en este punto (Figura 4C). </li><li> Canular la tráquea con la cánula traqueal y segura con la sutura de seda (Figura 4D). Asegúrese de que la ligadura de sutura se asegura en la muesca para mitigar la migración de la cánula. </li><li> Conectar la cánula de la tráquea al circuito de ventilación. </li><li> Encienda el ventilador mecánico para iniciar mecánicamente la ventilación del luNGS. NOTA: Los ajustes iniciales fueron escogidos para ser un volumen corriente de 4 ml / kg y la presión positiva espiratoria final (PEEP) de 2 cm H 2 O. Estos ajustes son los ajustes iniciales y dependiendo de las condiciones experimentales se pueden ajustar una vez que el órgano se encuentra en el sistema de perfusión ex vivo. </li><li> Introduzca la cavidad torácica a través del esternón / xifoides y continuar cranealmente hacia la horquilla esternal. Tenga cuidado de no tocar los pulmones. NOTA: Como el pulmón de rata es frágil, cualquier manipulación inadvertida puede conducir a trauma y edema pulmonar (Figura 5A). </li><li> Uso de 2 retractores, retraer la cavidad torácica para exponer correctamente la anatomía (Figura 5A). Una vez más, tenga cuidado de no tocar los pulmones. </li><li> Retire el timo con una ligera elevación y disección roma. </li><li> Desplaza los contenidos abdominales a un lado para dejar al descubierto ya sea la vena cava inferior (IVC) o de la vena mesentérica (MV). </li><li> Incisión ya sea el IVC o de la MV a Exsanguinate la rata, proporcionando la eutanasia. </li><li> Colocar una sutura de seda posterior a la arteria pulmonar y la aorta en preparación para asegurar la cánula de la arteria pulmonar (Figura 5B). </li><li> Haga una incisión de 2-3 mm en la superficie anterior del tracto de salida del ventrículo y colocar la cánula en la incisión y en la arteria pulmonar principal y seguro con la sutura de seda (Figura 5C). </li><li> Seccionar el ápice del corazón para permitir el acceso al ventrículo izquierdo y lave cualquier coágulo dentro de la vasculatura pulmonar haciendo fluir ~ 15 ml de una solución de bajo K + electrolito a través de la arteria pulmonar y hacia fuera a través de la punta del corazón en la cavidad torácica ( Figura 5D). </li><li> Conecte la cánula de la arteria pulmonar (AP) al circuito EVLP. Asegúrese de que la línea de flujo de entrada procedente del circuito a la cánula PA se cebó con perfundido para evitar cualquier aire que entra en el corazón y los pulmones. </li><li> Encienda elprincipal de la bomba peristáltica y la puso a un mínimo (~ 2 ml / min) la velocidad para permitir perfundido a ejecutar a través de la arteria pulmonar y el ventrículo izquierdo hacia la cavidad torácica. ** Paso crítico ** Asegúrese de que la presión de la AP no pico como esto es una señal de cualquiera de un bloqueo o mala canalización (Figura 6). </li><li> Apague la bomba peristáltica. </li><li> Coloque una sutura de seda detrás del corazón, alrededor de los ventrículos (Figura 7). </li><li> Comience el proceso de canulación de la aurícula izquierda mediante la inserción de un pequeño par de pinzas quirúrgicas en el ápice, a través de la válvula mitral, y hacia la aurícula izquierda. NOTA: Esto dilatar la válvula mitral y facilitar la canalización. Dilatación agresiva, o dilatación demasiado profundo, pueden lacerar inadvertidamente la aurícula izquierda haciendo que la adquisición ineficaz. </li><li> Retire las pinzas desde el corazón. </li><li> Inserte la cánula aurícula izquierda en el vértice a través de la válvula mitral y en la izquierda enbrio. </li><li> Fije la cánula de aurícula izquierda con la sutura de seda detrás del corazón (Figura 8). NOTA: Esta sutura puede ser &quot;pre-atado&quot; para facilitar la canalización. </li><li> Conecte la cánula de la arteria pulmonar a la ex-vivo circuito de perfusión pulmonar (Figura 9A). No conecte la cánula aurícula izquierda al circuito EVLP hasta que el bloque corazón-pulmón se ha eliminado completamente del cuerpo. </li><li> Sujetar el esófago con una pinza hemostática y corte por debajo de la abrazadera (entre la abrazadera y el diafragma), de modo que el esófago se puede utilizar para elevar la estructuras cardiopulmonar cefálica. </li><li> Sin rodeos diseccionar el tejido circundante y cortar la aorta descendente y los vasos auxiliares para liberar el bloque de corazón-pulmón a medida que se eleva a través del esófago (Figura 9B). </li><li> Seccionar la tráquea cefálica a la cánula traqueal para liberar completamente el bloque corazón-pulmón. </li><li> Retire el bloque corazón-pulmón y el lugar en el desiubicación gnated en el circuito EVLP (Figura 9C). </li><li> Conecte la cánula aurícula izquierda a la línea de salida e iniciar el principal de la bomba peristáltica (Figura 9D). </li></ol> 4. perfusión ex vivo de los Pulmones <ol><li> Eliminar rápidamente la línea de ventilación desde la parte superior del aparato EVLP y fijar la caja con los sensores de presión, a continuación, insertar la línea de ventilación en la parte superior de la carcasa en la parte superior del aparato EVLP. NOTA: Esto permitirá que los datos de ventilación para ser registrados y presión controlados. </li><li> Asegúrese de que la trampa de burbujas se llena con una cantidad adecuada de líquido de perfusión de manera que no hay burbujas de aire (es decir, embolia de aire) se introducen a los pulmones. </li><li> Poco a poco cambiar de ventilación y perfusión ajustes a los niveles experimentales deseados durante el inicial 15 min. Además, durante esta fase inicial de aceleración, aumentar la tasa de flujo de perfusión a la velocidad y / o presión deseada. NOTA: Programming el ventilador para producir respiraciones suspiro intermitentes, que facilitan la circulación de fluido fuera del espacio de pulmón y por lo tanto retrasar la aparición de edema, se recomienda. Estos pueden ser producidos por ventiladores equipados con la función suspiro. </li><li> Definir &quot;Hora 0&quot; como el momento en el que los parámetros de ventilación se encuentran en un volumen corriente de 4 ml / kg, PEEP a 2 cm H 2 O, y parámetros de perfusión están en sus niveles esperados y que permanece constante. </li><li> Si es necesario, tomar muestras de perfusado desde el puerto de la muestra, la congelación de flash en nitrógeno líquido, y anotar el tiempo de las muestras. </li><li> Cuando el experimento se ha completado, aislar cualquier piezas anatómicas necesarias para la recogida y destella congelación en nitrógeno líquido o lugar en solución fijadora para estudios posteriores. </li></ol>

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MONITOREO DEL SISTEMA ¿Qué cosas se ven como cuando experimento está funcionando bien: Una vez que las cánulas se han colocado en el circuito y los pulmones están ventilación, hay varias maneras de asegurar que el sistema está funcionando correctamente. No debe haber fugas de líquido de perfusión en toda la línea. La resistencia vascular pulmonar (PVR) debe permanecer relativamente constante (suponiendo un flujo constante). El intercambio de oxígeno debería aumentar una vez que el ventilador está funcionando correctamente y la ampliación de los pulmones para reclutar más alvéolos para el intercambio de gas. Figura 12A muestra pulmones conectados al circuito EVLP dentro del tórax artificial adecuada ventilación y perfusión. ¿Qué cosas se ven como cuando experimento no está funcionando bien: Hay algunos problemas comunes que han tenido la mayor tasa de ocurrencia durante las etapas iniciales de un experimento EVLP. La primera y más fácil to remedio es una fuga en la línea que sale de los pulmones. Esto se nota por un conjunto de puesta en común de perfusión bajo parte del circuito y el nivel en el depósito disminuye continuamente. Compruebe y apriete cualquier conector del tubo alrededor del área del derrame e inspeccionar el propio tubo de escape. Si esta pérdida se produce antes de que el pulmón, puede también introducir burbujas en el pulmón. Esto debería remediarse lo más rápidamente posible como burbujas de aire en el perfundido se traducirá en daño a los tejidos y causar un aumento significativo en el PVR. También puede haber una fuga procedente del pulmón o de una de las cánulas. Esto puede ser causado por cualquiera de deslizamiento de una cánula o una obstrucción en la línea de salir causando una acumulación de presión. Inspeccione la posición de ambas cánulas para asegurar ninguno ha deslizado o torcido. La presión de la AP también debe ser monitoreado durante este proceso, ya que un aumento instantáneo de la presión PA es un signo evidente de que se ha producido recientemente una obstrucción de algún tipo. Figura 12Bmuestra un pulmón roto que se rompió debido a las altas presiones. Un escape del propio pulmón también puede ser causado por un desgarro en el tejido. Este problema puede o no ser reparable pero reposicionamiento y volver a apretar las cánulas es la mejor opción en este escenario. Principales puntos de aprendizaje / Oportunidades: Ensayo y error el desarrollo del sistema de perfusión pulmonar ex vivo ha permitido identificar varias cuestiones clave que esbozamos para facilitar la aplicación eficaz del sistema EVLP. En primer lugar, respecto de la contratación, es importante que las técnicas anestésicas estándar se siguen correctamente para anestesiar a los animales (suficiente anestésicos, inyección en el peritoneo) y el cumplimiento de todas las políticas IACUC se requiere. La cánula (mostrado en la Figura 13 A, B, y C) debe lavarse repetidamente con el fin de eliminar cualquier coágulo y / o escombros dentro de la vasculat pulmonarUre. Con respecto a la selección de los animales, le sugerimos que utilice Sprague Dawley o ratas Lewis con un peso de 250-350 g. Especial cuidado debe ser tomado al cannulating ratas que pesa cerca de 250 g desde los vasos será más pequeño y por lo tanto mucho más difíciles de canular sin lesionar la vasculatura. Si las ratas más pequeñas, o un modelo de ratón, se va a utilizar, puede necesitar ser usado más pequeña cánula. Canulación traqueal no es típicamente un reto, siempre y cuando la sutura está fijado adecuadamente haciendo pasar primero una posterior sutura de seda a la tráquea después de la disección de la fascia de los alrededores y antes de la canulación. Siga esto con una incisión anterior 1-2 anillos traqueales por encima de la sutura para pasar la cánula. Atar nudos en cuadrados entre los anillos traqueales con el fin de asegurar que dentro de una ranura para una mejor seguridad (Figura 4C). La canulación de la arteria pulmonar (AP) es más difícil en comparación con la cánula traqueal. Los pasos siguientes se utilizaron en este estudiopara este procedimiento. En primer lugar, comprender el ápice del corazón con un par de pinzas. Pase otro par de pinzas en el seno transverso y el hilo de sutura para fijar la cánula en la PA proximal. Incisión en el ventrículo derecho inmediatamente antes del tracto de salida del ventrículo (TSVD) (Figura 14A). Después de la incisión en el TSVD, la cánula se orientará hacia el tracto de salida pulmonar arteria. Tener la sutura en posición detrás de la arteria pulmonar / aorta antes de la ventriculotomía derecha aumenta la eficiencia (Figura 5C). La cánula debe estar asegurado en el lugar con la sutura para evitar el desplazamiento. Una complicación importante puede ocurrir si la cánula PA no está en la orientación anatómica correcta. La cánula puede ser insertado demasiado lejos y sólo perfundir una rama o convertirse-mal posicionado con torsión de la muestra de corazón-pulmón después de retirarlos de la cavidad torácica. Esto puede ser fácilmente orientado de nuevo a la posición original para preservar el ángulo apropiado de anatomiposición de cal. Por último, la aurícula izquierda (LA) canulación es la parte más difícil del procedimiento. La cánula LA tiene que ser colocado dentro de la aurícula izquierda. Con los tejidos de ser extremadamente friable, ser conscientes de no utilizar la fuerza o la torsión significativa con el fin de evitar un desgarro en la vena pulmonar y la aurícula izquierda que luego hacer el experimento insalvable. La cánula PA es el mejor situado antes de la cánula LA. A ventriculotomía izquierda con la eliminación del ápice se ha demostrado que alteran la tendinosas cordae y permitir un acceso más fácil a través de los velos mitrales. Además, el ventriculotomía hace que sea más fácil para dilatar y visualizar la válvula mitral y para alimentar la cánula a través de la válvula mitral. La dilatación del anillo de la válvula mitral con un par de pequeñas de extremos romos pick-up se puede hacer con el fin de visualizar el tracto en el LA (Figura 14B). Sutura debe colocarse detrás del corazón antes de la canulación. Esto se puede hacer simplemente levantando el corazón usando un par de small pick-ups extremos romos y la colocación de la sutura debajo ya través del corazón. El LA ahora está listo para ser canulado. Alimentar a la cánula LA a través de las pick-ups con el fin de visualizar correctamente la colocación de la cánula en la aurícula izquierda. Tenga especial cuidado de no desplazar la cánula hacia el ventrículo izquierdo. La sutura debe entonces ser fijado firmemente a lo largo del miocardio del ventrículo izquierdo. Fijación de la sutura a la aurícula izquierda podría ocluir la totalidad o parte de la cánula. Durante el procedimiento, es crucial que el aire no permanece en la sección de flujo de entrada del aparato. Cualquier aire significativa puede producir una embolia de aire aumentar la PVR (efectivamente un &quot;air-lock&quot;) que se traducirá en un flujo de perfundido mucho menor para una presión dada. Varios puntos se pueden utilizar para eliminar el aire dentro del sistema. Se espera que el aire dentro de la sección de flujo de salida y no debe tener ningún efecto perjudicial sobre los pulmones. Un modelo porcino para la hipertensión pulmonar ha sidose muestra para recrear la patología de pequeñas cantidades de aire continuo durante un período de 8 semanas. El aumento de aire disminuye la cantidad de perfusión presente mientras que causan la inflamación de los tejidos circundantes 19. El inicio de la perfusión puede ocurrir una vez que la canulación es completa, pero antes de que el tubo procedente de la LA está conectado a la línea de EVLP. Perfundido se debe ejecutar a través de despejar cualquier coágulo de sangre y esto perfusión puede vaciar en la pared torácica sin ningún problema. Cambio de la bomba de perfusión a modo manual y aumentando lentamente el caudal a ~ 2 ml / min permite una estrecha vigilancia de la presión de la AP. Presiones más de 20 a 30 cm H 2 O pueden indicar una obstrucción y mirando para perfusión de salir de la LA es también un indicador, pero esto puede ser muy difícil de ver. Si la presión aumenta a más de 20 a 30 cm H 2 O, detener la bomba y vuelva a revisar ambos canulaciones. Una vez que la presión es constante alrededor de 10 a 20 cm H 2 O permitir ªe perfundido para ejecutar a través y en la cavidad torácica durante 2 min. En este momento la línea desde el LA se puede conectar al circuito de EVLP. La velocidad de la bomba de perfusión se puede aumentar a 5-10 ml / min. A medida que el cabezal de fluido avanza a través del circuito, habrá un aumento en la presión PA debido al aumento de la altura de la cabeza de fluido y por lo tanto la presión estática. Si el fluido no puede fluir por encima del punto más alto en la línea, puede ser necesario o bien aplicar una fuerza de succión en el extremo opuesto de la línea o intentar bajar la parte más alta de la línea. Una vez que este problema se supera, la perfusión debe circular sin ningún problema. Unos temas deben ser controlados con respecto al ventilador. En primer lugar, la torsión de los bronquios / tráquea y la posición de corazón-pulmón puede ocurrir como los pulmones se vuelven más edematosa y aumenta el peso. Es importante para las cánulas para permanecer en una posición anatómica relativamente cerca, por lo tanto alterando uno o ambos cánulae puede ser necesario. La presión o ventiladores controlados por volumen, así como la ventilación positiva o negativa se pueden utilizar con este sistema EVLP. Para el modelo de rata, hemos encontrado el uso de presión positiva, la ventilación controlada por volumen funciona bien en volúmenes corrientes entre 4-10 ml / kg y en las presiones positiva espiratoria final (PEEP) entre 2-8 cm H 2 O. Sin embargo, una PEEP de 8 cmH 2 O puede causar una posible rotura en la bifurcación de la tráquea. Después de cada experimento (o conjunto de experimentos si se realiza-back-to-back), la línea de ventilación que conduce a la tráquea debe limpiarse de cualquier lavado broncoalveolar (BAL) que pueden haber viajado hasta la tráquea. Este líquido se endurecerá si se deja intacto y puede bloquear completamente la línea de ventilación. La composición perfundido es crítica para un experimento EVLP éxito. Una mezcla de dextrano al 5% permite la perfusión pulmonar que está cerca de las condiciones fisiológicas, mantiene una presión oncótica estable para conducir b fluidoack en la vasculatura para prevenir el edema y previene la trombosis dentro de los vasos pulmonares. Es importante señalar que algunas especies de ratas pueden ser alérgicos a dextrano que puede provocar edema pulmonar 20. El contenido de la perfusión fue consistente en todos los grupos experimentales en este estudio, por lo tanto, el contenido de dextrano no debe ser un factor de confusión. La presión oncótica es una variable crítica que tiene el potencial para mejorar o producir edema tisular. Disoluciones de perfusión comercialmente disponibles que están optimizados para almacenamiento estático frío o perfusiones normothermic se han utilizado en este sistema para aumentar los tiempos de viabilidad de pulmón. Tomamos nota de que algunas de estas soluciones contienen albúmina y una preocupación es la posibilidad de albúmina bovina desencadenar una respuesta inflamatoria en el pulmón de roedores. Aunque la composición óptima perfundido es un tema en curso de la investigación, el perfusado debe tener en cuenta la presión oncótica, la capacidad de presión osmótica y el almacenamiento en búfer. We recomienda que la solución se basa en una solución o cultivo celular Krebs-Henseleit medios modificada. La presión oncótica debe ser mantenida por dextrano o albúmina, dependiendo de la aplicación. La tasa de la presión de perfusión y el flujo afecta a los parámetros de perfusión de órganos y supra-fisiológica pueden hacer que el órgano propensos a trauma mecánico. Indicadores visuales durante el experimento: Hay muchas señales visuales, así como indicaciones de datos en tiempo real que se puede utilizar para determinar si un experimento EVLP está funcionando bien. El pulmón seguirá siendo el mismo tamaño y se desinflará en el mismo volumen después de cada respiración. También habrá ninguna fuga del propio pulmón. El PVR, peso de los pulmones, y el cumplimiento se mantendrá relativamente constante. La producción de oxígeno se mantendrá constante o aumentar ligeramente. Hay muchos indicadores visuales cuando el pulmón se convierte en peligro durante un experimento. El pulmón se convierte en un edematosand crece rápidamente en tamaño y peso. El color de los cambios pulmonares (desde una tan-rosa a blanco) y bolsas de líquido puede ser identificado en el tejido. Si la tráquea o los pulmones rupturas de barotrauma o más de distensión, habrá burbujeando desde el punto de la lesión (Figura 12B). La producción de oxígeno disminuye y el PVR y el cumplimiento se incrementará dramáticamente. El potencial del uso de un modelo EVLP en animales pequeños como roedores abre la puerta a futuros estudios mejorando el tratamiento de los trasplantes de pulmón. Sin embargo, el modelo animal pequeño requiere una mejor comprensión de imitar verdaderamente un trasplante de pulmón. Este modelo puede ser utilizado en el futuro para mejorar los tratamientos médicos y definir los parámetros de línea de base para futuros estudios de trasplante de pulmón.

Importancia clínica Actualmente hay una escasez de pulmones adecuados disponibles para el trasplante con sólo el 19% de los pulmones que son capaces de ser utilizados a nivel nacional que lleva a prolongado tiempo en lista de espera o los pacientes que mueren en espera de trasplante 1. La escasez puede ser debido a los donantes de mayor edad, traumatismos, infecciones, insuficiencia orgánica multisistémica y pulmones donados a veces heridos después de la cosecha 2. Además, el pulmón es un órgano frágil fuera de la cavidad torácica y técnicas de transporte y conservación estándar puede conducir a un deterioro y no viables pulmones. Por lo tanto, el mantenimiento y la mejora de la viabilidad pulmonar ex vivo se ha convertido recientemente en un foco importante en la medicina de trasplante de pulmón. Ex-vivo de perfusión pulmonar (EVLP) Ex-vivo de perfusión pulmonar (EVLP) ha evolucionado para perfundir continuamente órganos que se están evaluando para el trasplante y permite un período de evaluación de que todoujos para el potencial de la reanimación pulmonar o reacondicionamiento. EVLP puede prolongar totales de los órganos del cuerpo tiempo de isquemia y permite que los órganos donados para viajar distancias más largas 3. Típicamente, los pulmones son ventilados al 50% de la capacidad pulmonar total o 20 cmH 2 O de la presión de la vía aérea pico con una fracción de oxígeno inspirado (FiO 2) de 30% a 50% 4. Solución de preservación se perfunde a 40-60 ml / kg (aproximadamente 40% del gasto cardíaco predicho de 100 ml / kg) en seres humanos y animales grandes 5,6, pero se perfunde en torno al 20% del gasto cardíaco de ratas 7. La inclusión de solución STEEN ha permitido a los pulmones humanos viajen en entornos RT sin desarrollo de edema pulmonar 9. Este trabajo pionero ha sido refinado por la Universidad de Toronto pulmón Trasplante Programa 10-13 y está siendo evaluado para una mejor evaluación de los pulmones de donantes marginales para el trasplante 14,15. Sin embargo, el ventilatio óptiman y perfusión condiciones necesarias para regenerar pulmones marginales y / o sub-estándar para el trasplante no se conoce y es actualmente un área activa de investigación. Sistemas de perfusión pulmonar aislada, se han utilizado en animales pequeños para causar lesión pulmonar, vuelva a crear enfermedades respiratorias, y perfundir los pulmones con diferentes soluciones para prevenir el daño isquémico. Los investigadores han creado un modelo de pequeños animales de trasplante de pulmón utilizando el sistema aislado de pulmón de perfusión para imitar los protocolos EVLP que podrían ser utilizados en seres humanos y animales más grandes 16-18. Sin embargo, este modelo experimental tiene muchos retos con respecto a las diversas técnicas y parámetros utilizados para imitar la fisiología humana. En particular, hay muchas sutilezas en mantener la viabilidad de pulmón durante EVLP. Estas sutilezas pueden surgir debido a diferencias en la técnica de recolección, los ajustes de ventilación con presión positiva, composición y condiciones de flujo de perfundido y la canulación de la pulmón. Therntes, el objetivo aquí es proporcionar a la comunidad de investigación con una serie de sugerencias para solucionar problemas e implementación que hemos encontrado plomo a un método robusto para implementar EVLP en un modelo de roedores.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="980">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:221px;">Company</td>
			<td style="width:225px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:196px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">IPL-2 Basic Lung Perfusion System</td>
			<td style="width:221px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Tweezer #5 stainless steel, curved 11cm</td>
			<td style="width:221px;">Kent Scientific Corporation</td>
			<td style="width:225px;">IND500232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Tweezer #5 Dumostar, 11cm</td>
			<td style="width:221px;">Kent Scientific Corporation</td>
			<td style="width:225px;">INS500085-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Tweezer #7 Titanium, 12cm tips curved</td>
			<td style="width:221px;">Kent Scientific Corporation</td>
			<td style="width:225px;">INS600187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">McPherson-Vannas Scissors 8cm, Str 5mm</td>
			<td style="width:221px;">Kent Scientific Corporation</td>
			<td style="width:225px;">INS14124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Vannas Scissors 8cm Str 5mm</td>
			<td style="width:221px;">Kent Scientific Corporation</td>
			<td style="width:225px;">INS14003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Instrument Sterilization Tray 5&#34; x 7&#34;</td>
			<td style="width:221px;">Kent Scientific Corporation</td>
			<td style="width:225px;">INS800101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Heparin 30,000 units per 30mL</td>
			<td style="width:221px;">APP Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:225px;">Supplied from OSU Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Ketamine 500mg per 5mL</td>
			<td style="width:221px;">JHP Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:225px;">Supplied from OSU Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Xylazine 100mg per 1mL</td>
			<td style="width:221px;">Akorn</td>
			<td style="width:225px;">Supplied from OSU Pharmacy</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">10cc insulin syringe 29 Ga x 1/2&#34; needle</td>
			<td style="width:221px;">B-D</td>
			<td style="width:225px;">309301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Hyflex NBR</td>
			<td style="width:221px;">Ansell</td>
			<td>S-17310M</td>
			<td>Bite proof gloves</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">BL1500</td>
			<td style="width:221px;">Sartarius</td>
			<td style="width:225px;">Practum 1102-1S</td>
			<td>Scale</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Large Flat Bottom Restrainer</td>
			<td style="width:221px;">Braintree Scientific Inc</td>
			<td>FB L 3.375 dia x 8.5, 250-500gm rat&#160;</td>
			<td>Rat tunnel for injection</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Sterling Nitrile Powder-free Exam Gloves, Large</td>
			<td style="width:221px;">Kiberly-Clark</td>
			<td style="width:225px;">50708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Rapidpoint 405</td>
			<td style="width:221px;">Siemens</td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td>blood gas analyzer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Fiberoxygenator D150</td>
			<td style="width:221px;">Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td style="width:225px;">PY2 73-3762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">LabChart v7.3.7</td>
			<td style="width:221px;">ADInstruments</td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Tracheal cannula</td>
			<td style="width:221px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:225px;">733557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Pulmonary Artery cannula</td>
			<td style="width:221px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:225px;">730710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Left Atrium cannula</td>
			<td style="width:221px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:225px;">730712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Peristaltic Pump&#160;</td>
			<td style="width:221px;">Ismatec</td>
			<td style="width:225px;">ISM 827B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Small Animal Ventilator model 683</td>
			<td style="width:221px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:225px;">55-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Ecoline Star Edition 003, E100</td>
			<td style="width:221px;">Lauda</td>
			<td style="width:225px;">LCK 1879</td>
			<td>Water Heater</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Tubing Cassette</td>
			<td style="width:221px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:225px;">IS 0649</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Connect kit D150</td>
			<td style="width:221px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:225px;">VK 73-3763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">PowerLab 8/35</td>
			<td style="width:221px;">ADInstruments</td>
			<td style="width:225px;">730045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">TAM-A transducer amplifier module type 705/1</td>
			<td style="width:221px;">Hugo Sachs - Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:225px;">73-0065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">TAM-D transducer amplifier type 705/2</td>
			<td style="width:221px;">Hugo Sachs - Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:225px;">73-1793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">SCP Servo controller for perfusion type 704</td>
			<td style="width:221px;">Hugo Sachs - Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:225px;">732806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">CFBA carrier frequency bridge amplifier type 672</td>
			<td style="width:221px;">Hugo Sachs - Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:225px;">731747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">VCM ventilator control module type 681</td>
			<td style="width:221px;">Hugo Sachs - Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:225px;">731741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">TCM time control module type 686</td>
			<td style="width:221px;">Hugo Sachs - Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:225px;">731750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">IL2 Tube set for perfusate</td>
			<td style="width:221px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:225px;">733842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Tube set for moist chamber</td>
			<td style="width:221px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:225px;">73V83157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Tygon E-3603 Tubing 2.4mm ID</td>
			<td style="width:221px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:225px;">721017</td>
			<td>perfusate line entering lung</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">Tygon E-3603 Tubing 3.2mm ID</td>
			<td style="width:221px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:225px;">721019</td>
			<td>perfusate line leaving lung</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:339px;">low potassium dextran glucose solution</td>
			<td style="width:221px;"></td>
			<td style="width:225px;"></td>
			<td>flushing the lung</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat evlp program

El número de pulmones donantes aceptables disponibles para el trasplante de pulmón es muy limitada debido a la mala calidad. Ex-Vivo perfusión pulmonar (EVLP) ha permitido el trasplante de pulmón en los seres humanos para ser más fácilmente disponible, permitiendo la capacidad de evaluar los órganos y ampliar el grupo de donantes. Como esta tecnología se expande y mejora, la capacidad de evaluar y potencialmente mejorar la calidad de los pulmones deficientes antes del trasplante es una necesidad crítica. Con el fin de evaluar más rigurosamente estos enfoques, un modelo animal reproducible necesita ser establecido que permita el ensayo de técnicas mejoradas y la gestión de los pulmones donados, así como para el receptor de pulmón-trasplante. Además, un modelo animal EVLP de patologías asociadas, por ejemplo, inducida por la ventilación lesión pulmonar (IVL), sería proporcionar un nuevo método para evaluar tratamientos para estas patologías. Aquí se describe el desarrollo de un programa de pulmón EVLP rata y refinamientos a esto method que permiten un modelo reproducible para una futura expansión. También se describe la aplicación de este sistema EVLP modelar IVL en los pulmones de ratas. El objetivo es proporcionar a la comunidad de investigación con la información clave y &quot;perlas de sabiduría&quot; / técnicas que surgieron de ensayo y error y son fundamentales para el establecimiento de un sistema de EVLP que es robusto y reproducible.

Los datos mecánicos en tiempo real recogidos a través del programa de adquisición de datos pueden ser fácilmente analizados para probar cualquier número de hipótesis. Por ejemplo, la Figura 10A muestra el peso medio del pulmón a través de 60 min de 10 experimentos con ratas donde los animales fueron ventilados con un volumen corriente bajo / bajo PEEP de 4 ml / kg y 2 cm H 2 O. Aunque hay un aumento muy pequeño en peso de los pulmones durante todo el experimento, este aumento no es estadísticamente significativa (ANOVA, p = 0,92). La figura 10B muestra la presión media arterial pulmonar (PAP) a través de 60 min de 12 experimentos con ratas. El PAP inferior en el punto de tiempo 0 min es el resultado de la configuración de flujo y de ventilación inferiores utilizados en el comienzo de todos los experimentos y la PAP se mantiene constante después de este punto de tiempo sin cambios estadísticamente significativos después de t = 10 min (ANOVA en filas, p = 0.89). Figura 10C muestra la resistencia vascular pulmonar (PVR) a través de 60 min de 12 ratasexperimentos y aunque hay una pequeña disminución de la PVR después de t = 20 min, no había ninguna diferencia estadísticamente significativa en PVR durante este experimento (ANOVA en filas, p = 0,65). En comparación con los datos de PVR se muestra aquí, Noda et al. ha mostrado el PVR para aumentar ligeramente con el tiempo durante 4 h. Sin embargo, los autores informan de datos en PVR a partir de 1 hr en lugar del inicio del experimento y no hay valores de desviación estándar se proporcionan 7. Noda et al. también no muestra datos de edema pulmonar de los 4 experimentos hr por lo que no se puede hacer la comparación con los datos presentados aquí en la figura 10A. Las principales diferencias en Noda et al. procedimiento en comparación con lo que se muestra en este trabajo son: a conservación en frío de 1 hora en una solución de LPS antes EVLP, las ratas fueron ventilados inicialmente con una mezcla de gas que incluye isoflurano para hacerlos inconsciente, la solución de perfusión se complementó con 50 mg de metilprednisolona y 50 mg de cefalosporina, total flow se definió como 20% de la gasto cardíaco calculado, se tomaron muestras de perfundido sólo después de que el pulmón se había ventilado en 100% de O 2 durante 5 min antes y el experimento se realizó durante 4 hr. Las muestras tomadas durante el experimento desde el perfundido también pueden ser analizados para muchos propósitos. Como ejemplo, en la Figura 11 se demuestra cómo alto volumen / ventilación de alta PEEP tidal puede inducir una respuesta pro-inflamatoria en 60 min. Para estos experimentos, la perfusión de 4 ratas ventilado en condiciones perjudiciales, es decir, de alto volumen corriente de 10 ml / kg y de alta PEEP de 8 cm H 2 O, se analizaron por citoquinas pro-inflamatorias y anti-IL1β, TNFa e IL-4 utilizando el estándar técnicas ELISA. Como se muestra en la Figura 11, en ​​comparación con los niveles de citocinas antes de la ventilación (0 min), 60 min de la ventilación perjudicial resultó en un aumento estadísticamente significativo de IL-1β y TNF (citoquinas pro-inflamatorias) una<html> nd ningún cambio en IL-4 (una citoquina anti-inflamatoria) de concentración. Por lo tanto, este sistema EVLP es capaz de generar perfiles de lesión pulmonar observadas comúnmente durante la ventilación mecánica. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig1highres.jpg" /> Figura 1. Esquema y fotografía de animales ex vivo de perfusión pulmonar (EVLP) circuito pequeño. Las letras en el diagrama coinciden con las letras en la fotografía. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig2highres.jpg" /> Figura 2. Todos los transductores están conectados firmemente a las cajas de control.&quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig3highres.jpg" /> Figura 3. La mesa de operaciones rata se establece firmemente situado junto al circuito de perfusión ex vivo de pulmón (EVLP). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig4highres.jpg" /> Figura 4. (A) Se hace una incisión cranealmente para exponer la tráquea. La cavidad torácica no está expuesto. (B) Una sutura de seda se coloca detrás de la tráquea. (C) La tráquea se cortó parcialmente para prepararse para la canulación. (D) La cánula se coloca en la tráquea positio<html> n y se fija con una sutura de seda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig5highres.jpg" /> Figura 5. (A) La cavidad torácica se tira hacia atrás para permitir el acceso al corazón y pulmón. (B) Preparación para la colocación de la sutura detrás de la arteria pulmonar. (C) La arteria pulmonar se canula y atado con la sutura de seda colocado previamente. (D) Una solución de bajo K + electrolito se vacía a través de la arteria pulmonar y la aurícula izquierda para eliminar los coágulos de sangre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una mayor versión de esta figura.</a> iempre &quot;&gt; <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig6highres.jpg" /> Figura 6. El aumento del flujo arterial pulmonar al lavar el pulmón puede causar la presión arterial pulmonar para aumentar dramáticamente. Si la canalización se ha realizado correctamente y no hay obstrucción importante, la presión debe disminuir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura .</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig7highres.jpg" /> Figura 7. sutura de seda se coloca alrededor de todo el corazón en la preparación para la canulación aurícula izquierda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig7large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> n-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig8highres.jpg" /> Figura 8. La cánula aurícula izquierda se sujeta en su lugar con una sutura de seda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig9highres.jpg" /> Figura 9. (A) La cánula de la arteria pulmonar se conecta al circuito de perfusión pulmonar ex-vivo. (B) El esófago se sujeta y el tejido conectivo se disecciona sin rodeos para quitar el bloque de corazón-pulmón. (C) El bloque corazón-pulmón se retira de la cavidad del pecho y se coloca en el circuito de perfusión pulmonar ex-vivo. (D) La aurícula izquierda está conectado al circuito de perfusión pulmonar ex-vivo.<html> href = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig9large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig10highres.jpg" /> Figura 10. (A) peso de los pulmones de ratas macho Sprague Dawley a través de 60 min de perfusión ex vivo de pulmón (n = 10). (B) la presión arterial pulmonar de ratas macho Sprague Dawley a través de 60 min de perfusión ex vivo de pulmón (n = 12). (C) La resistencia vascular pulmonar de ratas Sprague Dawley a través de 60 minutos de perfusión ex vivo de pulmón (n = 12), NS indica que no hay diferencias estadísticamente significativas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig10large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="&lt;/ Html"><html> &quot;Figura 11&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52309 / 52309fig11highres.jpg&quot; /&gt; Figura 11. Efecto de ventilación 1 hora a altos volúmenes corrientes (10 ml / kg) y alta PEEP (8 cmH 2 O) en las concentraciones de citoquinas pro-inflamatorias y anti-en el perfundido. N = 4, * indica diferencia estadísticamente significativa con respecto a la muestra 0 h (p &lt;0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig11large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 12" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig12highres.jpg" /> Figura 12. (A) A correctamente ventilación y perfusión del pulmón conectado al circuito EVLP. (B) de alta presión al final de la espiración (PEEP) causa un desgarre en la bifurcación tráquea causando que se formen burbujas en la lesión y llenar el tórax artificial.<html> en / ftp_upload / 52309 / 52309fig12large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 13" src="/files/ftp_upload/52309/52309fig13highres.jpg" /> Figura 13. (A) cánula de la arteria pulmonar. Esta cánula es menor que la cánula de aurícula izquierda. (B) Izquierda cánula atrio. Esta cánula es mucho mayor que la cánula de la arteria pulmonar. (C) de la cánula de la tráquea. Esta cánula tiene nervios para ayudar en la obtención de la tráquea con sutura de seda. El fin que se inserta en la tráquea también está apuntando ligeramente para ayudar en la inserción de la cánula en la tráquea. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig13large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 09fig14highres.jpg &quot;/&gt; Figura 14. (A) El ápice del corazón está en manos de un par de pinzas como el ventrículo derecho está a punto de incisión con el fin de canular la arteria pulmonar. (B) La dilatación del anillo de la válvula mitral con un par de pequeños con extremos romos pick-ups hace que sea más fácil visualizar las vías hacia la aurícula izquierda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52309/52309fig14large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

Ex-Vivo perfusión pulmonar (EVLP) ha permitido el trasplante de pulmón en los seres humanos para ser más fácilmente disponible, permitiendo la capacidad de evaluar los órganos y ampliar el grupo de donantes. Aquí se describe el desarrollo de un programa EVLP rata y mejoras que permitan un modelo reproducible para una futura expansión.

Método de aislados<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusión pulmonar en un modelo de rata: Lecciones Aprendidas de Desarrollo de un Programa EVLP Rata

The number of acceptable donor lungs available for lung transplantation is severely limited due to poor quality. Ex-Vivo Lung Perfusion (EVLP) has allowed ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Method of Isolated Ex Vivo Lung Perfusion in a Rat Model: Lessons Learned from Developing a Rat EVLP Program

27.0K vistas.  Ohio State University Wexner Medical Center.  Ex-Vivo perfusión pulmonar (EVLP) ha permitido el trasplante de pulmón en los seres humanos para ser más fácilmente disponible, permitiendo la capacidad de evaluar los órganos y ampliar el grupo de donantes. Aquí se describe el desarrollo de un programa EVLP rata y mejoras que permitan un modelo reproducible para una futura expansión. 

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A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

Un sencillo método de intubación ratón de pulmón

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Investigación

Medicina

Method of Direct Segmental Intra-hepatic Delivery Using a Rat Liver Hilar Clamp Model

Major hepatic surgery with inflow occlusion, and liver transplantation, necessitate a period of warm ischemia, and a period of reperfusion leading to ischemia/reperfusion (I/R) injury with myriad negative consequences. Potential I/R injury in marginal organs destined for liver transplantation contributes to the current donor shortage secondary to a decreased organ utilization rate. A significant need exists to explore hepatic I/R injury in order to mediate its impact on graft function in transplantation. Rat liver hilar clamp models are used to investigate the impact of different molecules on hepatic I/R injury. Depending on the model, these molecules have been delivered using inhalation, epidural infusion, intraperitoneal injection, intravenous administration or injection into the peripheral superior mesenteric vein. A rat liver hilar clamp model has been developed for use in studying the impact of pharmacologic molecules in ameliorating I/R injury. The described model for rat liver hilar clamp includes direct cannulation of the portal supply to the ischemic hepatic segment via a side branch of the portal vein, allowing for direct segmental hepatic delivery. Our approach is to induce ischemia in the left lateral and median lobes for 60 min, during which time the substance under study is infused. In this case, pegylated-superoxide dismutase (PEG-SOD), a free radical scavenger, is infused directly into the ischemic segment. This series of experiments demonstrates that infusion of PEG-SOD is protective against hepatic I/R injury. Advantages of this approach include direct injection of the molecule into the ischemic segment with consequent decrease in volume of distribution and reduction in systemic side effects.

A unique rat liver hilar clamp model was developed for studying the impact of pharmacologic molecules in ameliorating ischemia-reperfusion injury. This model includes direct cannulation of the portal supply to the ischemic liver segment via a branch of the portal vein, allowing for direct hepatic delivery.

Método de la entrega directa segmentaria intra-hepática utilizando un modelo de hígado de rata hiliar abrazadera

Major hepatic surgery with inflow occlusion, and liver transplantation, necessitate a period of warm ischemia, and a period of reperfusion leading to ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been introduced as a method to evaluate and modify organ function. NEVLP has many advantages in comparison to hypothermic and subnormothermic perfusion including reduced preservation injury, restoration of normal organ function under physiologic conditions, assessment of organ performance, and as a platform for organ repair, remodeling, and modification. Both murine and porcine NEVLP models have been described. We demonstrate a rat model of NEVLP and use this model to show one of its important applications &#8212; the use of a therapeutic molecule added to liver perfusate. Catalase is an endogenous reactive oxygen species (ROS) scavenger and has been demonstrated to decrease ischemia-reperfusion in the eye, brain, and lung. Pegylation has been shown to target catalase to the endothelium. Here, we added pegylated-catalase (PEG-CAT) to the base perfusate and demonstrated its ability to mitigate liver preservation injury. An advantage of our rodent NEVLP model is that it is inexpensive in comparison to larger animal models. A limitation of this study is that it does not currently include post-perfusion liver transplantation. Therefore, prediction of the function of the organ post-transplantation cannot be made with certainty. However, the rat liver transplant model is well established and certainly could be used in conjunction with this model. In conclusion, we have demonstrated an inexpensive, simple, easily replicable NEVLP model using rats. Applications of this model can include testing novel perfusates and perfusate additives, testing software designed for organ evaluation, and experiments designed to repair organs.

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant liver donor shortage, and criteria for liver donors have been expanded. Normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been developed to evaluate and modify organ function. This study demonstrates a rat model of NEVLP and tests the ability of pegylated-catalase, to mitigate liver preservation injury.

Un pequeño modelo de la perfusión hepática normotérmica Ex Vivo

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

A Rat Lung Transplantation Model of Warm Ischemia/Reperfusion Injury: Optimizations to Improve Outcomes

From our experience with rat lung transplantation, we have found several areas for improvement. Information in the existing literature regarding methods for choosing appropriate cuff sizes for the pulmonary vein (PV), pulmonary artery (PA), or bronchus (Br) are varied, thus making the determination of proper cuff size during rat lung transplantation an exercise of trial and error. By standardizing the cuffing technique to use the smallest effective cuff appropriate for the size of the vessel or bronchus, one can make the transplantation procedure safer, faster, and more successful. Since diameters of the PV, PA, and Br are related to the body weight of the rat, we present a strategy to choosing an appropriate size using a weight-based guide. Since lung volume is also related to body weight, we recommend that this relationship should also be considered when choosing the proper volume of air for donor lung inflation during warm ischemia as well as for the proper volume of PBS to be instilled during bronchoalveolar lavage (BAL) fluid collection. We also describe methods for 4th intercostal space dissection, wound closure, and sample collection from both the native and transplanted lobes.

Here, we present optimizations to a rat lung transplantation model that serve to improve outcomes. We provide a size guide for cuffs based on body weight, a measurement strategy to ascertain the 4th intercostal space, and methods of wound closure and BAL (bronchoalveolar lavage) fluid and tissue collection.

Un modelo de trasplante de pulmón de rata de lesión por isquemia/reperfusión caliente: optimizaciones para mejorar los resultados

From our experience with rat lung transplantation, we have found several areas for improvement. Information in the existing literature regarding methods ...

Isolated Lung Perfusion System in the Rabbit Model

The isolated lung perfusion system has been widely used in pulmonary research, contributing to elucidate the lungs&#39; inner workings, both micro and macroscopically. This technique is useful in the characterization of pulmonary physiology and pathology by measuring metabolic activities and respiratory functions, including interactions between circulatory substances and the effects of inhaled or perfused substances, as in drug testing. While in vitro methods involve the slicing and culturing of tissues, the isolated ex vivo lung perfusion system allows to work with a complete functional organ making possible the study of a continuous physiological function while recreating ventilation and perfusion. However, it should be noted that the effects of the absence of central innervation and lymphatic drainage still have to be fully assessed. This protocol aims to describe the assembly of the isolated lung apparatus, followed by the surgical extraction and cannulation of lungs and heart from experimental lab animals, as well as to display the perfusion technique and signal processing of data. The average viability of the isolated lung ranges between 5-8 h; during this period, the pulmonary capillary permeability increases, causing edema and lung injury. The functionality of preserved pulmonary tissue is measured by the capillary filtration coefficient (Kfc), used to determine the extent of pulmonary edema through time.

The isolated rabbit lung preparation is a gold standard tool in pulmonary research. This publication aims to describe the technique as developed for the study of physiological and pathological mechanisms involved in airway reactivity, lung preservation, and preclinical research in lung transplantation and pulmonary edema.

Sistema de perfusión pulmonar aislada en el modelo de conejo

The isolated lung perfusion system has been widely used in pulmonary research, contributing to elucidate the lungs&#39; inner workings, both micro and ...

Normothermic Negative Pressure Ventilation Ex Situ Lung Perfusion: Evaluation of Lung Function and Metabolism

Lung transplantation (LTx) remains the standard of care for end-stage lung disease. A shortage of suitable donor organs and concerns over donor organ quality exacerbated by excessive geographic transportation distance and stringent donor organ acceptance criteria pose limitations to current LTx efforts. Ex situ lung perfusion (ESLP) is an innovative technology that has shown promise in attenuating these limitations. The physiologic ventilation and perfusion of the lungs outside of the inflammatory milieu of the donor body affords ESLP several advantages over traditional cold static preservation (CSP). There is evidence that negative pressure ventilation (NPV) ESLP is superior to positive pressure ventilation (PPV) ESLP, with PPV inducing more significant ventilator-induced lung injury, pro-inflammatory cytokine production, pulmonary edema, and bullae formation. The NPV advantage is perhaps due to the homogenous distribution of intrathoracic pressure across the entire lung surface. The clinical safety and feasibility of a custom NPV-ESLP device have been demonstrated in a recent clinical trial involving extender criteria donor (ECD) human lungs. Herein, the use of this custom device is described in a juvenile porcine model of normothermic NPV-ESLP over a 12 h duration, paying particular attention to management techniques. Pre-surgical preparation, including ESLP software initialization, priming, and de-airing of the ESLP circuit, and the addition of anti-thrombotic, anti-microbial, and anti-inflammatory agents, is specified. The intraoperative techniques of central line insertion, lung biopsy, exsanguination, blood collection, cardiectomy, and pneumonectomy are described. Furthermore, particular focus is paid to anesthetic considerations, with anesthesia induction, maintenance, and dynamic modifications outlined. The protocol also specifies the custom device's initialization, maintenance, and termination of perfusion and ventilation. Dynamic organ management techniques, including alterations in ventilation and metabolic parameters to optimize organ function, are thoroughly described. Finally, the physiological and metabolic assessment of lung function is characterized and depicted in the representative results.

Normothermic Negative Pressure Ventilation Ex Situ Lung Perfusion: Evaluation of Lung Function and Metabolism

This paper describes a porcine model of negative pressure ventilation ex situ lung perfusion, including procurement, attachment, and management on the custom-made platform. Focus is made on anesthetic and surgical techniques, as well as troubleshooting.

Ventilación Normatérmica con Presión Negativa Perfusión Pulmonar Ex Situ : Evaluación de la Función Pulmonar y el Metabolismo

Lung transplantation (LTx) remains the standard of care for end-stage lung disease. A shortage of suitable donor organs and concerns over donor organ ...

A Model of Long-Term Ventricular Fibrillation in Isolated Rat Hearts

Ventricular fibrillation (VF) is a fatal arrhythmia with a high incidence in cardiac patients, but VF arrest under perfusion is a neglected method of intraoperative arrest in the field of cardiac surgery. With recent advances in cardiac surgery, the demand for prolonged VF studies under perfusion has increased. However, the field lacks simple, reliable, and reproducible animal models of chronic ventricular fibrillation. This protocol induces long-term VF through alternating current (AC) electrical stimulation of the epicardium. Different conditions were used to induce VF, including continuous stimulation with a low or high voltage to induce long-term VF and stimulation for 5 min with a low or high voltage to induce spontaneous long-term VF. The success rates of the different conditions, as well as the rates of myocardial injury and recovery of cardiac function, were compared. The results showed that continuous low-voltage stimulation induced long-term VF and that 5 min of low-voltage stimulation induced spontaneous long-term VF with mild myocardial injury and a high rate of recovery of cardiac function. However, the low-voltage, continuously stimulated long-term VF model had a higher success rate. High-voltage stimulation provided a higher rate of VF induction but showed a low defibrillation success rate, poor recovery of cardiac function, and severe myocardial injury. On the basis of these results, continuous low-voltage epicardial AC stimulation is recommended for its high success rate, stability, reliability, reproducibility, low impact on cardiac function, and mild myocardial injury.

This protocol presents a model of long-term ventricular fibrillation in rat hearts induced by continuous stimulation with low-voltage alternating current. This model has a high success rate, is stable, reliable, and reproducible, has a low impact on cardiac function, and causes only mild myocardial injury.

Un modelo de fibrilación ventricular a largo plazo en corazones de rata aislados

Ventricular fibrillation (VF) is a fatal arrhythmia with a high incidence in cardiac patients, but VF arrest under perfusion is a neglected method of ...

Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation

Heart transplantation is the most effective therapy for end-stage heart failure. Despite the improvements in therapeutic approaches and interventions, the number of heart failure patients waiting for transplantation is still increasing. The normothermic ex situ preservation technique has been established as a comparable method to the conventional static cold storage technique. The main advantage of this technique is that donor hearts can be preserved for up to 12 h in a physiologic condition. Moreover, this technique allows resuscitation of the donor hearts after circulatory death and applies required pharmacologic interventions to improve donor function after implantation. Numerous animal models have been established to improve normothermic ex situ preservation techniques and eliminate preservation-related complications. Although large animal models are easy to handle compared to small animal models, it is costly and challenging. We present a rat model of normothermic ex situ donor heart preservation followed by heterotopic abdominal transplantation. This model is relatively cheap and can be accomplished by a single experimenter.

Here, we present an assessment protocol of a heterotopically implanted heart after normothermic ex situ preservation in the rat model.

Modelo de rata de trasplante cardíaco heterotópico con perfusión ex-situ normotémica

Heart transplantation is the most effective therapy for end-stage heart failure. Despite the improvements in therapeutic approaches and interventions, the ...

<meta charset="utf8"></head><body>Avance del trasplante pulmonar con perfusión basada en polihHb en modelos EVLP de ratas

Exploring Alternative Perfusion Solutions Using Next-Generation Polymerized Hemoglobin-Based Oxygen Carriers in a Model of Rat Ex Vivo Lung Perfusion

Lung transplantation is hampered by the lack of suitable donors. Previously, donors that were thought to be marginal or inadequate were discarded. However, new and exciting technology, such as ex vivo lung perfusion (EVLP), offers lung transplant providers extended assessment for marginal donor allografts. This dynamic assessment platform has led to an increase in lung transplantation and has allowed providers to use donors that were previously discarded, thus expanding the donor pool. Current perfusion techniques use cellular or acellular perfusates, and both have distinct advantages and disadvantages. Perfusion composition is critical to maintaining a homeostatic environment, providing adequate metabolic support, decreasing inflammation and cellular death, and ultimately improving organ function. Perfusion solutions must contain sufficient protein concentration to maintain appropriate oncotic pressure. However, current perfusion solutions often lead to fluid extravasation through the pulmonary endothelium, resulting in inadvertent pulmonary edema and damage. Thus, it is necessary to develop novel perfusion solutions that prevent excessive damage while maintaining proper cellular homeostasis. Here, we describe the application of a polymerized human hemoglobin (PolyhHb)-based oxygen carrier as a perfusate and the protocol in which this perfusion solution can be tested in a model of rat EVLP. The goal of this study is to provide the lung transplant community with key information in designing and developing novel perfusion solutions, as well as the proper protocols to test them in clinically relevant translational transplant models.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Utilización de hemoglobina humana polimerizada de próxima generación para mejorar la evaluación y preservación del pulmón del donante en ratas

Here, we describe the application of a polymerized human hemoglobin (PolyhHb)-based oxygen carrier as a perfusate and the protocol in which this perfusion solution can be tested in a model of rat ex vivo lung perfusion.

Exploración de soluciones alternativas de perfusión utilizando portadores de oxígeno basados en hemoglobina polimerizada de próxima generación en un modelo de perfusión pulmonar ex vivo en ratas