Financial support from the Flanders Research Foundation FWO (contract n. 12C9112N to DL), the 7th Framework Programme of the European Commission (Marie Curie Network &#8220;C7&#8221;, contract n. 238214; ICT Future Emerging Technology &#8220;ENLIGHTENMENT&#8221; project, contract n. 306502), the Interuniversity Attraction Poles Program initiated by the Belgian Science Policy Office (contract n. IUAP-VII/20), and the University of Antwerp is kindly acknowledged.

El protocolo descrito aquí cumple con las recomendaciones y directrices de la Comisión de Ética del Departamento de Ciencias Biomédicas de la Universidad de Amberes. Este protocolo requiere la preparación de material no sensible desde el cerebro de ratas Wistar explantado juveniles, obtenido por técnicas de eutanasia humanitaria aprobados. 1. Preparación del equipo <ol><li> Instalar y configurar la adquisición de datos y sistema de estimulación. <ol><li> Utilice un ordenador personal (PC) equipado con una adquisición de datos (DAQ) tarjeta apoyado por Comedi para grabar y enviar señales de voltajes de control analógicos al amplificador electrofisiológico. NOTA: Comedi es un módulo de Linux y la biblioteca que soporta una gran cantidad de tarjetas DAQ de los fabricantes más comunes: visite http://www.comedi.org para más información. </li><li> En el caso de un amplificador de patch clamp controlado por ordenador está en uso, emplear un segundo PC, además de la dedicada al amplificadorcontrol. NOTA: Si bien este último puede ejecutar un sistema operativo convencional, el PC adicional será operativo en tiempo real por medio de un sistema operativo especial. En estas condiciones, es conveniente utilizar un solo monitor, ratón y teclado conectado a la PC adicional, mientras se conecta por una aplicación de escritorio remoto a la PC dedicado. </li><li> Descargue la imagen ISO del Live CD que contiene un sistema operativo Linux en tiempo real con LCG preinstalado de http://www.tnb.ua.ac.be/software/LCG_Live_CD.iso y grabarlo en un CD o memoria USB en blanco &quot; . </li><li> Basta con insertar el CD en la unidad de la PC que contiene la tarjeta de adquisición de datos y ponerlo en marcha. Alternativamente, instale LCG desde su repositorio de fuentes en línea en un PC con el sistema operativo Linux (por ejemplo, Debian o Ubuntu). Consulte el manual en línea para obtener detalles sobre el procedimiento de instalación. El manual está disponible en línea en http://danielelinaro.github.io/dynclamp/lcg_manual.pdf. </li><li> Arrancar desde el CD en vivo: this se cargará automáticamente un sistema totalmente configurado. Para ello, coloque el Live CD LCG en la unidad de CD-ROM del equipo e inicie el ordenador desde el CD; seleccionar el kernel de tiempo real (opción por defecto) tan pronto como aparezca el menú de inicio y esperar a que el sistema se inicie. </li><li> Calibrar la tarjeta de adquisición de datos escribiendo en el símbolo del sistema: sudo comedi_calibrate o sudo comedi_soft_calibrate dependiendo de si la placa de adquisición de datos compatible con el hardware o software de calibración, respectivamente (utilice el comando sudo comedi_board_info para obtener información sobre el tablero). </li><li> Ajuste el analógico-digital y digital-analógico factores de conversión apropiado: esto requiere tener acceso al manual del amplificador electrofisiológico celular, y en particular a sus especificaciones en sus factores de conversión. </li><li> Utilice un editor de texto para especificar los valores numéricos correspondientes en el /home/user/.lcg-env archivo, por las variables de entorno AI_CONVERSION_FACTOR_CC, AI_CONVERSION_FACTOR_VC, AO_CONVERSION_FACTOR_CC, AO_CONVERSION_FACTOR_VC. NOTA: Estos representan la entrada (AI) y de salida (AO) ganancias para pinza de corriente (CC) y la fijación de voltaje (VC) modos, y los factores de conversión entre los comandos de voltaje que proporciona el equipo y la corriente o tensiones generadas por el amplificador , respectivamente. </li><li> Como alternativa, utilice el script LCG proporcionado (DE FIND-conversión-factores LCG), para encontrar los factores de conversión de su sistema. NOTA: Los valores calculados por lcg-encuentra-conversión-factores son conjeturas, que en algunos casos se requieren para ser numéricamente truncado o redondeadas para reflejar los valores exactos de los factores de conversión. </li><li> Para utilizar lcg-find-conversión-factores, comience por la conexión de la &#39;célula de modelo &quot;que a menudo se compra con el amplificador con el cabezal de la platina correspondiente. A continuación, abra un terminal en la máquina Linux en el que está ejecutando el Live CD e introduzca el siguiente comando en el intérprete de comandos: lcg-encontrar-conversión-factores -i $ HOME / .lcg-env -o $ HOME / .lcg-env NOTA: En ambos casos (es decir, la modificación manual de /home/user/.lcg-env o uso de LCG-find-conversión-factores), cerrar y abrir el terminal para que los cambios surtan efecto. </li><li> Si se utilizan varios cabezales, establecer los factores de conversión a los mismos valores en todos los canales; si eso no es posible, consulte el manual en línea LCG a entender cómo usar múltiples factores de conversión en lcg-estímulo o cómo producir archivos de configuración que mejor se adapten a las necesidades del usuario. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de aguda rebanadas de cerebro de la corteza somatosensorial <ol><li> Preparación de soluciones para electrofisiología. <ol><li> Preparar Fluid Artificial Cerebro-espinal (ACSF) mezclando (en mM) 125 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 25 glucosa, 2 CaCl 2, y 1 de MgCl 2. Preparar 10x soluciones madre para reducir eltiempo de preparación en el día del experimento. Preparar 2 L, de los cuales uno se utilizarán para la preparación de las rodajas y el otro para la grabación. </li><li> Saturar la ACSF con 95% O 2 y 5% de CO 2 durante al menos 30 min antes del comienzo del procedimiento. </li><li> Para clamp grabaciones actuales, utilice una solución intracelular (ICS) que contiene (en mM) 115 K-gluconato, 20 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, Na 0,3 2 -GTP, 10 Na 2 -phosphocreatine. Preparar la solución en hielo y filtrar antes del comienzo de las grabaciones para eliminar el riesgo de obstrucción de la pipeta. </li></ol></li><li> Extracción del cerebro. <ol><li> Anestesiar al animal de colocar al animal en una cámara de inducción con 4% de isoflurano y rápidamente decapitar usando una guillotina o grandes tijeras. </li><li> Cortar la piel a lo largo de la línea media y deslícelo a los oídos. </li><li> El uso de un buen par de tijeras de cortar el cráneo a lo largo de la línea media. Mantenga la cuchilla lo más cerca posible a the superficie con el fin de minimizar el daño al cerebro subyacente. Abra el cráneo con un par de pinzas, use una espátula para cortar el nervio óptico y el tronco cerebral y suavemente caer el cerebro en ACSF helada. </li><li> Separar el cerebelo y los dos hemisferios con un bisturí (hoja de 24). </li><li> Retire el exceso de agua de uno de los dos hemisferios y péguelo en una plataforma inclinada utilizando una gota de pegamento. Añadir rápidamente unas pocas gotas de ACSF sobre el cerebro y la transfiere a la cámara de vibratome. NOTA: En la preparación de cortes sagitales, el ángulo de la plataforma es importante para evitar daños en las dendritas de células piramidales durante el procedimiento de corte. </li></ol></li><li> Preparación de las rebanadas. <ol><li> Coloque la cuchilla sobre el cerebro y deseche la primera 2,5-3 mm. Ajustar la velocidad y la frecuencia para limitar los daños a la superficie de la rebanada mientras que al mismo tiempo reducir al mínimo el tiempo requerido para el procedimiento de corte. </li><li> Ajuste el espesor de 300 μm y comenzar el corte en lonchas. Una vez que la cuchilla ha ido más allá de la corteza, utilizar una hoja de afeitar o una aguja doblada para cortar por encima de la hipocampo y en los bordes de la zona cortical de interés. </li><li> Coloque las rodajas en una cámara de incubación de múltiples pozos mantienen a 32-34 ° C. </li><li> Retirar la hoja y repetir los puntos 2.3.2 y 2.3.3 hasta 5 - se cortan 8 rebanadas. Los mejores rodajas son generalmente aquellos en los que los vasos sanguíneos son paralelas a la superficie. </li><li> Incubar las rebanadas de 30 min después de la última rebanada se coloca en la cámara. </li></ol></li></ol> 3. patch-clamp grabaciones de Capa 5 piramidales Neuronas <ol><li> Coloca una rebanada en la cámara de la grabación y la búsqueda de las células sanas. Estas células generalmente tienen menor contraste, un aspecto liso y no están hinchados. </li><li> Inspeccionar la rebanada bajo el microscopio con la lente de aumento de 40X y la búsqueda de células en la capa 5, que se encuentra aproximadamente 600 a 1000 micras desde la superficie del cerebro. </li&gt; <li> Una vez que se encuentra una célula adecuada, la carga de un tercio de la micropipeta con ICS y colocarlo en el cabezal de la platina. </li><li> En el ordenador personal que ejecuta el Live CD o el sistema operativo preconfigurado Linux, lanzar un shell de comandos (por ejemplo, bash) y en su sistema, escriba el comando lcg-cero. Esto asegura que la tarjeta DAQ no está conduciendo el amplificador. </li><li> Aplicar 30 - 50 mbar de presión positiva presionando sobre el émbolo de una jeringa común, conectada por un tubo a la titular de la pipeta y, con la ayuda del microscopio, coloque la pipeta aproximadamente 100 m por encima de la rebanada. NOTA: Colocar la pipeta en una posición que permite una ruta directa a la célula diana, preferiblemente utilizando el modo de enfoque de la micromanipulador. </li><li> Actuando sobre los controles del amplificador electrofisiología, ajustar el desplazamiento de la pipeta y la salida de un impulso de prueba (10 mV) en el modo de fijación de voltaje. </li><li> Reducir la presión a 10 a 30 mbar (dependiendo del tamaño de la pipeta) mediante la retirada de lapistón de la jeringa; acercarse suavemente la célula y comprobar para la formación de un hoyuelo mediante la observación de la imagen en la pantalla de la cámara de vídeo. Supervisar el impulso de prueba para un aumento de la resistencia en todo momento, al ver la forma de onda mostrada en el osciloscopio conectado al amplificador de electrofisiología (alternativamente se puede utilizar el lcg-seal-test de comandos para controlar la resistencia de la pipeta). </li><li> Suelte la presión y si es necesario aplicar presión negativa suave a la pipeta para ayudar a la formación de sello cuando usted nota un aumento en la resistencia de la pipeta y la formación de un &quot;hoyuelo&quot; en la celda. </li><li> Mientras que las formas de foca, disminuir gradualmente el potencial de mantenimiento de -70 mV. </li><li> Una vez que se ha obtenido un sello gigaohmio, asegúrese de que la corriente de mantenimiento es de entre 0 - 30 pA. Aplicar pulsos cortos de presión negativa (succión) para romper la membrana y establecer la configuración de célula completa. Alternativamente, se puede inyectar impulsos fuertes y breves de tensión ( <em&gt; es decir, utilizando el comando &#39;ZAP&#39; en el amplificador o la celebración de la célula en muy negativo) para romper la membrana, dependiendo de la pipeta preparación y vidrio utilizado. </li><li> Cambiar a modo de pinza de corriente y verifique que el potencial de membrana en reposo es típico de una célula sana. Para las neuronas piramidales corticales utilizando una solución basada potasio-gluconato-, este valor es por lo general entre -65 y -75 mV. </li></ol> 4. Caracterización semiautomática de Propiedades respuesta eléctrica de una neurona <ol><li> Crear un directorio para almacenar los datos del usuario. Con el fin de hacer esto al servicio de un script incluido en el LCG vivo CD que crea carpetas según la fecha. Para utilizarlo, escriba en el símbolo del sistema cd ~ / experimentos lcg-crear-experimento de la carpeta -s psp, in_vivo_like Esto creará una carpeta donde se guardarán los datos de esa célula (y un &#39;psp&#39; y &#39;in_vivo_like&#39; subcarpetas) y se imprimirá su nombre a la terminalventana; También es posible almacenar información adicional, como la resistencia de la pipeta y el tipo de células usando este script. </li><li> Cambie el directorio a la carpeta recién creada con el comando cd ~ / &lt;carpeta&gt; El nombre de la carpeta es la que muestra el comando lcg-create-experimento de la carpeta y contará con la indicación de la hora del día actual (es decir, el año-mes-día), como en 20140331A01. </li><li> Asegúrese de que el amplificador está configurado para funcionar en modo de pinza de corriente, de que los cables están conectados y el comando de tensión externa del amplificador, si está presente, está habilitada. </li><li> Introduzca el comando lcg-ecodeat el símbolo del sistema. Esto requiere una serie de comandos (es decir, lcg-ap, lcg-vi, lcg-rampa, lcg-tau y LCG-pasos), que se utiliza para caracterizar las propiedades de respuesta básicas de la célula. lcg-ECODE requiere que el usuario especifique dos parámetros: la amplitud de la 1 ms-largo pulso de corriente utilizada para obtener un solo pico en la célula, y la amplitud máxima de la memoria RAM actualp inyecta en la célula para encontrar su reobase. Utilice la siguiente sintaxis del comando: lcg-ECODE --pulse amplitud X --ramp amplitud Y con una elección de los valores X e Y (en Pa) que son suficientes para hacer que el fuego celular en respuesta a un 1 ms-pulso largo y una inyección sostenida de corriente, respectivamente. NOTA: Estos protocolos requieren realizar la estimación numérica de la &#39;kernel electrodo&#39; con el fin de utilizar la Compensación del electrodo activo (AEC) 15. Una inyección de corriente ruidosa se utiliza para estimar el núcleo y se pide al usuario que confirme el número de muestras que componen el núcleo. Ver 15 para obtener información detallada sobre el significado del núcleo del electrodo y la forma de elegir el número de muestras del núcleo. </li></ol> 5. La inyección de conductancia a través simulados sinapsis y Simulación de En Vivo -como Antecedentes Actividad <ol><li> La inyección de los potenciales postsinápticos excitatorios simulados <ol><li>Cambie al directorio en el que se ahorrará el siguiente experimento, escribiendo el comando siguiente en el símbolo del sistema del shell: psp cd / 01 </li><li> Copiar un archivo de configuración LCG al directorio actual y abrirlo con un editor de texto (Nano en este ejemplo), escriba los siguientes comandos en el símbolo del sistema del shell (este archivo de configuración ejemplo se incluye en el código fuente y el live cd) : cp ~ / local / src / lcg / configuraciones / epsp.xml nano epsp.xml NOTA: Esto es simplemente un archivo de texto con diferentes entidades conectadas entre sí. Para más detalles ver la sección de Resultados Representante. </li><li> Si es necesario editar el inputChannel, outputChannel, el inputConversionFactor y la outputConversionFactor en este archivo para que coincida con la configuración del usuario. </li><li> Calcule el núcleo del electrodo necesario para realizar la compensación de electrodo activo &#39;el método utilizado por LCG para realizar solo electrodo pinza dinámica &quot;mediante la emisión de la command lcg-kernel Esto le pedirá el número de puntos en el kernel. Una vez más, seleccione un número para que el núcleo del electrodo cubre el extremo de la cola de decaimiento exponencial. </li><li> Lleve a cabo el experimento de pinza dinámico utilizando el comando lcg-experimentar epsp.xml -c </li><li> Enumerar los archivos y visualizar los resultados utilizando el comando ls -l lcg-trama-archivo -f última </li></ol></li><li> La inyección de los potenciales postsinápticos inhibitorios simulados <ol><li> Crear una carpeta y copiar el archivo epsp.xml a él escribiendo los siguientes comandos en el símbolo del sistema del shell: mkdir ../02 cp epsp.xml ../02/ipsp.xml cd ../02 </li><li> Edite el archivo de configuración con un editor de texto: cambiar el potencial de inversión sináptica y subir y tiempo de decaimiento constantes del Exp2Synapse modelo de sinapsis a lo siguiente: parámetros&gt; &lt;E&gt; -80 &lt;/ E&gt; &lt;TauRise&gt; 0.8e-3 &lt;/ tauRise&gt; &lt;TauDecay&gt; 10e-3 &lt;/ tauDecay&gt; &lt;parámetros&gt; Salga del editor de texto. </li><li> Calcule el núcleo del electrodo y llevar a cabo el experimento como en 5.1, escribiendo los siguientes comandos en el símbolo del sistema del shell: lcg-kernel lcg-experimentar ipsp.xml -c </li><li> Enumerar los archivos y visualizar los resultados, escribiendo los siguientes comandos en el símbolo del sistema del shell: ls -l lcg-trama-archivo -f &lt;filename.h5&gt; </li></ol></li><li> Simulación de in vivo -como actividad de fondo: <ol><li> Cambie al directorio en el que desea guardar el siguiente experimento, como se indica anteriormente, escribiendo los siguientes comandos en el símbolo del sistema del shell: cd ../../in_vivo_like/01 </li><li> Copie el archivo de configuración del directorio de origen LCG, escribiendo los siguientes comandos en el símbolo del sistema del shell: cp ~ / local / src / lcg / configuraciones / in_vivo_like.xml nano in_vivo_like.xml <br /&gt; NOTA: Este archivo es simplemente la concatenación de los anteriores; dos procesos de Poisson puntos que generan espiga trenes, que a su vez alimentan inhibitorias y excitatorias sinapsis modelo, generan la actividad de fondo. </li><li> Ajustar los parámetros de configuración DAQ para la configuración del usuario, como se describe en 5.1.3 y salga del editor. </li><li> Calcule el núcleo del electrodo y llevar a cabo el experimento como en 5.1, escribiendo los siguientes comandos en el símbolo del sistema del shell: lcg-kernel lcg-experimentar in_vivo_like.xml -c -n 10 -i 3 Los interruptores &#39;-n 10&#39; y &#39;3&#39; -i indican que la estimulación se debe repetir 10 veces a intervalos de tres segundos. </li><li> Visualice las huellas primas mediante el comando siguiente en el símbolo del sistema del shell: lcg-trama-archivo -f todo </li></ol></li></ol>

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K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+bursts+self-inhibit+and+correlate+the+pyramidal+network.">Brief bursts self-inhibit and correlate the pyramidal network.</a> PLoS biology. 8 (9), (2010).</li><li>Tsodyks, M., Pawelzik, K., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+networks+with+dynamic+synapses.">Neural networks with dynamic synapses.</a> Neural computation. 10 (4), 821-835 (1998).</li><li>Kapfer, C., Glickfeld, L. L., Atallah, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supralinear+increase+of+recurrent+inhibition+during+sparse+activity+in+the+somatosensory+cortex.">Supralinear increase of recurrent inhibition during sparse activity in the somatosensory cortex.</a> Nature. 10 (6), 743-753 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

En este texto un protocolo completo para la aplicación de tiempo real, de circuito cerrado unicelulares experimentos electrofisiológicos fue descrito, utilizando la técnica de patch clamp y una caja de herramientas de software desarrollado recientemente llamado LCG. Para optimizar la calidad de las grabaciones es crucial que la configuración de la grabación sea correctamente conectado a tierra, protegido y libre de vibraciones: esto garantiza el acceso de células enteras estable y duradera de la célula, lo que, j...

<html> En los últimos años, la electrofisiología celular ha evolucionado desde el paradigma tradicional de bucle abierto empleado en los experimentos de tensión y corriente a los protocolos de fijación de bucle cerrado modernos. La técnica de circuito cerrado más conocido es quizás la pinza dinámica 6,7, lo que permitió la inyección sintética de los canales iónicos dependientes de voltaje artificiales para determinar el voltaje de la membrana neuronal 8, el estudio en profundidad de los efectos de la no-determinista parpadeo en canales iónicos en la dinámica de respuesta neuronal 9, así como la recreación in vitro de realistas en Vivo- como actividad de fondo sináptica 10. Otros paradigmas de circuito cerrado que se han propuesto incluyen la abrazadera reactiva 11, para estudiar in vitro la generación de actividad persistente autosostenida, y la respuesta sujetar 4,12, para investigar los mecanismos celulares excitabilidad neuronal subyacente. ONTENIDO &quot;&gt; Aquí se describe un potente marco que permite la aplicación de una variedad de protocolos electrofisiológicos de bucle cerrado en el contexto de grabaciones de patch clamp de células enteras realizadas en rodajas de cerebro agudas. Mostramos cómo grabar voltaje de la membrana somática por medio de grabaciones de patch clamp en las neuronas piramidales de la corteza somatosensorial de ratas jóvenes y aplicar tres protocolos de bucle cerrado diferentes utilizando LCG, una caja de herramientas de software basado en línea de comandos desarrollado en el laboratorio de Neurobiología y Teórica Neuroingeniería. En pocas palabras, los protocolos descritos son, en primer lugar de la inyección automática de una serie de formas de onda de estímulo pinza actuales, relevantes para la caracterización de un gran conjunto de propiedades de la membrana activa y pasiva. Estos se han sugerido para capturar el fenotipo electrofisiológico de una célula en términos de sus propiedades de respuesta a una serie de patrón de formas de onda de estímulo. Conocido como el código e de una célula (por ejemplo, ver &amp; #160; 13,14), una colección de respuestas eléctricas tales es utilizado por varios laboratorios para clasificar objetivamente neuronas sobre la base de sus propiedades eléctricas. Esto incluye el análisis de la relación de transferencia estacionaria de entrada-salida (curva fI), por una técnica innovadora que implica la de lazo cerrado, el control en tiempo real del tipo de cocción por medio de un controlador proporcional-integral-derivativo (PID) , segundo la recreación de realista vivo -como la actividad sináptica en el fondo en preparaciones in vitro 10 y tercero, la conexión artificial en tiempo real de dos neuronas piramidales registradas simultáneamente por medio de un interneuron virtual GABAérgicas, que se simula por el ordenador. Además, LCG implementa la técnica conocida como activo de electrodo de Compensación (AEC) 15, que permite la aplicación de protocolos de sujeción dinámicos utilizando un solo electrodo. Esto permite compensar los efectos no deseados (unartifacts) del electrodo de registro que surgen cuando se usa para la entrega de estímulos intracelulares. El método se basa en una estimación no paramétrica de las propiedades eléctricas equivalentes del circuito de grabación. Las técnicas y los protocolos experimentales descritas en el presente documento pueden aplicarse fácilmente en el voltaje de circuito abierto convencional y experimentos corriente con la pinza y se puede extender a otras preparaciones, como extracelular 4,16 o grabaciones intracelulares in vivo 17,18. El montaje cuidadoso de la configuración de la electrofisiología de pinzamiento zonal de célula completa es un paso muy importante para, grabaciones estables de alta calidad. En lo que sigue se supone que una instalación como experimental ya está disponible para el experimentador, y centramos nuestra atención en describir el uso de LCG. El lector se refirió a 19-22 para obtener consejos adicionales acerca de la optimización y depuración.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT-1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td>1.5/0.84 mm OD/ID, with filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>TMC</td>
			<td>20 Series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMLFS</td>
			<td>40X Immersion Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulators</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>PatchStar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifiers</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>MultiClamp 700B</td>
			<td>Computer controlled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PCI-6229</td>
			<td>Supported by Comedi Linux Drivers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Optiplex 7010 Tower</td>
			<td>OS: real-time Linux</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscopes</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Pump</td>
			<td>Gibson</td>
			<td>MINIPULS3</td>
			<td>Used with R4 Pump head (F117606)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Multichannel Systems</td>
			<td>TC02</td>
			<td>PH01 Perfusion Cannula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manometer</td>
			<td>Testo</td>
			<td>510</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WB14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>ACSF, ICS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3139</td>
			<td>ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td>ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016</td>
			<td>ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td>ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-Gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4500</td>
			<td>ICS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>ICS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td>ICS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2-GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51120</td>
			<td>ICS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2-Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7936</td>
			<td>ICS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time electrophysiology: using closed-loop protocols to probe neuronal dynamics and beyond

Neurociencia experimental está siendo testigo de un creciente interés en el desarrollo y aplicación de la novela y, protocolos de circuito cerrado a menudo complejas, donde el estímulo aplicado depende, en tiempo real sobre la respuesta del sistema. Aplicaciones recientes van desde la implementación de sistemas de realidad virtual para el estudio de las respuestas motoras, tanto en ratones 1 y 2 en el pez cebra, para controlar de convulsiones después del accidente cerebrovascular cortical utilizando optogenética 3. Una ventaja clave de las técnicas de bucle cerrado reside en la capacidad de sondeo propiedades dimensionales superiores que no son directamente accesibles o que dependen de múltiples variables, como la excitabilidad neuronal 4 y fiabilidad, mientras que al mismo tiempo, maximizar el rendimiento experimental. En esta contribución y en el contexto de la electrofisiología celular, se describe cómo aplicar una variedad de protocolos de bucle cerrado para el estudio de las propiedades de respuesta de las neuronas corticales piramidal, recorded intracelularmente con la técnica de patch clamp en rodajas de cerebro agudas de la corteza somatosensorial de ratas jóvenes. Como ningún software de código abierto disponibles comercialmente o proporciona todas las características necesarias para llevar a cabo de manera eficiente los experimentos descritos aquí, una nueva caja de herramientas de software llamado LCG 5 fue desarrollado, cuya estructura modular maximiza la reutilización de código informático y facilita la implementación de nuevos paradigmas experimentales. Formas de onda de estimulación se especifican mediante un pacto meta-descripción y protocolos experimentales completos se describen en los archivos de configuración basados ​​en texto. Además, LCG tiene una interfaz de línea de comandos que es adecuado para la repetición de los ensayos y la automatización de los protocolos experimentales.

En las secciones anteriores, hemos descrito cómo utilizar la caja de herramientas de software LCG para caracterizar las propiedades electrofisiológicas de las células piramidales L5 y recrear en vivo -como la actividad sináptica en una rebanada preparación. El uso de una interfaz de línea de comandos y el protocolo semi-automatizado favorece la reproducibilidad y la eficiencia del experimento, que puede tener un gran impacto sobre la producción y la calidad de los datos producidos. Además, dado que los ...

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Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board.

En tiempo real Electrofisiología: Usando protocolos de bucle cerrado para sondear neuronales Dinámica y allá

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where ...

real-time-electrophysiology-using-closed-loop-protocols-to-probe

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.3K vistas.  University of Antwerp. Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board. 

Video: Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

An Experimental Platform to Study the Closed-loop Performance of Brain-machine Interfaces

The non-stationary nature and variability of neuronal signals is a fundamental problem in brain-machine interfacing. We developed a brain-machine interface to assess the robustness of different control-laws applied to a closed-loop image stabilization task. Taking advantage of the well-characterized fly visuomotor pathway we record the electrical activity from an identified, motion-sensitive neuron, H1, to control the yaw rotation of a two-wheeled robot. The robot is equipped with 2 high-speed video cameras providing visual motion input to a fly placed in front of 2 CRT computer monitors. The activity of the H1 neuron indicates the direction and relative speed of the robot's rotation. The neural activity is filtered and fed back into the steering system of the robot by means of proportional and proportional/adaptive control. Our goal is to test and optimize the performance of various control laws under closed-loop conditions for a broader application also in other brain machine interfaces.

We use a closed-loop fly-machine interface to investigate general principles in neuronal control.

Una plataforma experimental para estudiar el comportamiento de circuito cerrado de interfaces cerebro-máquina

The non-stationary nature and variability of neuronal signals is a fundamental problem in brain-machine interfacing. We developed a brain-machine ...

Investigación

Neurociencias

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Electrodos múltiples grabaciones matriz de avalanchas neuronal en cultivos organotípicos

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

Electroencefalografía simultánea, en tiempo real Medición de la concentración de lactato y Manipulación optogenético de la actividad neuronal en la corteza cerebral de roedores

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Real-Time Impedance-based Cell Analyzer as a Tool to Delineate Molecular Pathways Involved in Neurotoxicity and Neuroprotection in a Neuronal Cell Line

Many brain-related disorders have neuronal cell death involved in their pathophysiology. Improved in vitro models to study neuroprotective or neurotoxic effects of drugs and downstream pathways involved would help gain insight into the molecular mechanisms of neuroprotection/neurotoxicity and could potentially facilitate drug development. However, many existing in vitro toxicity assays have major limitations &#8211; most assess neurotoxicity and neuroprotection at a single time point, not allowing to observe the time-course and kinetics of the effect. Furthermore, the opportunity to collect information about downstream signaling pathways involved in neuroprotection in real-time would be of great importance. In the current protocol we describe the use of a real-time impedance-based cell analyzer to determine neuroprotective effects of serotonin 2A (5-HT2A) receptor agonists in a neuronal cell line under label-free and real-time conditions using impedance measurements. Furthermore, we demonstrate that inhibitors of second messenger pathways can be used to delineate downstream molecules involved in the neuroprotective effect. We also describe the utility of this technique to determine whether an effect on cell proliferation contributes to an observed neuroprotective effect. The system utilizes special microelectronic plates referred to as E-Plates which contain alternating gold microelectrode arrays on the bottom surface of the wells, serving as cell sensors. The impedance readout is modified by the number of adherent cells, cell viability, morphology, and adhesion. A dimensionless parameter called Cell Index is derived from the electrical impedance measurements and is used to represent the cell status. Overall, the real-time impedance-based cell analyzer allows for real-time, label-free assessment of neuroprotection and neurotoxicity, and the evaluation of second messenger pathways involvement, contributing to more detailed and high-throughput assessment of potential neuroprotective compounds in vitro, for selecting therapeutic candidates.

Improved in vitro neurotoxicity assays would aid the identification of new neuroprotective compounds. The utility of a real-time impedance-based cell analyzer to determine cytotoxicity and cytoprotection in neuronal cell lines and to delineate the involvement of second messenger pathways, thus gaining insight in the mechanism of neuroprotection is presented.

Cell Analyzer basados ​​en impedancia Real-Time como una herramienta para delinear vías moleculares implicadas en la neurotoxicidad y neuroprotección en una línea celular neuronal

Many brain-related disorders have neuronal cell death involved in their pathophysiology. Improved in vitro models to study neuroprotective or neurotoxic ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation of a given stimulus might be dependent on context and history. If this is actually the case, bi-directional interactions between the brain (or if need be a reduced model of it) and sensory-motor system can shed a light on how encoding and decoding of information is performed. Here an experimental system is introduced and described in which the activity of a neuronal element (i.e., a network of neurons extracted from embryonic mammalian hippocampi) is given context and used to control the movement of an artificial agent, while environmental information is fed back to the culture as a sequence of electrical stimuli. This architecture allows a quick selection of diverse encoding, decoding, and learning algorithms to test different hypotheses on the computational properties of neuronal networks.

In this paper, an experimental framework to perform closed-loop experiments is presented, in which information processing (i.e., coding and decoding) and learning of neuronal assemblies are studied during the continuous interaction with a robotic body.

Experimentos Neuro-robótica de circuito cerrado para comprobar propiedades computacionales de Redes Neuronales

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

La incubación prolongado de aguda neuronal de tejidos para la Sección de Electrofisiología y calcio de imágenes

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Using Neuron Spiking Activity to Trigger Closed-Loop Stimuli in Neurophysiological Experiments

Closed-loop neurophysiological systems use patterns of neuronal activity to trigger stimuli, which in turn affect brain activity. Such closed-loop systems are already found in clinical applications, and are important tools for basic brain research. A particularly interesting recent development is the integration of closed-loop approaches with optogenetics, such that specific patterns of neuronal activity can trigger optical stimulation of selected neuronal groups. However, setting up an electrophysiological system for closed-loop experiments can be difficult. Here, a ready-to-apply Matlab code is provided for triggering stimuli based on the activity of single or multiple neurons. This sample code can be easily modified based on individual needs. For instance, it shows how to trigger sound stimuli and how to change it to trigger an external device connected to a PC serial port. The presented protocol is designed to work with a popular neuronal recording system for animal studies (Neuralynx). The implementation of closed-loop stimulation is demonstrated in an awake rat.

This protocol demonstrates how to use an electrophysiological system for closed-loop stimulation triggered by neuronal activity patterns. Sample Matlab code that can be easily modified for different stimulation devices is also provided.

Uso de la actividad de spiking de neuronas para desencadenar estímulos de bucle cerrado en experimentos neurofisiológicos

Closed-loop neurophysiological systems use patterns of neuronal activity to trigger stimuli, which in turn affect brain activity. Such closed-loop systems ...

Open-Source Real-Time Closed-Loop Electrical Threshold Tracking for Translational Pain Research

Nociceptors are a class of primary afferent neurons that signal potentially harmful noxious stimuli. An increase in nociceptor excitability occurs in acute and chronic pain conditions. This produces abnormal ongoing activity or reduced activation thresholds to noxious stimuli. Identifying the cause of this increased excitability is required for the development and validation of mechanism-based treatments. Single-neuron electrical threshold tracking can quantify nociceptor excitability. Therefore, we have developed an application to allow such measurements and demonstrate its use in humans and rodents. APTrack provides real-time data visualization and action potential identification using a temporal raster plot. Algorithms detect action potentials by threshold crossing and monitor their latency after electrical stimulation. The plugin then modulates the electrical stimulation amplitude using an up-down method to estimate the electrical threshold of the nociceptors. The software was built upon the Open Ephys system (V0.54) and coded in C++ using the JUCE framework. It runs on Windows, Linux, and Mac operating systems. The open-source code is available (<a data-saferedirecturl="https://www.google.com/url?q=https://github.com/Microneurography/APTrack&amp;source=gmail&amp;ust=1680789829274000&amp;usg=AOvVaw0nMk9J_EI2jUn8SlmC5JJm" href="https://github.com/Microneurography/APTrack" target="_blank">https://github.com/Microneurography/APTrack</a>). The electrophysiological recordings were taken from nociceptors in both a mouse skin-nerve preparation using the teased fiber method in the saphenous nerve and in healthy human volunteers using microneurography in the superficial peroneal nerve. Nociceptors were classified by their response to thermal and mechanical stimuli, as well as by monitoring the activity-dependent slowing of the conduction velocity. The software facilitated the experiment by simplifying the action potential identification through the temporal raster plot. We demonstrate real-time closed-loop electrical threshold tracking of single-neuron action potentials during&#160;in vivo&#160;human microneurography, for the first time, and during&#160;ex vivo&#160;mouse electrophysiological recordings of C-fibers and A&#948;-fibers. We establish proof of principle by showing that the electrical threshold of a human heat-sensitive C-fiber nociceptor is reduced by heating the receptive field. This plugin enables the electrical threshold tracking of single-neuron action potentials and allows the quantification of changes in nociceptor excitability.

APTrack is a software plugin developed for the Open Ephys platform that enables real-time data visualization and the closed-loop electrical threshold tracking of neuronal action potentials. We have successfully used this in microneurography for human C-fiber nociceptors and mouse C-fiber and A&#948;-fiber nociceptors.

Seguimiento de umbral eléctrico de circuito cerrado en tiempo real de código abierto para la investigación traslacional del dolor

Nociceptors are a class of primary afferent neurons that signal potentially harmful noxious stimuli. An increase in nociceptor excitability occurs in ...

Estimulación cerebral profunda para el tratamiento de la depresión mayor

Closed-Loop Neurostimulation for Biomarker-Driven, Personalized Treatment of Major Depressive Disorder

Deep brain stimulation involves the administration of electrical stimulation to targeted brain regions for therapeutic benefit. In the context of major depressive disorder (MDD), most studies to date have administered continuous or open-loop stimulation with promising but mixed results. One factor contributing to these mixed results may stem from when the stimulation is applied. Stimulation administration specific to high-symptom states in a personalized and responsive manner may be more effective at reducing symptoms compared to continuous stimulation and may avoid diminished therapeutic effects related to habituation. Additionally, a lower total duration of stimulation per day is advantageous for reducing device energy consumption. This protocol describes an experimental workflow using a chronically implanted neurostimulation device to achieve closed-loop stimulation for individuals with treatment-refractory MDD. This paradigm hinges on determining a patient-specific neural biomarker that is related to states of high symptoms and programming the device detectors, such that stimulation is triggered by this read-out of symptom state. The described procedures include how to obtain neural recordings concurrent with patient symptom reports, how to use these data in a state-space model approach to differentiate low- and high-symptom states and corresponding neural features, and how to subsequently program and tune the device to deliver closed-loop stimulation therapy.

Autor destacado: Beneficio terapéutico de la estimulación cerebral profunda de circuito cerrado en el tratamiento de la depresión 

Deep brain stimulation triggered by a patient-specific neural biomarker of a high-symptom state may better control symptoms of major depressive disorder compared to continuous, open-loop stimulation. This protocol provides a workflow for identifying a patient-specific neural biomarker and controlling the delivery of therapeutic stimulation based on the identified biomarker.

Neuroestimulación de circuito cerrado para el tratamiento personalizado del trastorno depresivo mayor basado en biomarcadores

Deep brain stimulation involves the administration of electrical stimulation to targeted brain regions for therapeutic benefit. In the context of major ...