The authors would like to acknowledge the effort of Sandro Lucchinetti (Schenkung Dapples, Z&#252;rich) for constructing the devices needed to guarantee progress in sample preparation.

1. Técnicas de muestreo <ol><li> Muestreo Core <ol><li> Para árbol muestreo tallos, extraer al menos dos núcleos utilizando un descorazonador de incremento de cada tallo para analizar su desarrollo de crecimiento. Variar la posición de toma de muestras en la tarea de investigación, por ejemplo, para reconstrucciones climáticas comunes toman los núcleos paralelo a la pendiente. Cuando se trabaja con especies tropicales, tomar por lo menos tres o más núcleos. </li><li> Use un corer incremento afilado (5, 10 o 12 mm de diámetro) y coloque el corer perpendicular al eje mayor de la madre. NOTA: Para tener una posición controlada y estable del corer, use un empujador para evitar movimientos del corer aparte de su rotación cuando se perfora en el árbol. El taladro en el tallo hasta el final en ya través de la médula. Para núcleo de madera muy densa (es decir, las especies tropicales), usar cuerpos especiales de motosierra reconfigurados con un adaptador de tacos de crecimiento que permiten centrales incluso bosques densos como Diospyrus ebenum (Ebony). &lt;/ Li&gt; <li> Utilice un extractor y retirar el núcleo resultante de la árbol. Apaga la corer y sacarlo de la madre. </li><li> Añadir un ID específico para el núcleo extraído por medio de un lápiz suave al escribir en una cinta, que luego se coloca directamente sobre el núcleo. Repetir el procedimiento en el lado opuesto del tallo. </li><li> Almacenar las dos muestras del árbol en tubos de plástico o de papel o cajas especiales para evitar cualquier daño. NOTA: Paja de papel son beneficiosos especialmente en ambientes tropicales, ya que impiden los núcleos de moldeo. </li><li> Por último, montar los núcleos (dirección de las fibras verticales) sobre vigas de soporte de madera. Use agua fría pegamento de madera resistente y déjelos secar. NOTA: Nunca montar los núcleos en soportes de madera, si el objetivo del estudio incluye además químico, isótopo o análisis de la densidad. A estos efectos, fijar los núcleos en los conductos de cables abiertos o una sola cara de cartón corrugado. </li></ol></li><li> Muestreo Micro-core <ol><li> Utilice un dispositivo de perforación especialo aguja con una abertura de 2 mm. Dependiendo del espesor de la corteza utilizar un cincel para eliminar una parte necesaria de la corteza. </li><li> Coloque el dispositivo perpendicular al eje que crecen en el tallo como se describe anteriormente, y utilizar un martillo para penetrar en el xilema de la raíz a aproximadamente 2 cm de profundidad. </li><li> Gire la aguja para romper el núcleo micro resultante dentro de la herramienta y retírela del tronco. Guarde los núcleos de micro en viales de microcentrífuga y etiquetarlos. </li></ol></li><li> Muestreo Disco <ol><li> En casos especiales (y especialmente en los trópicos), por ejemplo, cuando se toman muestras tocones y árboles caídos o siempre que sea posible, tome discos (secciones transversales perpendiculares al eje creciente) con una sierra de cadena. Simplemente etiquetar los discos y almacenarlos hasta su posterior análisis. NOTA: Este procedimiento se aplica el muestreo más comúnmente para todo el material fósil sub-seca muerto, histórico, arqueológico y, así como las maderas duras muy densas que no permiten el uso de sacatestigos de incremento. </li></ol&gt; </li></ol> Preparación 2. Muestra <ol><li> Discos de lijado <ol><li> Coloque los discos en una máquina de lijado y moler la superficie usando una secuencia de abrasivos cada vez más finas, comenzando con papel de lija de grano 80, seguido por 120, 220, 300 de grano. Un pulido final con grano 400 es suficiente para la mayoría de las coníferas. Para maderas duras y especialmente las especies tropicales, el uso de lija sémola hasta 1200 para distinguir los límites de crecimiento de anillos. </li></ol></li><li> Cortar superficies planas en núcleos <ol><li> Fijar los tacos de crecimiento en el soporte básico de un micrótomo núcleo de nuevo desarrollo que permite cortar superficies planas en núcleos en toda su extensión. NOTA: corregir la orientación del núcleo dentro del soporte para tener la dirección de la fibra de la muestra en posición vertical, que está en un ángulo recto con el cuchillo de la microtomo. </li><li> Levante el núcleo hasta que toque ligeramente la cuchilla. Tirar de la cuchilla, que se fija en cojinete de guía peligro en la medida del núcleo a Cut de una primera parte de la parte superior. </li><li> Presione de nuevo el cuchillo detrás de la central, levante el soporte de la muestra con el núcleo alrededor del 10 micras y repita el procedimiento de corte. Hacer esto hasta aproximadamente un tercio del diámetro del núcleo es cortado resultando en una superficie plana continua. </li></ol></li><li> Preparación micro secciones añadiendo solución de almidón de maíz. <ol><li> Para el análisis de la imagen detallada de la estructura anatómica, corregir núcleos u otras muestras se separaron de discos en el soporte de un micrótomo. Coloque la cuchilla de microtomo, guiado por una guía de cojinete de bolas de un microtomo trineo de nuevo desarrollo en el borde superior de la muestra y tire del mismo. </li><li> Presione de nuevo la pala para levantar la muestra en alrededor de 20 a 30 micras y tire de la cuchilla sobre la muestra de nuevo. Repita este procedimiento hasta que se crea una superficie continua en la parte superior de la muestra. </li><li> Cubrir la superficie resultante con una solución de almidón de maíz (10 g de almidón de maíz, 8 ml de agua, y 7 g de 100% glicerol) con un cepillo común. NOTA: Los granos de almidón se llenan las celdas abiertas de la muestra para estabilizar la estructura para la posterior corte de las secciones delgadas. </li><li> Levantar la muestra por 15 micras, coloque un cepillo sobre la superficie de la muestra y tire de la hoja lentamente hacia la muestra de partida para cortar una sección fina (por debajo del cepillo). Si bien el corte, la sección resultante se desliza sobre la hoja guiada por el cepillo. </li><li> Cuando se corta toda la sección, eliminar la sección micro de la cuchilla con un cepillo y agua (para reducir la fricción) y coloque la sección sobre un portaobjetos de vidrio para su posterior elaboración. Para evitar que se sequen, cubrirlas usando una pequeña cantidad de glicerol (33% = una parte de 100% de glicerol y dos partes de agua). </li></ol></li></ol> 3. Preparación MicroSlide <ol><li> Para la siguiente preparación de láminas permanentes, primero lavar el glicerol lejos de la sección micro con una pipeta y agua. </li><li> Cubra la húmeda sección con unas pocas gotas de safranina (1 g de polvo de safranina + 100 ml de agua) y Astrablue (0,5 g de polvo de color azul Astra + 2 ml de ácido acético 100% + 100 ml de agua) para distinguir entre lignificados y no lignificadas estructuras, sino también para mejorar el contraste para el análisis de la imagen subsiguiente. </li><li> Deje que el resto de la sección 5 min cubiertos por el tinte y luego lavarla lejos con una pipeta y el agua de nuevo. </li><li> Tan pronto como se elimina el tinte excesivo, deshidratar la sección con pipetas lavándolas con una secuencia de 75% diluida, 96% y finalmente etanol al 100%. </li><li> Use pipetas para enjuagar las muestras en el portaobjetos de vidrio en lugar de colocar las muestras en un baño para reducir el tiempo de procesamiento para alrededor de dos a 3 min para todo el proceso de deshidratación. NOTA: La deshidratación con etanol evita muestras frágiles se rompan. </li><li> A partir de entonces enjuagar la sección con 100% xilol. NOTA: El xileno es carcinogénico y la ventilación es obligatoria en el laboratorio cuando se utiliza. Otroproductos existen reemplazando xilol, pero si hay intención de almacenar las muestras durante períodos de tiempo más largos (años, décadas) para un nuevo análisis potencial, bálsamo de Canadá (paso 3.5.2) es el medio sólo incrustación que se mantiene clara sin cambiar de color con el tiempo. Desafortunadamente bálsamo de Canadá necesita ser utilizado en combinación con xilol. </li><li> Mientras el xilol se vuelve lechoso (blanquecino), repita el proceso de deshidratación, ya que no es suficientemente deshidratado. </li><li> Tan pronto como el xilol queda claro, cubrir la sección con una caída de 100% bálsamo de Canadá y se cubre con una cubierta de vidrio de al menos el tamaño de la sección. NOTA: Tenga en cuenta la eliminación de las burbujas de aire presionando suavemente el cristal cubierta hacia abajo. </li><li> Colocar el portaobjetos micro resultante entre dos tiras de plásticos resistentes al calor y colocarlo en una placa de metal. Coloque un peso (por ejemplo, un imán) en la parte superior de la diapositiva para presionarlo hacia abajo para mantener la sección plana durante el siguiente proceso de secado. </li><li> Colocar los portaobjetos en un horno a60 ° C durante aproximadamente 12 horas. Después de 12 horas, tome las diapositivas fuera del horno y coloque en un estante para dejar que se enfríen a temperatura ambiente (aproximadamente 20 ° C). Cuando esté fría, retire el peso y la tira de plástico y limpiar la diapositiva utilizando hojas de afeitar para quitar el excedente de bálsamo de Canadá. </li></ol> 4. Visualización del contenido de celdas <ol><li> Prepare la solución Nawashin 25. <ol><li> Preparar una solución de (A) con 5 g de ácido crómico, 50 ml de ácido acético 96%, y 320 ml de agua desionizada. Preparar otra solución (B) con 200 ml de formalina con 175 ml de agua desionizada. </li><li> Mezclar la solución A y la solución B en una proporción de 1: 1 para crear la solución Nawashin. </li></ol></li><li> Para visualizar el contenido celular, fijar la muestra con solución Nawashin durante 10 minutos para detener todos los procesos de degradación dentro de la célula. NOTA: La fijación conserva núcleos de las células que permiten una estimación de la longevidad celular (longevidad celular = núcleos presentes / ausentes núcleos; o la presenciar ausencia del núcleo indica si la célula está viva o muerta). </li><li> Después de la fijación, lavar las secciones con agua para eliminar completamente la solución Nawashin antes de la tinción con safranina-Astra azul y delante de ellos, además, la tinción con azul pícrico-anilina (1 parte de saturado anilina soluble en agua azul + 4 partes de ácido pícrico 10%) . </li><li> Calentar con cuidado la muestra a aproximadamente 80 ° C (en cualquier caso por debajo del punto de ebullición) para acelerar el proceso de tinción. Para la deshidratación y la inclusión de las muestras siguen el protocolo de los pasos 3.4 a 3.8. </li></ol> 5. Preparación de Imágenes Digitales Características anatómicas <ol><li> Crear imágenes digitales de las superficies básicas para el análisis del vaso. <ol><li> Cortar el plano de la superficie del núcleo utilizando el microtomo núcleo y manchar el negro superficie resultante simplemente usando un marcador de fieltro. </li><li> Tan pronto como se seca el colorante, frotar la superficie del núcleo con tiza blanca. Pulse la tiza en las células simplemente frotando la tiza sobre elsuperficie con un dedo. También quite el excedente de la tiza por este procedimiento. NOTA: Como resultado de las paredes celulares son de color negro y las partes del lumen de los vasos son de color blanco. Este contraste es una condición previa para un análisis automatizado de imágenes. </li><li> Coloque el núcleo preparado por debajo de un microscopio binocular equipado con una cámara digital. Tomar una secuencia de ligeramente superpuestas (aprox. 10%) imágenes a partir de un lado del núcleo hasta que se captura toda la superficie. Coser las imágenes individuales para crear una imagen completa de la superficie del núcleo. </li></ol></li><li> Crear imágenes digitales de micro diapositivas <ol><li> Colocar los portaobjetos micro limpiados bajo un microscopio y tomar la superposición de imágenes de toda la sección. </li><li> Definir una amplificación específica dependiendo de las estructuras a analizar, que oscila entre 40X y magnificación 1.000X. </li><li> Coser las imágenes individuales para crear una imagen completa de la sección. Para evitar posibles distorsiones durante el proceso de costura, utilice &quot;; Plan de &quot;-tipo lentes del objetivo con el microscopio. </li></ol></li></ol> 6. Características Cuantificación Anatómicos <ol><li> Para detectar las células y los bordes del anillo utilizando el ROXAS18 imagen herramienta de análisis o software similar, cargar una imagen completa de una sección de la micro y la calibración espacial asociada a la obtención de resultados cuantitativos en unidades métricas. Calcular la calibración espacial midiendo el número de píxeles entre las escalas de un micrómetro de imágenes tomadas de la etapa con la misma ampliación y dividiendo el valor obtenido por el espacio de la escala en unidades métricas (por ejemplo 1000 m). </li><li> Seleccione de la lista proporcionada (siempre en el software) una configuración adecuada antes de comenzar la parte automática del análisis. NOTA: Una configuración es un conjunto previamente optimizada de configuración del programa que, por ejemplo, tiene en cuenta el color de la tinción de la muestra y el tamaño y la forma gama de las células para ser detectado. Configuraciones a la medida por lo tanto,permitir que para producir resultados de reconocimiento óptimas para diferentes especies y calidades de imagen. <ol><li> Seleccione otras opciones, como el empleo de las regiones en la imagen que van a ser incluidos o excluidos para evitar, por ejemplo, los márgenes de imagen en blanco o grietas en la muestra, si es necesario. </li></ol></li><li> Inicie el análisis pulsando el botón Analizar. Si optado, definir regiones en la imagen que se van a incluir o excluir el uso de la herramienta polígono, rectángulo o un círculo. El siguiente análisis automático utiliza algoritmos flexibles para corregir algunas deficiencias imagen (por ejemplo, falta de contraste) y mejorar el contraste basado en la calidad de la imagen. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Los retos de una integración exitosa y sostenible de anatomía de la madera en la investigación dendroecológica son, aparte de problemas analíticos múltiples, sobre todo debido a los aspectos técnicos. Estos desafíos van desde el muestreo principio se acerca a la creación de secciones micro de alta calidad y su posterior análisis 19. A primera vista, la toma de muestras de núcleos o incluso discos es un procedimiento simple que se conoce desde hace muchos años. Hay muchas cosas que se pueden hacer mal y una pequeña imprecisión en el muestreo puede resultar en problemas graves durante las fases de preparación y análisis posteriores. Inexactitudes pequeños, tales como extracción de muestras que no es exactamente perpendicular al eje del vástago o el uso de un descorazonador imperfectamente afilado no son un problema si el objetivo del estudio se limita a sonar de ancho mediciones. Sin embargo, cuando el objetivo para el análisis microscópico de las muestras, una dirección de muestreo incorrecto podría resultar en distorsiones ópticas deparedes celulares, mientras que el uso de Corers romos resultados en micro grietas dentro del núcleo. Como resultado, cuando se trata de cortar micro secciones de estos núcleos, las secciones delgadas se derrumbe y una preparación eficiente ya no está garantizada. Lo mismo es cierto para el muestreo micro-núcleo. Una punta roma dará lugar a alta presión cuando la perforadora está clavado en la madera del tronco. En consecuencia, la capa de cambium será comprimido. Las células del cambium (Figura 5) se exprimido y en consecuencia no pueden ser analizados. Muestreo del disco es sin duda la mejor estrategia en el análisis de las variaciones de crecimiento para relacionarlas con los cambios ambientales. Por desgracia, es simplemente imposible tomar los discos de todos los árboles destinados a muestrear para análisis posteriores. Sin embargo, especialmente en caso de dendrochronology tropical, se necesita una cierta cantidad de discos de tallo en combinación con núcleos de incremento. Los discos se usan como una base para definir los límites de anillo y por esta para apoyar la boundaries definidos basados ​​en el análisis de tacos de crecimiento 12,27,28. Los pros y los contras de lijado frente de corte se discuten con frecuencia 1,11,21. Como se ha mencionado anteriormente, el mejor procedimiento depende siempre de la pregunta de investigación y los parámetros a analizar (macroscópica o microscópica). Si los análisis isotópicos o químicos se proyectan en una etapa de trabajo adicional, es de suma importancia que el polvo abrasivo creado por el lijado que puede llenar en lúmenes de las células en toda la muestra, se retira cuidadosamente con una aspiradora o aire a presión. Cortar micro secciones es para todos microscópica analiza la forma más adecuada de preparación de muestras para análisis adicionales. En primer lugar, la sección se corta la muestra, que luego se puede mantener sin ninguna contaminación potenciales para análisis adicionales. En segundo lugar estas secciones permiten mediciones de alta resolución de los parámetros de una sola célula. Además, evitando la incrustación tiempotécnica mediante el uso de una solución de almidón de maíz 26 para estabilizar las células es una gran ventaja en micro seccionamiento. Una desventaja de micro seccionamiento sigue siendo el tamaño limitado de la muestra resultante en largos tiempos de preparación. Para los análisis de series de tiempo real que se remonta en el tiempo durante siglos o incluso milenios, hay una necesidad de desarrollar más los dispositivos existentes de corte 17,19, pero también de procesamiento de imágenes y análisis de 18. Un primer paso en esta dirección es el desarrollo de la microtomo núcleo 21, fabricado inicialmente para cortar superficies planas sobre núcleos (Figura 1). Pruebas recientes revelaron la capacidad de cortar micro secciones de núcleos enteras usando este dispositivo (Figura 1). Secciones micro de alta calidad proporcionan el principio básico para un análisis de imagen eficaz. Tomando las imágenes en el microscopio es un procedimiento común 19, pero su análisis efectivo sigue siendo una tarea que necesitaun mayor desarrollo 17. Todos los sistemas de análisis de imagen existentes son semi-automática, es decir, tienen que ser más o menos intensamente controlado por el técnico. En muchos casos, las imágenes deben ser corregidos o incluso imágenes nuevas tienen que hacer para mejorar el contraste para un mejor registro de las estructuras por el software sin necesidad de cambiar el grosor de la pared celular dentro de la imagen. Herramientas de análisis de imagen especializados, tales como ROXAS 18, WinCell o secuencias de comandos específicos para ImageJ 29 son capaces de proporcionar datos anatómicos básicos, tales como el número de células, la dimensión célula, espesor de la pared celular y la posición de la celda dentro del anillo anual. Muchos métricas anatómicas adicionales que son relevantes en un contexto dendroecológica se pueden calcular a partir de estas mediciones básicas tales como el tamaño de los conductos más grandes, la distribución del tamaño de los conductos, el tamaño de la madera temprana o de la primera fila de conductos, (óptico) densidad de la madera, intra-anual perfiles de tamaño del conducto y la pared celularde espesor, y patrones de asociación de conductos (solitaria, múltiplos, etc.). Utilizando el software ROXAS 18, los contornos de lumina conducto (es decir, células conductor de agua) y las fronteras anuales anillo se reconocen automáticamente y representan visualmente como superposiciones más de la imagen original. Algoritmos de detección de los conductos se basan en el color, el tamaño y la información de la forma, los algoritmos de detección de fronteras de anillo en el contexto local de cada conducto. Una caja de herramientas nos permite mejorar manualmente estos resultados editando directamente las características de superposición, es decir, la supresión, adición y modificación de las fronteras del anillo y el conducto contornos. Después de la edición, la salida de datos final, incluyendo el espesor de la pared celular (coníferas), se genera y se guarda en una hoja de cálculo de forma automática. Sistemas automatizados totalmente Actualmente no disponible, ni siquiera para las coníferas que muestran una estructura relativamente simple, pero esto es un objetivo para futuros desarrollos. Esto apoyaría firmemente la fuintegración ll de parámetros anatómicos de madera en análisis de series temporales.

Los árboles, así como arbustos, arbustos enanos, e incluso hierbas, muestran patrones de respuesta múltiple relacionados con los cambios en su entorno. Estos patrones han sido objeto de la botánica y fisiología vegetal desde mediados del siglo 19. En aquel entonces, la investigación de plantas leñosas se centró principalmente en los árboles y un análisis descriptivo de la estructura y la variabilidad de los anillos anuales en un contexto ecológico 1. Cuando Andrew Ellicott Douglass inventó la técnica cruzada de citas para la investigación de los anillos 2, este contexto ecológico fue más o menos reprimida por la nueva capacidad de la fecha con precisión los resultados de madera en la arqueología. Cruz-citas por primera vez permitió a la datación exacta de los anillos de árboles al año natural y se hasta ahora considerado como la columna vertebral de la investigación de anillos de árboles en todos los campos de su aplicación 1. Paralelamente, desde finales del siglo 19, anatomía de la madera se convirtió en una disciplina de investigación importante se relacionad para muchos otros campos de las ciencias naturales y aplicadas 3. Dos dominios principales se establecen: la anatomía sistemática madera, que es la base para la identificación de la madera en arqueología 4, y la anatomía de la madera aplicada, relacionados con tecnología de la madera, la fisiología, la patología y la ecología 3,5. En la investigación de anillos de árboles, Dendroecología hoy en día se define como un tema que abarca estudios de anillos de árboles relacionados centrados en estudios ambientales, como los procesos geomorfológicos (Dendrogeomorfología), temperatura y reconstrucciones de precipitación (dendroclimatología), cambios de nivel de agua (dendrohydrology) o incluso fluctuaciones de los glaciares ( dendroglaciology) 6. Como esta definición indica, los análisis de anillos de árboles se han vuelto cada vez más importante en el campo de las citas y la reconstrucción de los procesos ambientales, tales como (i) pasadas condiciones climáticas mediante el análisis de las variaciones anuales en el ring ancho 7,8, densidad de la madera 9 o isótopos 10, o (ii) tque la recurrencia intervalos de procesos geomorfológicos 11. Estos estudios muy detallados sobre las variaciones de anillos de ancho y su contenido isotópico demuestran la necesidad de analizar los anillos con más detalle, es decir, el estudio de la estructura anatómica de los anillos. Sin embargo, los estudios detallados de madera características anatómicas dentro de los anillos anuales relacionados con los cambios ambientales son raros 12,13. Aunque estas características microscópicas se conocen 14, rara vez se han aplicado a nivel microscópico para la investigación dendroecológica. Además, el momento exacto de estas reacciones de crecimiento en árboles cultivados de forma natural, esenciales para los propósitos exactos de citas, rara vez se ha documentado recientemente 15. En cuanto a los efectos del calentamiento global 16, la mejora de los ya existentes y el desarrollo de nuevas técnicas para registrar y cuantificar pasadas y actuales procesos ambientales se requiere, sobre todo en términos de Investigación del Impacto Climático 11.Con la ampliación de la investigación anatómica madera tradicional a una anatomía de la madera con base ecológica 17, dendro-científicos pueden analizar nuevos parámetros y desarrollar nuevas metodologías para entender los efectos a corto y largo plazo los efectos de los factores ambientales específicos sobre la anatomía de las plantas leñosas 18. El conocimiento detallado acerca de las variaciones en los diferentes parámetros de las células dentro de los anillos individuales relacionados con controladores específicos (por ejemplo, fuerzas mecánicas, las variaciones climáticas) es el requisito básico para la comprensión de la variabilidad en la formación de anillos de árboles. En comparación con las mediciones de anillo ancho comunes, la identificación de las variaciones anatómicas de madera requiere técnicas de preparación más complejas y extensas que requieren mucha mano de obra y tiempo. Los procedimientos detallados de corte de la muestra, las manchas, y la inclusión son múltiples y dependen siempre de que el objetivo del estudio 19. Para el análisis macroscópico de ancho de anillos de coníferas o estructuras incluso para el número, tamaño o distribution de naves en maderas duras, la superficie de una muestra se pule comúnmente usando papel de lija fino o rectificadoras especiales 20. Una desventaja de este procedimiento es el llenado de las celdas individuales con el polvo que impide su posterior análisis microscópico semiautomática 21. Los mejores resultados para la preparación de muestras macroscópicas se consiguen cuando la superficie de la muestra se cortan con una cuchilla de afeitar u otro cuchillo afilado. Mientras que para las muestras pequeñas, hojas de afeitar son una herramienta perfecta; muestras más grandes como núcleos requieren el corte de superficies planas en toda la extensión de los núcleos. En contraste con el lijado, las células no se llenan de polvo, que permite además la preparación para el análisis de imágenes sucesivas. Además, el lumen de célula abierta, las paredes celulares adecuadamente cortados, y la superficie plana de la muestra entera permiten la aplicación de la densitometría de alta frecuencia 22 a toda la extensión del núcleo. Para análisis de imágenes, la superficie de las muestras (célulaparedes) se pueden teñir con tinta oscura y el lumen de células abiertas posteriormente se pueden llenar con tiza blanca para mejorar el contraste entre la pared celular y el área del lumen 19,23. Esta bastante simple técnica permite una evaluación macroscópica básica de las estructuras celulares más grandes para las mediciones de tamaño de los buques. Estas técnicas para el corte de superficies planas son suficientes para los análisis macroscópicos. Para una detallada anatómica madera (es decir, microscópica) análisis, microscopía de luz transmitida es el método más común aplicada en ciencias dendro. Células del xilema se diferencian a través de procesos complejos que abarcan la determinación del tipo de célula, la división celular, la diferenciación celular, y muerte celular programada 24. Desde el momento y la velocidad a la que estos procesos ocurren determinar las características anatómicas de células, las condiciones ambientales que afectan a estos procesos pueden generar desviaciones anatómicas en la estructura del anillo. Como una condición importante para ellos analizans, micro secciones tienen que estar preparados con un micrótomo 19. Cuando la preparación de muestras para seccionar, la visibilidad de la dirección de traqueidas o fibra es crucial. Se recomienda el uso de deslizamiento impulsado micrótomos mano para cortar secciones micro porque esta técnica facilita secciones de alta calidad como sea necesario para una imagen análisis 19. Dependiendo del objetivo específico de un determinado estudio, micro se cortan secciones perpendicular o paralelo a la extensión longitudinal de las células. Estas secciones se fotografiaron por debajo de un microscopio y dimensiones de la celda medidos utilizando una imagen especializada análisis de software. Hasta hace poco, la capacidad de preparar micro secciones se restringió a los pequeños tamaños de muestra solamente (aproximadamente 1 cm x 1 cm). Esto es aceptable para analizar los eventos individuales como disturbios en años concretos, pero esta técnica no permite el análisis de series de tiempo prolongado necesario para reconstrucciones ambientales. Este esfuerzo sólo puede darse cuentaD a través del desarrollo de nuevos, eficientes y económicos los procedimientos de preparación y técnicas analíticas. En los últimos años, los miembros del laboratorio de anillos de árboles en el Swiss WSL Instituto Federal de Investigaciones en Suiza han iniciado un intenso trabajo sobre este tema. Como resultado, los nuevos dispositivos y técnicas de análisis han sido desarrollados para apoyar la idea de la integración de características anatómicas de la madera a una amplia gama de temas de investigación ambiental.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1096">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:147px;">Increment corer</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:659px;">http://www.haglofinc.com/index.php?option=com_content&#38;view=article 
			&#38;id=57&#38;Itemid=88&#38;lang=en</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Core-Microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laboratory microtome</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trephor micro corer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://intra.tesaf.unipd.it/Sanvito/trephorEn.asp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nawashin solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ten parts 1% chromic acid, four parts 4% formaldehyde and one part acetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Picric-Anilin blue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>One part saturated aniline blue and four parts Trinitrophenol dissolved in 95% ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Safranin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Empirical Formula (Hill Notation) C20H19ClN4&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Astra-blue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Empirical Formula (Hill Notation) C47H52CuN14O6S3&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Linear Formula CH3CH2OH&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Xylol (Xylene)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Linear Formula C6H4(CH3)2&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Canada Balsam</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Embedding solution for microscopy</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Roxas Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://www.wsl.ch/dienstleistungen/produkte/software/roxas/index_EN</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ImageJ Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">WinCell</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://imagej.nih.gov/ij/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a technical perspective in modern tree-ring research - how to overcome dendroecological and wood anatomical challenges

Investigación dendroecológica utiliza la información almacenada en los anillos de árboles para entender cómo los árboles individuales e incluso los ecosistemas forestales enteras respondieron a los cambios ambientales y para finalmente reconstruir dichos cambios. Esto se hace mediante el análisis de las variaciones de crecimiento atrás en el tiempo y correlacionar diversos parámetros específicos de la instalación a (por ejemplo) los registros de temperatura. La integración de la madera parámetros anatómicos en estos análisis reforzaría reconstrucciones, incluso hasta resolución intra-anual. Por lo tanto, presentamos un protocolo sobre cómo muestrear, preparar y analizar muestras de madera para el análisis macroscópico comunes, sino también para los análisis microscópicos posteriores. Además se introduce una solución potencial para el análisis de imágenes digitales generadas a partir de muestras pequeñas y grandes comunes para apoyar el análisis de series de tiempo. El protocolo presenta los pasos básicos, ya que en la actualidad se pueden utilizar. Más allá de esto, hay una necesidad continua para la mejora de las técnicas existentes, y el desarrollo de la nueva techniques, para registrar y cuantificar los procesos ambientales pasados ​​y presentes. Investigación anatómica de madera tradicional necesita ser ampliado para incluir información ecológica para este campo de investigación. Esto apoyaría dendro-científicos que tengan la intención de analizar nuevos parámetros y desarrollar nuevas metodologías para comprender los efectos a corto y largo plazo de los factores ambientales específicos sobre la anatomía de las plantas leñosas.

Todos los análisis dendroecológicos dependen de muestras precisas, no importa si se toman discos, de los machos o núcleos de micro. Para ello, los dispositivos deben estar en perfecto estado (afilado con precisión) para evitar microfisuras dentro de la muestra de madera. En la preparación de superficies en tacos de crecimiento, el uso de un micrótomo núcleo es esencial. La capacidad de tener células abiertas, que se pueden tratar más para mejorar el contraste para los análisis de imagen y mediciones del tamaño de recipiente (Figura 1), es un primer paso importante hacia la adaptación de las estructuras anatómicas en tiempo de análisis de series. A veces la densidad de una muestra de madera dura impide el uso de un micrótomo. En ese caso, un pulido adecuado y la posterior eliminación de serrín excesiva de los vasos con un compresor o de vacío es la mejor opción. Para un análisis más detallado de las estructuras celulares más pequeños como la madera temprana y traqueidas de madera tardía en las coníferas, se necesitan secciones micro de alta calidad. Aquí, potentiAL artefactos tales como paredes celulares secundarias se despojaron de la necesidad de la pared primaria debe ser evitado (Figura 2). Si se producen estos artefactos en las imágenes digitales, un análisis automatizado de las dimensiones de la celda ya no es posible. Los artefactos a continuación, deben ser corregidos manualmente, lo que requiere mucho tiempo y en la mayoría de los casos los resultados en las mediciones incorrectas de dimensiones de la celda. La simple aplicación de un fluido no newtoniano, es decir, una solución de almidón de maíz, a la parte superior de la muestra es compatible con la estabilidad de la estructura, mientras que la reducción de la aparición de artefactos a un mínimo (Figura 2) 26. Esta aplicación de almidón de maíz, adecuado para todas las muestras de madera incluyendo especies tropicales, hace que la aplicación del procedimiento de incrustación de las muestras antes de cortar redundante. Secciones Micro permiten una determinación más seguro de los anillos anuales. Este es especialmente el caso para las coníferas que crecen en sus límites naturales, es decir &lt;/ Em&gt;, en la línea de árboles en las zonas de alta montaña. Extremadamente anillos estrechos son frecuentes y difíciles de detectar macroscópicamente (Figura 3). En casos extremos, los anillos consisten en una o dos filas de células de la madera temprana y una fila de células de la madera tardía aplanadas, que carecen de (en contraste con las células de la madera tardía comunes) paredes celulares engrosadas. Para esto son mejores o incluso sólo visible cuando se utiliza micro secciones. Además, las fluctuaciones de densidad se pueden diferenciar de Límites de anillos más claramente, lo que simplifica la detección de los anillos anuales, especialmente en el Mediterráneo y en los trópicos (Figura 3). Cuando el análisis de imágenes con un aumento de 40X o más, las células individuales son visibles y el espesor de sus paredes celulares también es detectable. Software de análisis semi-automática permite la medición de parámetros específicos a lo largo de trayectorias definidas siguiendo la dirección de su desarrollo temporal y espacial (Figura 4). Con esto, Changes de parámetros individuales tales como el lumen de células o espesor de la pared celular se pueden determinar en toda la extensión de un anillo anual (Figura 4). Esto se puede hacer para todos los anillos visibles dentro de la imagen y esto es totalmente compatible con la necesidad de un análisis de series de tiempo prolongado. Análisis de imagen también se pueden utilizar para determinar las fases de desarrollo de los anillos anuales dentro del período de vegetación (Figura 5). Al analizar la imagen de una sección teñida con safranina y Astra-azul usando luz polarizada, incluso las diferentes etapas de lignificación, a partir de las esquinas más exteriores de las paredes de las células hasta que la lignificación completa de la pared celular secundaria, se hacen visibles. Esto se debe a las paredes lignificadas celulares (maduro) brillan en luz polarizada (Figura 5). La información detallada se puede relacionar con los datos ambientales documentados para el período de vegetación correspondiente para determinar, por ejemplo, una más detallada relati clima-crecimiento<html> onship. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52337/52337fig1.jpg" /> Figura 1. Ejemplos de una sección de micro y una superficie plana preparada de un roble incluyendo el anillo de anchura y mediciones del tamaño de los vasos Izquierda:. Ultraperiférica parte de un núcleo mínimo de la subasta de roble. El núcleo de 5 mm de diámetro se cortó usando un microtomo núcleo. La superficie estaba manchada negro con un marcador de fieltro y las células se llena con tiza blanca después de la mancha estaba seco. Derecha: el gráfico se indica mediciones de anillo de anchura y de tamaño de recipiente de hecho en la superficie del núcleo se muestra a la izquierda. No hizo falta ninguna secciones micro para hacer estas mediciones debido a la superficie transparente creado por el microtomo núcleo (modificado después de 21). Abajo: sección Micro cortaron un núcleo mínimo de la subasta, manchado, deshidratado y fijo en bálsamo de Canadá. Espesor: 20 micras, longitud: 25 cm.<html> g &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52337/52337fig2.jpg" /> Figura 2. Imágenes de micro secciones cortadas sin estabilización frente a un corte sección utilizando la solución de almidón de maíz Izquierda:. Sección Micro mostrando corte artefactos en las traqueidas de la madera temprana de una conífera. La muestra se cortó sin incorporar y como resultado las paredes secundarias en lugar delgadas de las células de la madera temprana se divide fuera de la pared primaria (flechas azules). Derecha: Micro sección sin artefactos en las traqueidas de la madera temprana de una conífera. Esta sección (misma muestra, como se muestra a la izquierda) se cortó después de aplicar la solución de almidón de maíz con un pincel en la parte superior de la superficie de la muestra. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52337/52337fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> ove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52337/52337fig3.jpg" /> . Figura 3. Ejemplos de límites de los anillos anuales difícilmente detectable Izquierda: Micro sección de un núcleo de incremento (aquí: Larix decidua) que muestra un límite anillo (flecha negro) se indica por una sola hilera de células de la madera tardía aplanados sin ningún engrosamiento de las paredes celulares. Este anillo no sería visible macroscópicamente. Derecha: fluctuaciones de densidad intra-anuales (flecha blanca) son comunes en especies mediterráneas (micro sección: Quercus ilex). El cambio gradual de la estructura de la célula hacia la madera tardía y de nuevo a la estructura de madera temprana (flecha blanca) permite diferenciar las fluctuaciones de densidad de los límites de los anillos reales (flecha negro). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52337/52337fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 4. Ejemplo de área de la luz y de la medición de espesores de pared dentro de un anillo anual de una conífera Top:. Recortables imagen que muestra un resultado de ejemplo de análisis ROXAS en un anillo de árbol de Pinus sylvestris (pino silvestre). Fronteras anillo se muestran en amarillo y se dispone de lumina traqueida en cian. Para un archivo radial (azul lumina traqueida) el espesor de la pared celular de medición está representado por círculos rojos. Barra de escala = 100 micras Negro. Conclusión:. Los cambios intra-anual en el área lumen traqueida y grosor traqueida pared celular para todo el anillo anual <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52337/52337fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52337/52337fig5.jpg" /> Figura 5. example de un anillo anual de formación. La imagen ha sido capturada bajo un microscopio óptico con luz polarizada de una sección micro manchado safranina y Astra-azul obtenido de un micro-núcleo muestreado el 7 de julio, 2007 a ​​partir de una Larix decidua creciente en el Lötschental a 1.300 m sobre el nivel del mar. En esta sección micro las células del cambium, las células en la fase de la ampliación, las células en la fase de engrosamiento de la pared y las células maduras son reconocibles. El ancho tangencial de la imagen cubre ~ 1 mm de la sección transversal del xilema. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52337/52337fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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A Technical Perspective in Modern Tree-ring Research - How to Overcome Dendroecological and Wood Anatomical Challenges

Here we present a protocol outlining how to sample wooden specimens for the overall assessment of their growth structures. Macro- and microscopic preparation and visualization techniques necessary to generate well-replicated and highly resolved wood anatomical and dendroecological dataset, are described are described.

Una Perspectiva Técnica en Modern Árbol-anillo de Investigación - Cómo superar dendroecológica y madera anatómicas Desafíos

Dendroecological research uses information stored in tree rings to understand how single trees and even entire forest ecosystems responded to ...

a-technical-perspective-modern-tree-ring-research-how-to-overcome

Research

JoVE Journal

Environment

28.8K vistas.  Swiss Federal Research Institute WSL. Here we present a protocol outlining how to sample wooden specimens for the overall assessment of their growth structures. Macro- and microscopic preparation and visualization techniques necessary to generate well-replicated and highly resolved wood anatomical and dendroecological dataset, are described are described.

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Design and Construction of an Urban Runoff Research Facility

As the urban population increases, so does the area of irrigated urban landscape. Summer water use in urban areas can be 2-3x winter base line water use due to increased demand for landscape irrigation. Improper irrigation practices and large rainfall events can result in runoff from urban landscapes which has potential to carry nutrients and sediments into local streams and lakes where they may contribute to eutrophication. A 1,000 m2 facility was constructed which consists of 24 individual 33.6 m2 field plots, each equipped for measuring total runoff volumes with time and collection of runoff subsamples at selected intervals for quantification of chemical constituents in the runoff water from simulated urban landscapes. Runoff volumes from the first and second trials had coefficient of variability (CV) values of 38.2 and 28.7%, respectively. CV values for runoff pH, EC, and Na concentration for both trials were all under 10%. Concentrations of DOC, TDN, DON, PO4-P, K+, Mg2+, and Ca2+ had CV values less than 50% in both trials. Overall, the results of testing performed after sod installation at the facility indicated good uniformity between plots for runoff volumes and chemical constituents. The large plot size is sufficient to include much of the natural variability and therefore provides better simulation of urban landscape ecosystems.

This paper describes the design, construction, and function of a 1,000 m2 facility containing 24 individual 33.6 m2 field plots equipped for measuring total runoff volumes with time and collection of runoff subsamples at selected intervals for quantification of chemical constituents in the runoff water from simulated home lawns.

Diseño y Construcción de un Centro de Investigación La escorrentía urbana

As the urban population increases, so does the area of irrigated urban landscape. Summer water use in urban areas can be 2-3x winter base line water use ...

Investigación

Medio ambiente

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. The standardized sampling component of the method concentrates viruses that may be present in water by passage of a minimum specified volume of water through an electropositive cartridge filter. The minimum specified volumes for surface and finished/ground water are 300 L and 1,500 L, respectively. A major method limitation is the tendency for the filters to clog before meeting the sample volume requirement. Studies using two different, but equivalent, cartridge filter options showed that filter clogging was a problem with 10% of the samples with one of the filter types compared to 6% with the other filter type. Clogging tends to increase with turbidity, but cannot be predicted based on turbidity measurements only. From a cost standpoint one of the filter options is preferable over the other, but the water quality and experience with the water system to be sampled should be taken into consideration in making filter selections.

EPA Method 1615 uses an electropositive filter to concentrate enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. This manuscript describes the procedure for collecting samples for Method 1615 analyses.

Método EPA 1615. La medición de enterovirus y norovirus Ocurrencia en agua por cultura y RT-qPCR. I. Colección de ejemplos de virus

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

Preparation and Testing of Plant Seed Meal-based Wood Adhesives

Recently, the interest in plant seed meal-based products as wood adhesives has steadily increased, as these plant raw materials are considered renewable and environment-friendly. These natural products may serve as alternatives to petroleum-based adhesives to ease environmental and sustainability concerns. This work demonstrates the preparation and testing of the plant seed-based wood adhesives using cottonseed and soy meal as raw materials. In addition to untreated meals, water washed meals and protein isolates are prepared and tested. Adhesive slurries are prepared by mixing a freeze-dried meal product with deionized water (3:25 w/w) for 2 hr. Each adhesive preparation is applied to one end of 2 wood veneer strips using a brush. The tacky adhesive coated areas of the wood veneer strips are lapped and glued by hot-pressing. Adhesive strength is reported as the shear strength of the bonded wood specimen at break. Water resistance of the adhesives is measured by the change in shear strength of the bonded wood specimens at break after water soaking. This protocol allows one to assess plant seed-based agricultural products as suitable candidates for substitution of synthetic-based wood adhesives. Adjustments to the adhesive formulation with or without additives and bonding conditions could optimize their adhesive properties for various practical applications.

To facilitate the effort in seeking more economic and environment-friendly formulations of natural product-based wood adhesives, this work demonstrates the preparation and testing of plant seed-based wood adhesives. This protocol allows one to assess plant seed-based agricultural products as suitable candidates for the substitution of synthetic-based wood adhesives.

Preparación y Pruebas de Adhesivos madera a base de comidas-Semilla de plantas

Recently, the interest in plant seed meal-based products as wood adhesives has steadily increased, as these plant raw materials are considered renewable ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

Método EPA 1615. La medición de enterovirus y norovirus Ocurrencia en agua por cultura y RT-qPCR. Parte III. Detección de virus por RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Administering and Detecting Protein Marks on Arthropods for Dispersal Research

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ecological interactions. Arthropods are usually tracked in nature by tagging them with a unique mark and then re-collecting them over time and space to determine their dispersal capabilities. In addition to actual physical tags, such as colored dust or paint, various types of proteins have proven very effective for marking arthropods for ecological research. Proteins can be administered internally and/or externally. The proteins can then be detected on recaptured arthropods with a protein-specific enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Here we describe protocols for externally and internally tagging arthropods with protein. Two simple experimental examples are demonstrated: (1) an internal protein mark introduced to an insect by providing a protein-enriched diet and (2) an external protein mark topically applied to an insect using a medical nebulizer. We then relate a step-by-step guide of the sandwich and indirect ELISA methods used to detect protein marks on the insects. In this demonstration, various aspects of the acquisition and detection of protein markers on arthropods for mark-release-recapture, mark-capture, and self-mark-capture types of research are discussed, along with the various ways that the immunomarking procedure has been adapted to suit a wide variety of research objectives.

Proteins are often used to mark arthropods for dispersal research. Methods for administering internal and external protein marks on arthropods are demonstrated. Protein mark detection techniques, either through indirect or sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), are also illustrated.

Administrar y Detección de Marcas de proteínas de Artrópodos de Dispersión de Investigación

Monitoring arthropod movement is often required to better understand associated population dynamics, dispersal patterns, host plant preferences, and other ...

How to Create Conditioned Taste Aversion for Grazing Ground Covers in Woody Crops with Small Ruminants

Conditioned taste aversion (CTA) is a learning behavior process where animals are trained to reject certain feed after gastrointestinal discomfort has been produced. Lithium chloride (LiCl) is the preferred agent used in livestock to induce CTA because it specifically stimulates the vomit center. In addition, LiCl is commercially available, and easy to prepare and administer using a drenching gun. Nevertheless, some factors have to be considered to obtain an effective long-lasting CTA, which allows small ruminants to graze during the cropping season. A key aspect is to use animals with no previous contact with the target plant (the plant chosen to be avoided; new feed). Due to their native neophobic feeding behavior, small ruminants can easily associate the negative feedback effects with the new feed, resulting in a strong and persistent CTA. The recommended doses are 200 and 225 mg LiCl/kg body weight (BW) for goats and sheep, respectively. To induce CTA, 100 g of the target plant should be individually offered for at least 30 min, and LiCl administered thereafter if the intake is greater than 10 g. Each time the animal eats the target plant without negative consequences, the CTA becomes weaker. Consequently, to minimize the risk of target plant consumption, it is essential to have sufficient palatable ground cover available. The presence of an alternative feed (of quality and quantity) prevents the accidental consumption of the target plant. A close monitoring of the flock is recommended to remove and re-dose any animal consuming more than 4 bites or 10 g of the target plant. At the beginning of each grazing season, check the CTA status of each animal before moving them to the crop.

Feeding behavior preferences in livestock can be modified to implement a grazing management plan in woody crops. Here, we present a protocol to show a lithium chloride dose after eating a new plant that induces conditioned taste aversion.

Cómo crear la aversión condicionada al sabor para el pastoreo Cubiertas de Tierra en cultivos leñosos procedentes de pequeños rumiantes

Conditioned taste aversion (CTA) is a learning behavior process where animals are trained to reject certain feed after gastrointestinal discomfort has ...

Basic Research in Plasma Medicine - A Throughput Approach from Liquids to Cells

In plasma medicine, ionized gases with temperatures close to that of vertebrate systems are applied to cells and tissues. Cold plasmas generate reactive species known to redox regulate biological processes in health and disease. Pre-clinical and clinical evidence points to beneficial effects of plasma treatment in the healing of chronic ulcer of the skin. Other emerging topics, such as plasma cancer treatment, are receiving increasing attention. Plasma medical research requires interdisciplinary expertise in physics, chemistry, and biomedicine. One goal of plasma research is to characterize plasma-treated cells in a variety of specific applications. This includes, for example, cell count and viability, cellular oxidation, mitochondrial activity, cytotoxicity and mode of cell death, cell cycle analysis, cell surface marker expression, and cytokine release. This study describes the essential equipment and workflows required for such research in plasma biomedicine. It describes the proper operation of an atmospheric pressure argon plasma jet, specifically monitoring its basic emission spectra and feed gas settings to modulate reactive species output. Using a high-precision xyz-table and computer software, the jet is hovered in millisecond-precision over the cavities of 96-well plates in micrometer-precision for maximal reproducibility. Downstream assays for liquid analysis of redox-active molecules are shown, and target cells are plasma-treated. Specifically, melanoma cells are analyzed in an efficient sequence of different consecutive assays but using the same cells: measurement of metabolic activity, total cell area, and surface marker expression of calreticulin, a molecule important for the immunogenic cell death of cancer cells. These assays retrieve content-rich biological information about plasma effects from a single plate. Altogether, this study describes the essential steps and protocols for plasma medical research.

A high-throughput cold physical plasma treatment protocol of liquids and cells is shown. It involves setting up different feed gas compositions for plasma ignition, measuring the plasma&#39;s emission spectra, and the subsequent analysis of liquids and cellular activity after plasma treatment.

Investigación básica en medicina de Plasma - un enfoque de rendimiento de procesamiento de líquidos a las células

In plasma medicine, ionized gases with temperatures close to that of vertebrate systems are applied to cells and tissues. Cold plasmas generate reactive ...

Sampling Soils in a Heterogeneous Research Plot

Soils are highly heterogeneous. In general, the number of soil samples required for soil research has always been determined arbitrarily and the associated accuracy is unknown. Here, we present a detailed protocol for efficient and clustered soil sampling in a research plot and, relying on a pilot sampling using this design, for demonstrating soil spatial heterogeneity and informing reasonable sample sizes and associated accuracy for future study. The protocol mainly comprises four steps: sampling design, field collection, soil analysis, and geostatistical analysis. The step-by-step procedure is modified according to former publications. Two examples will be presented to demonstrate contrasting spatial distributions of soil organic carbon (SOC) and soil microbial biomass carbon (MBC) under different management practices. In addition, we present a strategy to determine the sample size requirement (SSR) given a certain level of accuracy based on the plot-level coefficient of variation (CV). The field sampling protocol and the quantitative determination of the sample size will assist researchers in seeking feasible sampling strategies to meet research needs and resources' availability.

The traditional soil-sampling procedure determines the number of soil samples arbitrarily. Here, we provide a simple yet efficient clustered soil-sampling design to demonstrate soil spatial heterogeneity and quantitatively determine the number of soil samples required and the associated sampling accuracy.

Parcela de muestreo de suelos en una investigación heterogéneo

Soils are highly heterogeneous. In general, the number of soil samples required for soil research has always been determined arbitrarily and the ...

Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water distribution in plant tissues in combination with freeze fixation techniques using liquid nitrogen (LN2). For woody species, however, preparations for observing the xylem transverse-cut surface involve some difficulties due to the orientation of wood fibers. Additionally, higher tension in the water column in xylem conduits can occasionally cause artifactual changes in water distribution, especially during sample fixation and collection. In this study, we demonstrate an efficient procedure to observe the water distribution within the xylem of woody plants in situ&#160;by using a cryostat and cryo-SEM. At first, during sample collection, measuring the xylem water potential should determine whether high tension is present in the xylem conduits. When the xylem water potential is low (&#60; ca. &#8722;0.5 MPa), a tension relaxation procedure is needed to facilitate better preservation of the water status in xylem conduits during sample freeze fixation. Next, a watertight collar is attached around the tree stem and filled with LN2&#160;for freeze fixation of the water status of xylem. After harvesting, care should be taken to ensure that the sample is preserved frozen while completing the procedures of sample preparation for observation. A cryostat is employed to clearly expose the xylem transverse-cut surface. In cryo-SEM observations, time adjustment for freeze-etching is required to remove frost dust and accentuate the edge of the cell walls on the viewing surface. Our results demonstrate the applicability of cryo-SEM techniques for the observation of water distribution within xylem at cellular and subcellular levels. The combination of cryo-SEM with non-destructive in situ observation techniques will profoundly improve the exploration of woody plant water flow dynamics.

Observing the water distribution within the xylem provides significant information regarding water flow dynamics in woody plants. In this study, we demonstrate the practical approach to observe xylem water distribution in situ&#160;by using a cryostat and cryo-SEM, which eliminates artifactual changes in the water status during sample preparation.

Distribución de agua de Xylem en plantas leñosas visualizada con un microscopio electrónico de barrido crio-

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water ...

A Guide to Concentration Alternating Frequency Response Analysis of Fuel Cells

An experimental setup capable of generating a periodic concentration input perturbation of oxygen was used to perform concentration-alternating frequency response analysis (cFRA) on proton-exchange membrane (PEM) fuel cells. During cFRA experiments, the modulated concentration feed was sent to the cathode of the cell at different frequencies. The electric response, which can be cell potential or current depending on the control applied on the cell, was registered in order to formulate a frequency response transfer function. Unlike traditional electrochemical impedance spectroscopy (EIS), the novel cFRA methodology makes it possible to separate the contribution of different mass transport phenomena from the kinetic charge transfer processes in the frequency response spectra of the cell. Moreover, cFRA is able to differentiate between varying humidification states of the cathode. In this protocol, the focus is on the detailed description of the procedure to perform cFRA experiments. The most critical steps of the measurements and future improvements to the technique are discussed.

We present a protocol for concentration alternating frequency response analysis of fuel cells, a promising new method of studying fuel cell dynamics.

Una guía para la concentración Análisis de respuesta de frecuencia alterna de células de combustible

An experimental setup capable of generating a periodic concentration input perturbation of oxygen was used to perform concentration-alternating frequency ...