Financial support from the Flanders Research Foundation FWO (contract n. 12C9112N to DL), the 7th Framework Programme of the European Commission (Marie Curie Network &#8220;C7&#8221;, contract n. 238214; ICT Future Emerging Technology &#8220;ENLIGHTENMENT&#8221; project, contract n. 306502), the Interuniversity Attraction Poles Program initiated by the Belgian Science Policy Office (contract n. IUAP-VII/20), and the University of Antwerp is kindly acknowledged.

Burada açıklanan protokol önerileri ve Anvers Üniversitesi Biyomedikal Bilimleri Bölümü Etik Kurul kurallarına uygundur. Bu protokol onaylı insani ötenazi teknikleri ile elde edilen genç Wistar sıçanların eksplante beyin, olmayan bilinçli malzemenin hazırlanmasını gerektirir. 1. Ekipman Hazırlığı <ol><li> Yükleme ve veri toplama ve stimülasyon sistemi yapılandırmak. <ol><li> Sinyalleri kaydetmek ve elektrofizyolojik amplifikatöre analog kontrol voltajlarını göndermek için comedi tarafından desteklenen bir veri toplama (DAQ) kartı ile donatılmış bir kişisel bilgisayar (PC) kullanın. NOT: Daha fazla bilgi için http://www.comedi.org ziyaret edin: Comedi en yaygın üreticilerin DAQ kartların çok sayıda destekleyen bir Linux modül ve kütüphane. </li><li> Bir bilgisayar kontrollü yama kelepçe yükselticisi kullanımda olduğu durumda, amplifikatör adanmış bir yanı sıra, ikinci bir bilgisayar istihdamKontrol. Not: ikinci alışılmış bir işletim sistemi çalıştırmak da, ilave bilgisayar özel bir işletim sistemi ile gerçek zamanlı olarak çalışma olacaktır. Özel PC&#39;ye uzak masaüstü uygulaması ile bağlanırken, bu koşullar altında, bu ekstra bilgisayara bağlı tek bir monitör, fare ve klavyeyi kullanmak daha uygun olur. </li><li> Http://www.tnb.ua.ac.be/software/LCG_Live_CD.iso gelen LCG ile gerçek-zamanlı Linux işletim sistemi içeren Live CD ISO görüntüsünü önceden yüklenmiş indirin ve boş bir CD veya USB stick &quot;üzerine yakmak . </li><li> Basitçe DAQ kartı içeren PC sürücüsüne takın ve başlatın. Alternatif olarak, Linux işletim sistemi (örneğin, Debian veya Ubuntu) çalıştıran bir PC üzerinde kendi online kaynak havuzundan LCG yükleyin. Kurulum prosedürü ile ilgili ayrıntılar için çevrimiçi kılavuzuna başvurun. manuel http://danielelinaro.github.io/dynclamp/lcg_manual.pdf adresinden online ulaşabilirsiniz. </li><li> Canlı CD&#39;den önyükleme: tis otomatik tam yapılandırılmış bir sistem yükleyecektir. Bunu yapmak için, bilgisayarın CD-ROM sürücüsüne LCG Live CD yerleştirin ve bilgisayarı CD&#39;den önyükleme; Önyükleme menüsü görünür en kısa sürede gerçek zamanlı çekirdek (varsayılan seçenek) seçin ve sistem başlatılmasını bekleyin. </li><li> Komut istemine yazarak DAQ kartı kalibre: sudo comedi_calibrate veya sudo comedi_soft_calibrate veri toplama kartı sırasıyla donanım veya yazılım kalibrasyonu, (gemide bilgi edinmek için komut sudo comedi_board_info kullanın) destekleyip desteklemediğini bağlı. </li><li> Uygun analog-dijital ve dijital-analog dönüşüm faktörleri ayarlayın: Bu hücresel elektrofizyolojik amplifikatör kılavuzuna sahip erişimi gerektirir ve özellikle de dönüşüm faktörleri üzerindeki teknik özelliklerine. </li><li> Ortam değişkenleri için, dosya /home/user/.lcg-env uygun sayısal değerlerini belirtmek için bir metin düzenleyicisi kullanın AI_CONVERSION_FACTOR_CC, AI_CONVERSION_FACTOR_VC, AO_CONVERSION_FACTOR_CC, AO_CONVERSION_FACTOR_VC. NOT: Bu amplifikatör tarafından oluşturulan girişi (AI) ve akım kelepçe (CC) ve gerilim kelepçe (VC) modları için çıkış (AO) kazançları ve bilgisayar tarafından sağlanan voltaj ve akım komutları veya gerilimler arasındaki dönüşüm faktörleri temsil sırasıyla. </li><li> Alternatif olarak, kendi sistem dönüşüm faktörleri bulmak için, (lcg-bulmak-dönüşüm-faktörler) sağlanan LCG komut dosyasını kullanın. NOT: hesaplanan değerler lcg-bulmak-dönüşüm faktörleri bazı durumlarda sayısal kesik olması gerekmektedir veya dönüşüm faktörleri kesin değerleri yansıtacak şekilde yuvarlanır tahminler vardır. </li><li> Kullanmak için, LCG-dönüşüm-faktörleri bulmak genellikle gelen headstage amplifikatör ile satın alınır &quot;modeli hücreyi &#39;bağlayarak başlayın. Sonra Live CD çalışan ve kabuk isteminde aşağıdaki komutu girin olan Linux makinedeki bir terminal açın: lcg-bulmak-dönüşüm-faktörleri -i $ HOME / .lcg-env -o $ HOME / .lcg-env NOT: Her iki durumda da (yani, manuel /home/user/.lcg-env veya lcg-bulmak-dönüşüm-faktörlerin kullanımının değiştirilmesi), yakın ve değişikliklerin etkili olabilmesi için terminal açın. </li><li> Birden headstages kullanılırsa, tüm kanallarda aynı değerlere dönüşüm faktörleri set; Bu mümkün değilse, daha iyi kullanıcı ihtiyaçlarına uygun yapılandırma dosyaları üretmek için lcg-uyarıcı veya nasıl birden çok dönüşüm faktörlerini nasıl kullanılacağını anlamak için LCG çevrimiçi el kitabına başvurun. </li></ol></li></ol> Somatosensoriyel Cortex adlı Akut Beyin Dilimleri 2. Hazırlık <ol><li> Elektrofizyoloji için çözümler hazırlanması. <ol><li> 125 NaCl, 2.5 KCl, (mM olarak) karıştırılması ile yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) hazırlanması 1.25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 25 glukoz, 2 CaCl2, 1 MgCl2. Azaltmak için 10x stok çözümleri hazırlayındeney günü hazırlık zamanı. Bir dilim hazırlanması ve kayıt için diğeri için kullanılacak olan 2 L, hazırlayın. </li><li> Prosedürün başlangıcına öncesi en az 30 dakika boyunca% 95 O2 ve% 5 CO2 ile ACSF Doymuş. </li><li> Mevcut kelepçe kayıtları için, (mM olarak) ihtiva eden bir hücre içi çözelti (ICS) kullanan 115 K-glukonat, 20 KCI, 10 HEPES, 4 ATP-mg, 0.3 Na 2 -GTP, 10 2 -phosphocreatine Na. Buz çözüm hazırlayın ve pipet tıkanma riskini ortadan kaldırmak için kayıtların başlamasından önce bunu süzün. </li></ol></li><li> Beyin çıkarma. <ol><li> % 4 İsofluranın bir indüksiyon odasında hayvan yerleştirme hayvan anestezisi ve hızla giyotin veya büyük makas kullanarak başını kesmek. </li><li> Orta hat boyunca cildi kesin ve kulaklarına kaydırın. </li><li> Makas ince çifti kullanılarak orta hat boyunca kafatası kesti. Inci mümkün olduğunca yakın bıçak tutune yüzeyi altta yatan beyin hasarı en aza indirecek şekilde. , Bir cımbız ile kafatası açın optik sinir ve beyin sapı sever ve yavaşça buz ACSF beyin açılan bir spatula kullanın. </li><li> Serebellum ve bir neşter (bıçak 24) ile iki hemisfer ayırın. </li><li> Iki hemisfer birinden fazla suyu çıkarın ve superglue bir damla kullanarak eğimli bir platform üzerinde tutkal. Hızla beynin üzerinde ACSF birkaç damla ekleyin ve vibratome odasına transfer. NOT: sagittal dilimleri hazırlarken, platformun açısı dilimleme işlemi sırasında piramidal hücrelerin dendritler zarar görmesini önlemek için çok önemlidir. </li></ol></li><li> Dilimleri hazırlanması. <ol><li> Beynin üzerinde bıçağı yerleştirin ve ilk 2,5 atın - 3 mm. Ise dilimleme işlemi için gerekli zamanı en aza indirmek, aynı zamanda dilim yüzeyine zarar sınırlamak için hız ve frekansını ayarlayın. </li><li> 300 μ kalınlık ayarlamam ve dilimleme başlar. Bıçak korteks geçmiş gitmiş sonra, bir jilet veya hipokampus üzerinde ve ilgi kortikal alanın kenarlarında kesmek için bükülmüş bir iğne kullanın. </li><li> 34 ° C - Çok-çukurlu inkübasyon odası içinde 32 ° C&#39;de tutulan dilimler yerleştirin. </li><li> Bıçak çekin ve 5 kadar puan 2.3.2 ve 2.3.3 tekrarlayın - 8 dilim kesilir. En iyi dilimler, genellikle kan damarlarının yüzeyine paralel olanlardır. </li><li> En son dilim odasına yerleştirilir sonra 30 dakika boyunca inkübe dilimleri. </li></ol></li></ol> Katman 5 Piramidal nöronlar 3. Patch-kelepçe Kayıtlar <ol><li> Kayıt odasına bir dilim koyun ve sağlıklı hücrelere arayın. Bu hücreler genellikle alt kontrast, pürüzsüz bir görünüme sahip ve şişmiş değildir. </li><li> Beynin yüzeyinden yaklaşık 600 mikron 1,000 bulunan, 40X büyütme lens ile mikroskop altında dilim inceleyin ve katmanda 5 hücrelerin arayın. </li&gt; <li> Uygun bir hücre bulunduğunda, ICS mikropipet yükü üçte biri ve headstage yerleştirin. </li><li> Canlı CD ​​veya önceden konfigüre Linux işletim sistemini çalıştıran kişisel bilgisayarda bir komut kabuğunu (örneğin, bash) başlatmak ve istemine şunu yazın komut lcg sıfır. Bu DAQ kurulu amplifikatör sürüş olmadığını garanti eder. </li><li> 30 uygulanır - mikroskop yardımıyla, pipet tutucusuna boru ve bağlı ortak bir şırınga, bir pistona bastırarak pozitif basınç 50 mbar, dilim üzerindeki Pipet yaklaşık 100 um yerleştirin. NOT: tercihen mikromanipülatör yaklaşımı modunu kullanarak, hedef hücreye doğrudan bir yol sağlayan bir konuma pipet yerleştirin. </li><li> Denetimlerinde elektrofizyolojik amplifikatör Oyunculuk, ofset pipet ve çıkış gerilim kelepçe modunda bir test darbe (10 mV) ayarlayın. </li><li> Geri çekerek 30 mbar (pipet boyutuna bağlı olarak) - 10 basıncı azaltmakşırınga piston; nazikçe hücreyi yaklaşım ve video kamera monitörde görüntü gözlemleyerek bir çukur oluşması için kontrol edin. Her zaman direnç artışı test darbe Monitör, elektrofizyoloji amplifikatöre bağlı osiloskop görüntülenen akım dalga şekli izleyerek (alternatif pipet direnci izlemek için komut lcg mühür testi kullanabilirsiniz). </li><li> Basıncı bırakın ve pipet direnci bir artış ve hücre üzerindeki bir &#39;çukur&#39; oluşumunu fark ettiğinizde gerekirse conta oluşumunu yardım etmek pipet nazik negatif basınç uygulayın. </li><li> Mühür formları iken, giderek mV -70 tutarak potansiyelini azaltır. </li><li> 30 Pa - Bir gigaohm sızdırmazlık elde edildikten sonra, tutma akımı 0 ile olduğundan emin olun. Zarın kınlması ve bütün-hücre konfigürasyonunu kurmak için negatif basınç (emme) kısa darbelerle uygulanır. Alternatif olarak, (gerilim güçlü ve kısa darbeleri enjekte edebilirsiniz <em&gt;, yani kullanılan hazırlama ve cam pipet bağlı membran rüptürü) amplifikatör &#39;ZAP&#39; komutunu kullanarak veya çok olumsuz hücreyi tutarak. </li><li> Geçerli kelepçe moduna geçer ve istirahat membran potansiyeli sağlıklı bir hücrenin tipik olduğunu doğrulayın. Bir potasyum glukonat tabanlı çözüm kullanarak kortikal piramidal nöronlar için, bu değer genellikle arasında -65 ile -75 mV olduğunu. </li></ol> Bir Neuron adlı Elektrik Tepki Özellikleri 4. Yarı-otomatik Karakterizasyonu <ol><li> Kullanıcının veri depolamak için bir dizin oluşturun. Bir komut dosyası tarihe göre klasörler oluşturur canlı LCG CD dahil bu işçinin yapmak için. Komut istemine, tip kullanmak için cd ~ / deneyler lcg oluşturun-deney-klasör PSP, in_vivo_like -s Bu, o hücrenin verileri kaydedilir bir klasör (ve alt &#39;in_vivo_like&#39; a &#39;PSP&#39; ve benzeri) yaratacak ve terminale adını basacaktırpencere; Bu gibi bir pipet direnci ve bu komut dosyası kullanılarak hücre tipi gibi ek bilgileri depolamak için de mümkündür. </li><li> Komutunu kullanarak yeni oluşturulan klasöre dizini değiştirin cd ~ / &lt;foldername&gt; klasör adı 20140331A01 gibi, komut lcg-deney-klasör oluşturmak ve mevcut günün zaman damgası (yani, yıl-ay-gün) tarafından görüntülenen biridir. </li><li> Amplifikatör geçerli kelepçe modunda çalışmak üzere ayarlanmış olduğundan emin kabloların bağlı ve amplifikatör harici gerilim komutu varsa, etkin olduğundan emin olun. </li><li> Komut lcg-ecodeat komut istemi girin. Bu hücrenin temel tepkisi özelliklerini karakterize kullanılan komutları bir dizi (yani lcg-ap, lcg-vi, lcg-rampa, lcg-tau ve lcg-adım), çağırır. LCG-ecode kullanıcı iki parametreleri belirlemek gerektirir: Hücre tek bir başak temin etmek için kullanılan akım 1 ms süren darbe genlik ve mevcut RAM maksimum genliğip kendi rheobase bulmak için hücre içine enjekte edilir. Aşağıdaki komut sözdizimini kullanın: LCG-ecode --pulse amplitüdlü X --ramp amplitüdlü Y&#39;nin sırasıyla 1 ms-uzun nabız ve akımın sürekli enjeksiyonu, cevaben hücre ateş yapmak için yeterli değerler X ve (pA olarak) Y seçeneği ile. NOT: Bu protokoller Aktif Elektrot Telafisi (AEC) 15 kullanmak için &#39;elektrot çekirdeğin&#39; sayısal tahminini performans gerektirir. Gürültülü bir akım enjeksiyon çekirdek tahmin etmek için kullanılır ve kullanıcı çekirdeği oluşturan örneklerin sayısını onaylamak için istenir. Elektrot çekirdeğin anlamı ve nasıl çekirdek örneklerinin sayısını seçmek için ilgili ayrıntılı bilgi için bkz 15&#39;e. </li></ol> Simüle Sinapslar ve İn Vivo benzeri Arkaplan Faaliyet Simülasyon yoluyla İletkenlik 5. Enjeksiyon <ol><li> Simüle uyarıcı post-sinaptik potansiyellerin Enjeksiyon <ol><li>Eğer kabuk komut isteminde aşağıdaki komutu yazarak, bir sonraki deneyi kurtaracak dizine değiştirin: cd psp / 01 </li><li> Geçerli dizine bir LCG yapılandırma dosyasını kopyalayın ve (bu örnek yapılandırma dosyası kaynak kodu ve canlı cd dahildir) kabuk komut isteminde aşağıdaki komutları yazarak (bu örnekte Nano) bir metin editörü ile açın : cp ~ / local / src / kg / yapılandırmaları / epsp.xml nano epsp.xml NOT: Bu sadece birbirine bağlı farklı kurumlarla bir metin dosyasıdır. Daha fazla ayrıntı için Temsilcisi Sonuçlar bölümüne bakın. </li><li> Gerekli düzenleme inputChannel, outputChannel, inputConversionFactor ve bu dosyada outputConversionFactor kullanıcının kurulum maç edin. </li><li> Com yayımlayarak &#39;tek elektrot dinamik kelepçe gerçekleştirmek için LCG tarafından kullanılan yöntem&#39; aktif elektrot tazminat gerçekleştirmek için gereken elektrot çekirdek hesaplayınmand lcg-çekirdek Bu çekirdekte noktalarının sayısı isteyecektir. Elektrot çekirdek üstel çürüme kuyruk ucunu kaplayacak şekilde yine bir numara seçin. </li><li> Komutunu kullanarak dinamik kelepçe deneyi gerçekleştirmek -c epsp.xml lcg-deneme </li><li> Dosyaları listelemek ve komutunu kullanarak sonuçları görselleştirmek ls -l Son -f lcg-arsa-dosya </li></ol></li><li> Simüle inhibitör post-sinaptik potansiyellerin Enjeksiyon <ol><li> Bir klasör oluşturun ve kabuk komut isteminde aşağıdaki komutları yazarak kendisine epsp.xml dosyasını kopyalayın: mkdir ../02 cp epsp.xml ../02/ipsp.xml CD ../02 </li><li> Bir metin düzenleyicisi kullanarak yapılandırma dosyasını düzenleyin: sinaptik ters potansiyelini değiştirmek ve aşağıdaki model sinaps Exp2Synapse sabitleri yükselir ve çürüme süresi: Parametreler&gt; &lt;E&gt; -80 &lt;/ E&gt; &lt;TauRise&gt; 0.8e-3 &lt;/ tauRise&gt; &lt;TauDecay&gt; 10e-3 &lt;/ tauDecay&gt; &lt;Parametreler&gt; Metin editörü çıkın. </li><li> Elektrot çekirdek hesaplamak ve kabuk komut istemine aşağıdaki komutları yazarak, 5.1 gibi deney gerçekleştirin: lcg-çekirdek -c ipsp.xml lcg-deneme </li><li> Dosyaları listelemek ve kabuk komut istemine aşağıdaki komutları yazarak, sonuçları görselleştirmek: ls -l lcg-arsa-dosya -f &lt;filename.h5&gt; </li></ol></li><li> In vivo benzeri zemin aktivitesi Simülasyonu: <ol><li> Daha önce kabuğun komut isteminde aşağıdaki komutları yazarak, gösterildiği gibi, aşağıdaki deney kaydetmek istediğiniz dizini değiştirin: CD ../../in_vivo_like/01 </li><li> LCG kaynak dizinden, kabuk komut isteminde aşağıdaki komutları yazarak yapılandırma dosyasını kopyalayın: cp ~ / local / src / kg / yapılandırmaları / in_vivo_like.xml nano in_vivo_like.xml <br /&gt; Not: Bu dosya sadece öncekilerin birleşimidir; sırayla, baskılayıcı ve uyarıcı bir model sinapsların beslemek arka plan faaliyeti oluşturmak başak trenler oluşturmak iki Poisson nokta süreçleri. </li><li> 5.1.3 açıklandığı gibi, kullanıcının kurulum için DAQ yapılandırma parametrelerini ayarlayın ve editörü çıkın. </li><li> Elektrot çekirdek hesaplamak ve kabuk komut istemine aşağıdaki komutları yazarak, 5.1 gibi deney gerçekleştirin: lcg-çekirdek 10 -i 3 -n -c in_vivo_like.xml lcg-deneme &#39;-n 10&#39; ve &#39;-i 3&#39; anahtarlar stimülasyon üç saniyelik aralıklarla 10 kez tekrarlanır gerektiğini göstermektedir. </li><li> Kabuğun komut isteminde aşağıdaki komutu kullanarak ham izlerini görselleştirmek: lcg-arsa-dosya -f tüm </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Saleem, A. B., Ayaz, A., Jeffery, K. J., Harris, K. D., Carandini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+visual+motion+and+locomotion+in+mouse+visual+cortex.">Integration of visual motion and locomotion in mouse visual cortex.</a> Nature neuroscience. 16, 1864-1869 (2013).</li><li>Ahrens, M. B., Li, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-wide+neuronal+dynamics+during+motor+adaptation+in+zebrafish.">Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish.</a> Nature. 485 (7399), 471-477 (2012).</li><li>Paz, J. T., Davidson, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Closed-loop+optogenetic+control+of+thalamus+as+a+tool+for+interrupting+seizures+after+cortical+injury.">Closed-loop optogenetic control of thalamus as a tool for interrupting seizures after cortical injury.</a> Nature neuroscience. 16 (1), 64-70 (2013).</li><li>Wallach, A., Eytan, D., Gal, A., Zrenner, C., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+response+clamp.">Neuronal response clamp.</a> Frontiers in neuroengineering. 3 (April), 3 (2011).</li><li>Linaro, D., Couto, J., Giugliano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Command-line+cellular+electrophysiology+for+conventional+and+real-time+closed-loop+experiments.">Command-line cellular electrophysiology for conventional and real-time closed-loop experiments.</a> Journal of neuroscience. 230, 5-19 (2014).</li><li>Sharp, A., O&#8217;Neil, M., Abbott, L. F., Marder, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+clamp:+computer-generated+conductances+in+real+neurons.">Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons.</a> Journal of neurophysiology. 69 (3), 992-995 (1993).</li><li>Robinson, H. P., Kawai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+digitally+synthesized+synaptic+conductance+transients+to+measure+the+integrative+properties+of+neurons.">Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons.</a> Journal of neuroscience methods. 49 (3), 157-165 (1993).</li><li>Vervaeke, K., Hu, H., Graham, L. J., Storm, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+effects+of+the+persistent+Na++current+on+neuronal+excitability+and+spike+timing.">Contrasting effects of the persistent Na+ current on neuronal excitability and spike timing.</a> Neuron. 49 (2), 257-270 (2006).</li><li>White, J. A., Klink, R., Alonso, A., Kay, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+from+voltage-gated+ion+channels+may+influence+neuronal+dynamics+in+the+entorhinal+cortex.">Noise from voltage-gated ion channels may influence neuronal dynamics in the entorhinal cortex.</a> Journal of neurophysiology. 80 (1), 262-269 (1998).</li><li>Destexhe, a., Rudolph, M., Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuating+synaptic+conductances+recreate+in+vivo-like+activity+in+neocortical+neurons.">Fluctuating synaptic conductances recreate in vivo-like activity in neocortical neurons.</a> Neuroscience. 107 (1), 13-24 (2001).</li><li>Fellous, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Persistent+Activity+by+Background+Inhibition+in+an+In+Vitro+Model+of+a+Cortical+Microcircuit.">Regulation of Persistent Activity by Background Inhibition in an In Vitro Model of a Cortical Microcircuit.</a> Cerebral Cortex. 13 (11), 1232-1241 (2003).</li><li>Gal, A., Eytan, D., Wallach, A., Sandler, M., Schiller, J., Marom, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+excitability+over+extended+timescales+in+cultured+cortical+neurons.+The+Journal+of+neuroscience.">Dynamics of excitability over extended timescales in cultured cortical neurons. The Journal of neuroscience.</a> the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (48), 16332-16342 (2010).</li><li>Wang, Y., Toledo-Rodriguez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical,+physiological+and+molecular+properties+of+Martinotti+cells+in+the+somatosensory+cortex+of+the+juvenile+rat.">Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat.</a> The Journal of physiology. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).</li><li>Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical,+physiological,+molecular+and+circuit+properties+of+nest+basket+cells+in+the+developing+somatosensory+cortex).">Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex).</a> Cerebral cortex (New York, N.Y). 12 (4), 395-410 (1991).</li><li>Brette, R., Piwkowska, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+intracellular+recordings+using+a+real-time+computational+model+of+the+electrode.">High-resolution intracellular recordings using a real-time computational model of the electrode.</a> Neuron. 59 (3), 379-391 (2008).</li><li>Rutishauser, U., Kotowicz, A., Laurent, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+closed-loop+presentation+of+sensory+stimuli+conditional+on+the+internal+brain-state+of+awake+animals.">A method for closed-loop presentation of sensory stimuli conditional on the internal brain-state of awake animals.</a> Journal of neuroscience. 215 (1), 139-155 (2013).</li><li>Margrie, T., Brecht, M., Sakmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo,+low-resistance,+whole-cell+recordings+from+neurons+in+the+anaesthetized+and+awake+mammalian+brain.">In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain.</a> Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 444 (4), 491-498 (2002).</li><li>Graham, L., Schramm, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Dynamic-Clamp+Manipulation+of+Extrinsic+and+Intrinsic+Conductances:+Functional+Roles+of+Shunting+Inhibition+and+I+BK+in+Rat+and+Cat+Cortex.">In Vivo Dynamic-Clamp Manipulation of Extrinsic and Intrinsic Conductances: Functional Roles of Shunting Inhibition and I BK in Rat and Cat Cortex.</a> Dynamic Clamp: From Principles to Applications. , (2008).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-channel recording. , (1995).</li><li>Molleman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Patch Clamping. , (2002).</li><li>Davie, J. T., Kole, M. H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+patch-clamp+recording.">Dendritic patch-clamp recording.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1235-1247 (2006).</li><li>Gold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Axon Guide for Electrophysiolog., &amp; Biophysics Laboratory Techniques... , (2007).</li><li>Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliability+of+spike+timing+in+neocortical+neurons.">Reliability of spike timing in neocortical neurons.</a> Science. 268 (5216), 1503-1506 (1995).</li><li>Buzs&#225;ki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Action+potential+threshold+of+hippocampal+pyramidal+cells+in+vivo+is+increased+by+recent+spiking+activity.">Action potential threshold of hippocampal pyramidal cells in vivo is increased by recent spiking activity.</a> Neuroscience. 105 (1), 121-130 (2001).</li><li>Koch, C., Segev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Neuronal Modeling: From Synapses to Networks. , (1988).</li><li>Silberberg, G., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disynaptic+inhibition+between+neocortical+pyramidal+cells+mediated+by+Martinotti+cells.">Disynaptic inhibition between neocortical pyramidal cells mediated by Martinotti cells.</a> Neuron. 53 (5), 735-746 (2007).</li><li>Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+bursts+self-inhibit+and+correlate+the+pyramidal+network.">Brief bursts self-inhibit and correlate the pyramidal network.</a> PLoS biology. 8 (9), (2010).</li><li>Tsodyks, M., Pawelzik, K., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+networks+with+dynamic+synapses.">Neural networks with dynamic synapses.</a> Neural computation. 10 (4), 821-835 (1998).</li><li>Kapfer, C., Glickfeld, L. L., Atallah, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supralinear+increase+of+recurrent+inhibition+during+sparse+activity+in+the+somatosensory+cortex.">Supralinear increase of recurrent inhibition during sparse activity in the somatosensory cortex.</a> Nature. 10 (6), 743-753 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu metinde gerçek zamanlı uygulanması için tam bir protokol olarak, kapalı döngü tek bir hücre elektrofizyolojik deneyler yama kelepçe tekniği ve LCG adında bir süre önce geliştirilen yazılım araç kutusunu kullanarak tarif edilmiştir. Kayıtların kalitesini optimize etmek için bu kayıt kurulum düzgün, topraklı ücretsiz ekranlı ve titreşim olması çok önemlidir: bu hücrenin, istikrarlı ve kalıcı tam hücreli erişimi garantiler birlikte stimülasyon protokolleri tüm bölümlerini otomasy...

<html> Son yıllarda, hücresel elektrofizyoloji, modern kapalı devre protokollere gerilim ve akım kelepçe deneylerinde kullanılan geleneksel açık-döngü evrim geçirmiştir. En iyi bilinen kapalı döngü tekniği belki nöronal membran gerilimi 8 belirlemek için yapay voltaj kapılı iyon kanallarının sentetik enjeksiyon etkin dinamik kelepçe 6,7 olduğunu, deterministik olmayan titreşen etkilerinin derinlemesine çalışma iyon nöronal yanıt dinamikleri 9 kanal, yanı sıra sinaptik zemin aktivitesi 10 gibi vivo- gerçekçi in vitro rekreasyon. Ileri sürülmüştür diğer kapalı çevrim paradigmalar hücresel mekanizmaları altında yatan nöronal uyarılabilirliği araştırmak için, 4,12 kelepçe reaktif kelepçe 11, in vitro kendini sürekli kalıcı aktivite nesil incelemek ve yanıtı yer alıyor. &quot;ontent&gt; Burada akut beyin dilimleri yapılan tüm hücre yama kelepçe kayıtları bağlamında kapalı döngü elektrofizyolojik protokolleri çeşitli uygulayarak sağlar güçlü bir çerçeve açıklanmaktadır. Biz yama kelepçe kayıtları vasıtasıyla somatik membran gerilimini kaydetmek için nasıl göstermek genç sıçanların somatosensoriyel korteks ve gelen piramidal nöronlar LCG, Teorik Nörobiyoloji ve Neuroengineering laboratuarda geliştirilen bir komut satırı tabanlı yazılım araç kutusunu kullanarak üç farklı kapalı döngü protokolleri uygulamak. Kısaca, tarif edilen protokoller, aktif ve pasif zar özelliklerinin büyük bir set karakterizasyonu hakkında akım kenetli uyaran dalga formu, bir dizi ilk otomatik enjeksiyon bulunmaktadır. Bunlar uyarıcı bir dalga kalıplaşmış dizi onun cevabı özellikleri bakımından bir hücrenin elektrofizyolojik fenotip yakalamak için ileri sürülmüştür. Bir hücrenin e-kodu olarak bilinen (örneğin, bkz &amp; #160; 13,14), elektrik yanıtların Bu tür bir koleksiyon objektif olarak elektriksel özellikleri temelinde nöronlar sınıflandırmak için çeşitli laboratuarlar tarafından kullanılır. Bu orantılı-entegral-türev (PID) ile, kontrol vasıtası ile ateşleme hızının kapalı halka, gerçek zamanlı kontrol içeren bir yeni tekniği sabit giriş-çıkış aktarma bağlantısı ile (eğri), analizini içermektedir in vitro preparasyonlar 10 ve bilgisayar tarafından simüle sanal bir GABAerjik interneuron vasıtasıyla, iki eş zamanlı olarak kaydedilen piramidal nöronlar, gerçek zamanlı olarak, üçüncü yapay bağlantılı olarak gerçekçi bir in vivo benzeri arka sinaptik aktivitenin ikinci dinlenme. Buna ek olarak, LCG tek bir elektrot kullanarak dinamik kelepçe protokolleri uygulanması mümkün olmaktadır aktif elektrot Telafisi (AEC), 15 olarak bilinen bir teknik uygular. Bu istenmeyen etkileri telafi izin verir (artifacts) hücre içi uyaranlara teslim etmek için kullanıldığı zaman ortaya çıkan kayıt elektrot. yöntem kayıt devrenin eşdeğer elektriksel özelliklerinin parametrik olmayan tahmin dayanmaktadır. Bu yazıda tarif edilen teknikler ve deneysel protokoller hali hazırda, geleneksel açık döngü gerilim ve akım kenetli deneylerinde uygulanabilir ve in vivo 17,18 gibi hücre dışı 4,16 diğer preparasyonlar ya da hücre içi kayıtları uzatılabilir. tüm hücre yama kelepçe elektrofizyoloji için kurulum dikkatli montaj istikrarlı, yüksek kaliteli kayıtlar için çok önemli bir adımdır. Aşağıda böyle bir deney düzeneği deneyci için zaten mevcut olduğunu varsayalım ve LCG kullanımını anlatan bizim dikkatimizi. Okuyucu optimizasyonu ve hata ayıklama hakkında ek ipuçları için 19-22 işaret edilmektedir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Tissue slicer</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT-1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Sutter</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>WPI</td>
			<td>1B150F-4</td>
			<td>1.5/0.84 mm OD/ID, with filament</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibration isolation table</td>
			<td>TMC</td>
			<td>20 Series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMLFS</td>
			<td>40X Immersion Objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manipulators</td>
			<td>Scientifica</td>
			<td>PatchStar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifiers</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td>MultiClamp 700B</td>
			<td>Computer controlled</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition card</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PCI-6229</td>
			<td>Supported by Comedi Linux Drivers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop computer</td>
			<td>Dell</td>
			<td>Optiplex 7010 Tower</td>
			<td>OS: real-time Linux</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oscilloscopes</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>TDS-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion Pump</td>
			<td>Gibson</td>
			<td>MINIPULS3</td>
			<td>Used with R4 Pump head (F117606)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Multichannel Systems</td>
			<td>TC02</td>
			<td>PH01 Perfusion Cannula</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Manometer</td>
			<td>Testo</td>
			<td>510</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WB14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>71376</td>
			<td>ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td>ACSF, ICS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S3139</td>
			<td>ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td>ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016</td>
			<td>ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266</td>
			<td>ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528</td>
			<td>ACSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-Gluconate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G4500</td>
			<td>ICS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td>ICS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mg-ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9187</td>
			<td>ICS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2-GTP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>51120</td>
			<td>ICS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2-Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7936</td>
			<td>ICS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time electrophysiology: using closed-loop protocols to probe neuronal dynamics and beyond

Deneysel nörobilim teşvik sisteminin cevabına gerçek zamanlı olarak bağlıdır uygulanan geliştirme ve roman uygulama ve genellikle karmaşık, kapalı devre protokolleri, artan bir ilgi tanık olmaktadır. Son uygulamalar optogenetics 3 kullanılarak kortikal inme aşağıdaki nöbetlerin kontrol etmek için, farelerde 1 ve Zebra balığı 2 hem de motorlu yanıtları incelemek için sanal gerçeklik sistemlerinin uygulanması arasında değişir. Kapalı döngü teknikleri önemli bir avantajı doğrudan erişilebilir değildir ya da aynı anda deneysel verim en üst düzeye çıkarırken, bu tür nöronal uyarılabilirlik 4 ve güvenilirlik gibi çoklu değişkenler, bağlı olduğu yüksek boyutlu özelliklerini sondalama kapasitesi bulunur. Bu katkının ve hücresel elektrofizyoloji bağlamında, biz piramidal kortikal nöronlar, rec tepki özelliklerinin çalışmaya kapalı devre protokolleri çeşitli uygulamak nasıl açıklargenç sıçanların somatosensoriyel korteks akut beyin dilimleri yama kelepçe tekniği ile hücre orded. Hiçbir ticari olarak temin veya açık kaynak yazılım verimli Burada anlatılan deneyler için gerekli tüm özellikleri sağlar gibi, LCG 5 olarak adlandırılan yeni bir yazılım araç olan modüler yapısı bilgisayar kodu yeniden en üst düzeye ve yeni deneysel paradigmalar uygulanmasını kolaylaştırır geliştirilmiştir. Uyarım dalga kompakt meta-açıklamasını kullanılarak belirtilir ve tam deneysel protokoller metin tabanlı yapılandırma dosyalarında açıklanmıştır. Ayrıca, LCG çalışmaların tekrarı ve deneysel protokollerin otomasyonu için uygundur bir komut satırı arayüzü var.

Önceki bölümlerde, biz L5 piramidal hücrelerin elektrofizyolojik özelliklerini karakterize etmek için bir yazılım araç LCG kullanmak ve bir dilim hazırlık in vivo benzeri sinaptik aktivite yeniden nasıl tarif var. Bir komut satırı arayüzü ve yarı otomatik protokolünün kullanımı elde edilen verilerin çıktı ve kalitesi üzerinde büyük bir etkisi olabilir deney, tekrarlanabilirliği ve verimliliğini lehine. Veri tutarlı bir şekilde kaydedilmiş olduğundan, ayrıca, belirli bir hedefe ...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond at JoVE.com

Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board.

Gerçek zamanlı Elektrofizyoloji: Probe Nöronal Dynamics ve Ötesi Kapalı çevrim Protokolleri Kullanma

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where ...

real-time-electrophysiology-using-closed-loop-protocols-to-probe

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.4K Görüntüleme.  University of Antwerp. Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board. 

Video: Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

An Experimental Platform to Study the Closed-loop Performance of Brain-machine Interfaces

The non-stationary nature and variability of neuronal signals is a fundamental problem in brain-machine interfacing. We developed a brain-machine interface to assess the robustness of different control-laws applied to a closed-loop image stabilization task. Taking advantage of the well-characterized fly visuomotor pathway we record the electrical activity from an identified, motion-sensitive neuron, H1, to control the yaw rotation of a two-wheeled robot. The robot is equipped with 2 high-speed video cameras providing visual motion input to a fly placed in front of 2 CRT computer monitors. The activity of the H1 neuron indicates the direction and relative speed of the robot's rotation. The neural activity is filtered and fed back into the steering system of the robot by means of proportional and proportional/adaptive control. Our goal is to test and optimize the performance of various control laws under closed-loop conditions for a broader application also in other brain machine interfaces.

We use a closed-loop fly-machine interface to investigate general principles in neuronal control.

Beyin-makine Arayüzler Kapalı döngü Performans Çalışması için Deneysel Bir Platform

The non-stationary nature and variability of neuronal signals is a fundamental problem in brain-machine interfacing. We developed a brain-machine ...

Nörobilim

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Organotipik Kültürleri nöronal Çığ Çok elektrot Dizi Kayıtlar

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

Eşzamanlı Elektroensefalografi, Kemirgen Serebral Korteks Laktat Konsantrasyonu ve Nöronal Faaliyet Optogenetic Manipülasyon Gerçek zamanlı ölçüm

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Real-Time Impedance-based Cell Analyzer as a Tool to Delineate Molecular Pathways Involved in Neurotoxicity and Neuroprotection in a Neuronal Cell Line

Many brain-related disorders have neuronal cell death involved in their pathophysiology. Improved in vitro models to study neuroprotective or neurotoxic effects of drugs and downstream pathways involved would help gain insight into the molecular mechanisms of neuroprotection/neurotoxicity and could potentially facilitate drug development. However, many existing in vitro toxicity assays have major limitations &#8211; most assess neurotoxicity and neuroprotection at a single time point, not allowing to observe the time-course and kinetics of the effect. Furthermore, the opportunity to collect information about downstream signaling pathways involved in neuroprotection in real-time would be of great importance. In the current protocol we describe the use of a real-time impedance-based cell analyzer to determine neuroprotective effects of serotonin 2A (5-HT2A) receptor agonists in a neuronal cell line under label-free and real-time conditions using impedance measurements. Furthermore, we demonstrate that inhibitors of second messenger pathways can be used to delineate downstream molecules involved in the neuroprotective effect. We also describe the utility of this technique to determine whether an effect on cell proliferation contributes to an observed neuroprotective effect. The system utilizes special microelectronic plates referred to as E-Plates which contain alternating gold microelectrode arrays on the bottom surface of the wells, serving as cell sensors. The impedance readout is modified by the number of adherent cells, cell viability, morphology, and adhesion. A dimensionless parameter called Cell Index is derived from the electrical impedance measurements and is used to represent the cell status. Overall, the real-time impedance-based cell analyzer allows for real-time, label-free assessment of neuroprotection and neurotoxicity, and the evaluation of second messenger pathways involvement, contributing to more detailed and high-throughput assessment of potential neuroprotective compounds in vitro, for selecting therapeutic candidates.

Improved in vitro neurotoxicity assays would aid the identification of new neuroprotective compounds. The utility of a real-time impedance-based cell analyzer to determine cytotoxicity and cytoprotection in neuronal cell lines and to delineate the involvement of second messenger pathways, thus gaining insight in the mechanism of neuroprotection is presented.

Bir Nöronal Hücre Line Neurotoxicity ve nöro ilgilendim Moleküler Pathways Delineate bir aracı olarak Real-Time Empedans tabanlı Cell Analyzer

Many brain-related disorders have neuronal cell death involved in their pathophysiology. Improved in vitro models to study neuroprotective or neurotoxic ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation of a given stimulus might be dependent on context and history. If this is actually the case, bi-directional interactions between the brain (or if need be a reduced model of it) and sensory-motor system can shed a light on how encoding and decoding of information is performed. Here an experimental system is introduced and described in which the activity of a neuronal element (i.e., a network of neurons extracted from embryonic mammalian hippocampi) is given context and used to control the movement of an artificial agent, while environmental information is fed back to the culture as a sequence of electrical stimuli. This architecture allows a quick selection of diverse encoding, decoding, and learning algorithms to test different hypotheses on the computational properties of neuronal networks.

In this paper, an experimental framework to perform closed-loop experiments is presented, in which information processing (i.e., coding and decoding) and learning of neuronal assemblies are studied during the continuous interaction with a robotic body.

Kapalı döngü Nöro-robotik Deneyler Nöronal Ağları Hesaplamalı Properties Test

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

Elektrofizyoloji ve Kalsiyum-görüntüleme için akut nöronal Doku Uzamış İnkübasyon

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. To efficiently and accurately deorphanize ORs, we combine the use of a heterologous cell line to express mammalian ORs and a genetically modified biosensor plasmid to measure cAMP production downstream of OR activation in real time. This assay can be used to screen odorants against ORs and vice versa. Positive odorant-receptor interactions from the screens can be subsequently confirmed by testing against various odor concentrations, generating concentration-response curves. Here we used this method to perform a high-throughput screening of an odorous compound against a human OR library expressed in Hana3A cells and confirmed that the positively-responding receptor is the cognate receptor for the compound of interest. We found this high-throughput detection method to be efficient and reliable in assessing OR activation and our data provide an example of its potential use in OR functional studies.

Characterizing the function of odorant receptors serves an indispensable part in the deorphanization process. We describe a method to measure the activation of odorant receptors in real time using a cAMP assay.

Canlı hücre ölçüm propil reseptörü harekete geçirmek kullanımı gerçek zamanlı bir kamp tahlil

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Using Neuron Spiking Activity to Trigger Closed-Loop Stimuli in Neurophysiological Experiments

Closed-loop neurophysiological systems use patterns of neuronal activity to trigger stimuli, which in turn affect brain activity. Such closed-loop systems are already found in clinical applications, and are important tools for basic brain research. A particularly interesting recent development is the integration of closed-loop approaches with optogenetics, such that specific patterns of neuronal activity can trigger optical stimulation of selected neuronal groups. However, setting up an electrophysiological system for closed-loop experiments can be difficult. Here, a ready-to-apply Matlab code is provided for triggering stimuli based on the activity of single or multiple neurons. This sample code can be easily modified based on individual needs. For instance, it shows how to trigger sound stimuli and how to change it to trigger an external device connected to a PC serial port. The presented protocol is designed to work with a popular neuronal recording system for animal studies (Neuralynx). The implementation of closed-loop stimulation is demonstrated in an awake rat.

This protocol demonstrates how to use an electrophysiological system for closed-loop stimulation triggered by neuronal activity patterns. Sample Matlab code that can be easily modified for different stimulation devices is also provided.

Nörofizyolojik Deneylerde Kapalı Döngü Uyaranlarını Tetiklemek Için Nöron Spiking Aktivitesinin Kullanılması

Closed-loop neurophysiological systems use patterns of neuronal activity to trigger stimuli, which in turn affect brain activity. Such closed-loop systems ...

Open-Source Real-Time Closed-Loop Electrical Threshold Tracking for Translational Pain Research

Nociceptors are a class of primary afferent neurons that signal potentially harmful noxious stimuli. An increase in nociceptor excitability occurs in acute and chronic pain conditions. This produces abnormal ongoing activity or reduced activation thresholds to noxious stimuli. Identifying the cause of this increased excitability is required for the development and validation of mechanism-based treatments. Single-neuron electrical threshold tracking can quantify nociceptor excitability. Therefore, we have developed an application to allow such measurements and demonstrate its use in humans and rodents. APTrack provides real-time data visualization and action potential identification using a temporal raster plot. Algorithms detect action potentials by threshold crossing and monitor their latency after electrical stimulation. The plugin then modulates the electrical stimulation amplitude using an up-down method to estimate the electrical threshold of the nociceptors. The software was built upon the Open Ephys system (V0.54) and coded in C++ using the JUCE framework. It runs on Windows, Linux, and Mac operating systems. The open-source code is available (<a data-saferedirecturl="https://www.google.com/url?q=https://github.com/Microneurography/APTrack&amp;source=gmail&amp;ust=1680789829274000&amp;usg=AOvVaw0nMk9J_EI2jUn8SlmC5JJm" href="https://github.com/Microneurography/APTrack" target="_blank">https://github.com/Microneurography/APTrack</a>). The electrophysiological recordings were taken from nociceptors in both a mouse skin-nerve preparation using the teased fiber method in the saphenous nerve and in healthy human volunteers using microneurography in the superficial peroneal nerve. Nociceptors were classified by their response to thermal and mechanical stimuli, as well as by monitoring the activity-dependent slowing of the conduction velocity. The software facilitated the experiment by simplifying the action potential identification through the temporal raster plot. We demonstrate real-time closed-loop electrical threshold tracking of single-neuron action potentials during&#160;in vivo&#160;human microneurography, for the first time, and during&#160;ex vivo&#160;mouse electrophysiological recordings of C-fibers and A&#948;-fibers. We establish proof of principle by showing that the electrical threshold of a human heat-sensitive C-fiber nociceptor is reduced by heating the receptive field. This plugin enables the electrical threshold tracking of single-neuron action potentials and allows the quantification of changes in nociceptor excitability.

APTrack is a software plugin developed for the Open Ephys platform that enables real-time data visualization and the closed-loop electrical threshold tracking of neuronal action potentials. We have successfully used this in microneurography for human C-fiber nociceptors and mouse C-fiber and A&#948;-fiber nociceptors.

Translasyonel ağrı araştırması için açık kaynaklı gerçek zamanlı kapalı döngü elektrik eşiği izleme

Nociceptors are a class of primary afferent neurons that signal potentially harmful noxious stimuli. An increase in nociceptor excitability occurs in ...

Majör Depresyon Tedavisi için Derin Beyin Stimülasyonu

Closed-Loop Neurostimulation for Biomarker-Driven, Personalized Treatment of Major Depressive Disorder

Deep brain stimulation involves the administration of electrical stimulation to targeted brain regions for therapeutic benefit. In the context of major depressive disorder (MDD), most studies to date have administered continuous or open-loop stimulation with promising but mixed results. One factor contributing to these mixed results may stem from when the stimulation is applied. Stimulation administration specific to high-symptom states in a personalized and responsive manner may be more effective at reducing symptoms compared to continuous stimulation and may avoid diminished therapeutic effects related to habituation. Additionally, a lower total duration of stimulation per day is advantageous for reducing device energy consumption. This protocol describes an experimental workflow using a chronically implanted neurostimulation device to achieve closed-loop stimulation for individuals with treatment-refractory MDD. This paradigm hinges on determining a patient-specific neural biomarker that is related to states of high symptoms and programming the device detectors, such that stimulation is triggered by this read-out of symptom state. The described procedures include how to obtain neural recordings concurrent with patient symptom reports, how to use these data in a state-space model approach to differentiate low- and high-symptom states and corresponding neural features, and how to subsequently program and tune the device to deliver closed-loop stimulation therapy.

Yazar Spotlight: Depresyon Tedavisinde Kapalı Döngü Derin Beyin Stimülasyonunun Terapötik Faydası 

Deep brain stimulation triggered by a patient-specific neural biomarker of a high-symptom state may better control symptoms of major depressive disorder compared to continuous, open-loop stimulation. This protocol provides a workflow for identifying a patient-specific neural biomarker and controlling the delivery of therapeutic stimulation based on the identified biomarker.

Majör Depresif Bozukluğun Biyobelirteç Odaklı, Kişiselleştirilmiş Tedavisi için Kapalı Döngü Nörostimülasyon

Deep brain stimulation involves the administration of electrical stimulation to targeted brain regions for therapeutic benefit. In the context of major ...