Name: a technical perspective in modern tree-ring research - how to overcome dendroecological and wood anatomical challenges
Uploaded: 2015-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
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The authors would like to acknowledge the effort of Sandro Lucchinetti (Schenkung Dapples, Z&#252;rich) for constructing the devices needed to guarantee progress in sample preparation.

1.サンプリング技術<ol><li>コアサンプリング<ol><li>サンプリングの木の茎のために、それぞれがその成長発達を分析するために、幹から増分コアラーを使用して、少なくとも2つのコアを抽出する。一般的な気候再構成はコアが斜面に平行に取るために、 例えば 、研究課題上のサンプリングの位置を変更します。熱帯種で作業する場合、少なくとも3つ以上のコアを取る。 </li><li>先鋭化増分コアラ（直径5、10または12ミリメートル）を使用し、ステムの成長軸に垂直なコアラを置く。 注：ツリーにそれを掘削する際、その回転以外のコアラの動きを避けるために、プッシャーを使用して、コアラの制御され、安定した位置を持っている。幹に穴髄へとを介してすべての方法。コア非常に密度の高い木（ すなわち 、熱帯種）に、Diospyrusのebenumなどのコアにも密な森の中に許可する増分コアのアダプター（黒檀）で特別な再構成チェーンソー体を使用しています。&lt;/ LI&gt; <li>抽出器を使用し、木から生じるコアを取り除く。コアラを切り、茎から取り外します。 </li><li>その後コア上に直接配置されているテープ、上の書き込みによってソフト鉛筆を使用して抽出コアに特定のIDを追加します。ステムの反​​対側に手順を繰り返します。 </li><li>ツリーの2つのサンプルは、任意の損傷を防ぐためにプラスチックや紙管または特殊な箱に保管してください。 注：これらは、成形からコアを防ぐため、紙のストローは、熱帯の環境では特に有益である。 </li><li>最後に、木製の支持梁上のコア（繊維方向直立）をマウント。冷たい水に強い木材接着剤を使用し、それらを乾燥させます。 注：研究の目的は、さらなる化学、同位体または密度分析が含まれている場合は、木製の支持体上のコアを取付けないでください。これらの目的のために、オープンケーブル導管または片面段ボードでコアを固定します。 </li></ol></li><li>マイクロコアサンプリング<ol><li>特殊なパンチングデバイスを使用して、または2ミリメートルの開口部と針。樹皮の厚さに応じて、樹皮の必要な部分を除去するためにノミを使用しています。 </li><li>上記のように茎の成長軸に垂直なデバイスを配置し、深さ約2​​cmまで茎の木部に浸透するハンマーを使用しています。 </li><li>ツール内部の結​​果のマイクロコアを破壊し、ステムから削除するには、針を回します。マイクロ遠心バイアルにマイクロコアを保存し、それらにラベルを付ける。 </li></ol></li><li>ディスクのサンプリング<ol><li>特殊なケースでは（特に熱帯で）、 例えば切り株や倒木や、可能な限りのサンプリング時に、チェーンソーでディスク（成長軸に垂直な断面）を取る。単純にディスクにラベルを付け、さらなる分析まで保管してください。 注：このサンプリング手順は、最も一般的に増分corersの使用を許可していないすべてのドライ死んで、歴史的、考古学的およびサブ化石材料としてだけでなく、非常に密度の高い広葉樹のために適用されます。 </li></ol&gt; </li></ol> 2.試料の調製<ol><li>サンディングディスク<ol><li>サンディングマシンにディスクを置き、120、220、300グリット続いて、80グリットのサンドペーパーから開始し、次第に細かい砥粒の配列を用いて表面を研削する。 400グリットを有する最終研磨は、ほとんどの針葉樹のために十分である。広葉樹、特に熱帯種のために、成長リングの境界を区別するために1200にサンディンググリッツを使い切る。 </li></ol></li><li>コア上平面切断面<ol><li>彼らの全体の範囲にわたってコア上の平面の表面をカットする可能新たに開発したコアミクロトームのコアホルダーの増加コアを固定してください。 注：ミクロトームのナイフに直角である直立試料の繊維方向を持つようにホルダー内のコアの向きを修正してください。 </li><li>それは少しブレードに接触するまでコアを持ち上げます。 CUにコアの範囲を越えたボールベアリングのガイダンスに固定されているブレードを、プル上部の最初の部分をオフトン。 </li><li> 、コアの後ろにナイフを押し戻すコア約10μmで試料ホルダーを持ち上げ、切断手順を繰り返します。コアの直径の約3分の1は、連続平面になり伐採されるまで、これを行います。 </li></ol></li><li>トウモロコシデンプ​​ン溶液を添加することによって、マイクロ切片を調製した。 <ol><li>解剖学的構造の詳細な画像解析のために、固定コアまたは他のサンプルは、ミクロトームのホルダーでディスクから分離する。サンプルの上部の縁に新たに開発されたスレッジミクロトームのボールベアリング指導によって導かミクロトーム刃を、置き、その上に引き出します。 </li><li>約20から30μmでサンプルを持ち上げて、もう一度サンプル上のブレードを引っ張ってブレードを押し戻す。サンプルの上に連続面が作成されるまで、この手順を繰り返します。 </li><li>コー​​ンスターチ溶液（コーンスターチ10gを、8mlの水、および100％のグリセロ7gので得られた表面を覆う一般的なブラシ付きL）。 NOTE：デンプン粒は、薄切片のその後の切断のための構造を安定化するために、サンプルの気泡を埋める。 </li><li> 、15μmでサンプルを持ち上げ、試料の表面にブラシを配置し、（ブラシ下）薄い部分を切断し始めてサンプルに向かってゆっくりと刃を引っ張る。カットしながら、結果のセクションでは、ブラシによって導かブレード上を摺動する。 </li><li>セクション全体が切断されると、ブラシと水とブレードからマイクロセクションを削除（摩擦を低減するために）、さ​​らなる製造のためのガラススライド上のセクションを配置。乾燥するのを防ぐために、グリセロールの少量（33％= 100％グリセロールの一部と水の2つの部分）を使用して、それらをカバー。 </li></ol></li></ol> 3.マイクロスライドの準備<ol><li>恒久的なスライドの以下の調製のために、第1ピペットと水でマイクロセクションから離れてグリセロールを洗う。 </li><li>ぬれたSEをカバーリグニンと非木質化を区別するサフラニン（サフラニン粉末+ 100mlの水を1g）とAstrablue（100％酢酸+水100mlのアストラ青色粉末+ 2mlを0.5g）を数滴とction構造だけでなく、後続の画像解析のためのコントラストを向上させる。 </li><li>色素によってカバーされ、5分間のセクション残りをしましょう​​と、再びピペットと水で洗い流す。 </li><li>できるだけ早く過度色素が除去されるように、希釈し、75％、96％の配列、最後に100％エタノールでそれらを洗浄することにより、ピペットのセクションを脱水する。 </li><li>使用ピペット全体ではなく、脱水処理には約2〜3分の処理時間を短縮する浴中に試料を配置するスライドガラスでサンプルをリンスする。 注：エタノールで脱水が破損脆弱なサンプルを防ぎます。 </li><li>その後、100％のキシロールでセクションをすすぐ。 注：キシレンは発癌性であり、それを使用する際に換気が実験室で必須である。その他製品が置き換えキシロールに存在するが、潜在的な再分析のために、より長い期間（数年、数十年）にわたってサンプルを記憶する意図がある場合には、カナダバルサム（ステップ3.5.2）が時間の経過とともに色を変化させずに透明なままでのみ包埋剤である。残念ながら、カナダバルサムはキシロールと組み合わせて使用​​する必要があります。 </li><li>それは十分に脱水ない限りキシロールは（白っぽい）乳白色を回すように、脱水処理を繰り返します。 </li><li>とすぐにキシロールを明確にとどまるように、100パーセントカナダバルサムの低下にセクションをカバーし、セクションの少なくとも大きさのカバーガラスでそれをカバーしています。 注：静かにカバーガラスを下に押して、気泡を除去することに注意してください。 </li><li>耐熱性プラスチックの2のストリップ間に生じるマイクロスライドを置き、金属板の上に置きます。次の乾燥工程中に平坦部を維持するためにそれを下に押してスライドの上に（ 例えば 、磁石）の重量を配置します。 </li><li>オーブン中でスライドを配置する約12時間60℃である。 12時間後、オーブンからスライドを取るし、それらをRT（約20℃）に冷却できるように棚の上に置きます。ときにクール、重量及びプラスチックストリップを削除し、余剰カナダバルサムを削除するにはかみそりの刃を使用してスライドをクリーニングします。 </li></ol> 4.セルの内容を可視化<ol><li> Nawashin液25を準備します。 <ol><li>クロム酸5gを、96％酢酸50mlおよび脱イオン水320mlの溶液（A）を調製する。の脱イオン水175ミリリットルとホルマリン200mlで別の溶液（B）を準備します。 </li><li> Nawashinソリューションを作成するために1：1の比で溶液Aと溶液Bを混合する。 </li></ol></li><li>セルの内容を視覚化するために、セル内のすべての分解プロセスを停止し、10分間Nawashin溶液で試料を固定する。 注：;存在oを固定、細胞寿命（電池寿命=核存在/核不在の推定を可能にする細胞核を保持核のR不在）は、細胞が生きているか死んでいるかどうかを示します。 </li><li>固定後、完全にサフラニンアストラブルーでそれらを染色する前に、さらにピクリン、アニリンブルー（1部飽和水溶性アニリン10％ピクリン酸4部+青）でそれらを染色しNawashin溶液を除去し、水で切片を洗浄。 </li><li>慎重に染色処理を加速するために約80℃（沸点以下のいずれの場合において）に試料を加熱する。サンプルの脱水と埋め込むためのプロトコルは3.4から3.8の手順に従ってください。 </li></ol> 5.解剖学的特徴のデジタル画像を準備する<ol><li>血管解析のためにコア表面のデジタル画像を作成します。 <ol><li>コアミクロトームを用いてコア表面平面を切断し、単にフェルトマーカーを用いて得られた表面の黒色を染色。 </li><li>できるだけ早く染料が乾燥するように、白亜、コアの表面をこする。単に上のチョークをこすって細胞内のチョークを押す指を用いて表面。また、この手順によって余剰チョークを削除します。 注：細胞壁が黒色であり、血管の内腔の部分が白である結果。このコントラストは、自動画像解析のための前提条件である。 </li><li>デジタルカメラを備えた双眼顕微鏡下に準備されたコアを配置します。わずか（約10％）の重複画像を全面が捕捉されるまで、コアの一方の側に起動シーケンスを取る。コア表面の完全なイメージを作成するために、単一の画像をステッチ。 </li></ol></li><li>マイクロスライドからデジタル画像を作成して<ol><li>顕微鏡下に洗浄マイクロスライドを置き、全体セクションから重複した画像を取る。 </li><li> 40Xおよび1,000倍の倍率の範囲、分析される構造に応じて特定の倍率を規定する。 </li><li>セクションの1の完全な画像を作成するために、単一の画像をステッチ。綴じ処理中に可能な歪みを避けるために、「使用;計画「顕微鏡の対物レンズを-type。 </li></ol></li></ol> 6.解剖学的特徴の定量化<ol><li>画像解析ツールROXAS18または類似のソフトウェアを使用して細胞やリングの境界線を検出するために、メートル単位での定量的な結果を得るために、マイクロセクション及び関連する空間キャリブレーションの完全な画像をロードします。同じ倍率で撮影マイクロメートルのステージ画像のスケールの間のピクセル数を測定し、メートル法単位（ 例えば 1000μm以下）で、スケールの間隔によって得られた値で割ることによって空間較正を計算する。 </li><li> （ソフトウェアで提供される）提供されたリストの分析の自動一部を開始する前に、適切な設定から選択します。 注：構成は、例えば、考慮のサンプルの染色の色、検出されるべき細胞のサイズおよび形状の範囲をとり、プログラム設定を以前に最適化されたセットである。こうして仕立ての構成異なる種と画質のための最適な認識結果を生成することを可能にする。 <ol><li>必要に応じて、試料中に回避するために含めたり除外されるイメージ内のような領域の使用量などのさらなるオプション、 例えば 、空白の画像の余白やクラックを選択します。 </li></ol></li><li>分析ボタンを押して分析を開始します。選択した場合、多角形、長方形や円ツールを使用して包含または除外される画像内の領域を定義。次の自動分析は、いくつかの画像の欠陥（ 例えば 、乏しいコントラスト）を補正し、画像の品質に基づいて、コントラストを向上させる柔軟なアルゴリズムを使用する。 </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

dendroecological研究への木材解剖学の成功と持続可能な統合の課題は離れてマニホールド分析的な問題から、主に技術的な側面に、である。これらの課題は、原則として、サンプリングから高品質マイクロセクションとそれらのその後の分析19を作成することへのアプローチの範囲。 一見したところ、コアあるいはディスクのサンプリングは長年にわたり知られている簡単な手順である。間違って行うことができ、サンプリングの小さな不正確さがその後の調製および分析の段階で重大な問題が発生する可能性が多くのものがあります。研究の目的は、リング幅の測定に限定されている場合は、そのような正確に垂直ステム軸に、または不完全尖らコアラを使用していないコアリングのような小さな不正確さが問題になりません。サンプルの顕微鏡分析を目指ししかし、誤ったサンプリング方向は、光学歪みが発生する可能性がありコア内のマイクロクラックで鈍いcorersの結果を用いながら、細胞壁、。これらのコアのマイクロセクションをカットしようとしたときにその結果、薄い部分はちょうどばらばらなく、効率的な製造は、もはや保証されている。同じことは、マイクロコアサンプリングについても同様です。パンチャーが幹木材に打ち込まれたとき鈍い先端は高圧になります。その結果形成層層は圧縮される。形成層細胞（ 図5）は、結果的に圧迫され、分析することができない。 ディスクのサンプリングは確かに環境の変化にそれらを関連付けるために、成長の変化を分析する最良の戦略である。残念ながら、さらなる分析のためにサンプリングされることを意図し、すべての木からディスクを取るために、単純に不可能です。それにもかかわらず、特に熱帯年輪の場合は、茎ディスクの一定量の増分コアとの組み合わせで必要とされる。ディスクはリングの境界を定義するベースとして使用され、このためにboundarをサポートするために増分コア12,27,28の分析に基づいて定義新設。 カッティング対サンディングの長所と短所は、頻繁に1,11,21を議論している。それは上記の言及されたように、最適な手順は、常に研究課題に依存し、分析されるべきパラメータ（巨視的または微視的）。同位体または化学分析は、さらに作業工程に投影した場合には、試料全体にわたって細胞内腔に充填することができることをサンディングすることによって作成された摩耗粉が、慎重に真空引きまたは圧力空気により除去することが最も重要である。 すべての微視的にはさらなる分析のためのサンプルを調製する最も適切な方法を分析するためのマイクロセクションをカットするです。まず、セ​​クションはその後、さらなる分析のための潜在的な汚染なしに保つことができ、サンプルを、遮断される。第二のセクションは、単一の格子パラメータを高分解能測定を可能にする。さらに、時間のかかる埋め込みを回避細胞を安定化するためにコーンスターチ液26を用いて、技術は、マイクロセクショニングの大きな利点である。 マイクロ切片の欠点は、まだ長い準備時間になり限られたサンプルサイズです。実際の時系列は、何世紀にも、あるいは数千年以上の時間に戻って分析するために、さらに、既存の切断装置17,19だけでなく、画像処理と解析18を開発する必要がある。この方向への最初のステップは、最初にコア（ 図1）上に平面の表面を切断するために製造され、コア·ミクロトーム21の開発である。最近の試 ​​験は、この装置（ 図1）を使用して、全体のコアの微小部分を切断する能力を明らかにした。 高品質マイクロセクションでは、効果的な画像解析のための基本原理を提供する。顕微鏡下の画像を取ることは一般的な手順19であるが、それらの効果的な分析はまだ必要な作業ですさらに17を開発することができる。すべての既存の画像解析システムは半自動である、 すなわち、それらは多かれ少なかれ強く技術者によって制御される必要がある。多くの場合、画像を修正する必要がある、あるいは新しい画像は、画像内のセル壁の厚さを変更することなく、ソフトウェアによる構造のよりよい登録のコントラストを強調するために行われなければならない。 このようROXAS 18、WinCellまたはImageJの29固有のスクリプトのような特殊な画像解析ツールは、細胞数、細胞寸法、セル壁厚と年輪内のセルの位置などの基本的な解剖学的データを提供することができる。 dendroecologicalコンテキストに関連する多くの追加の解剖学的メトリックは、最大の導管のサイズ、導管のサイズ分布は、早材または導管の最初の行のサイズは、（光学）、木材密度、イントラ年間、これらの基本的な測定値から計算することができる導管のサイズと細胞壁のプロファイル厚み、及び導管（孤独、倍数など ）のパターンをグループ化。 ソフトウェアROXAS 18を使用して、管路内腔（ すなわち 、水の導電セル）と年輪の境界線の輪郭が自動的に認識され、視覚的に、元の画像の上にオーバーレイとして表示されます。導管用の検出アルゴリズムは、色、サイズ、形状情報、各導管のローカルコンテキスト上のリングの境界の検出アルゴリズムに基づいている。ツールボックスは、私たちは手動で直接、 すなわち 、オーバーレイ機能を編集、 ​​削除、追加およびリングの境界線を変更し、導管が概説することにより、これらの結果を改善することができます。編集後、細胞壁の厚さ（針葉樹）を含む最終的なデータ出力には、自動的に生成され、スプレッドシートに保存された。完全に自動化されたシステムではなくても、比較的単純な構造を示した針葉樹のために、現在利用可能ではありませんが、これは今後の開発のための目標です。これは強く府を支持する時系列の木材解剖学的パラメータのLLの統合分析。

木、ならびに低木、ドワーフ低木、さらにハーブは、それらの環境の変化に関連するマニホールド応答パターンを示す。これらのパターンは、半ば、19世紀以来、植物学と植物生理学の対象となっている。当時、木本植物の研究は主に木や生態学的文脈1における年輪の構造と変動の記述分析に焦点を当てた。アンドリュー·エリコットダグラスは年輪研究2のクロスデート技術を発明したときは、この生態学的コンテキストは、多かれ少なかれ正確に考古学に木製の調査結果を日付に新しい能力によって抑制された。初めてのクロスのデートは、暦年に年輪の正確な年代測定を可能にし、今までその応用1のすべてのフィールドで年輪研究のバックボーンとしてみなされている。 並行して、19世紀末以来、木材解剖学は、関連する重要な研究規律へと進化自然と応用科学3の他の多くの分野にD。二つの主要なドメインが確立されている：木材技術、生理学、病理学、および生態3,5に関連する考古学4に木材を識別するための基礎となる体系的な木材解剖学、および適用される木材解剖を、。 年輪研究では、dendroecologyは、今日ではそのような地形プロセス（dendrogeomorphology）、気温と降水量の再構成（dendroclimatology）、水位の変化（dendrohydrology）あるいは氷河の変動（のような環境の研究に焦点を当てた年輪関連の研究を網羅するトピックとして定義されているdendroglaciology）6。この定義が示すように、年輪の分析は、（i）のリング幅7,8、木材密度9年間の変動を分析することにより、過去の気象条件として出会い、環境のプロセスを再構築の分野においてますます重要になって、または10同位体、またはしている（ii）のトン彼は地形のプロセス11の間隔を再発。これらのリング幅の変動について非常に詳細な研究とその同位体含量は、リングの解剖学的構造を研究するために、 すなわち 、より詳細にリングを分析する必要性を実証する。しかし、環境の変化に関連した年輪内の木材解剖学的特徴の詳細な研究は、12,13はまれである。これらの顕微鏡的特徴が14知られているが、彼 ​​らはめったにdendroecological研究に顕微鏡レベルで適用されていない。さらに、正確な年代測定の目的のために不可欠な自然に成長した樹木、これらの成長反応の正確なタイミングは、めったに最近15文書化されていません。 地球温暖化16の影響に関しては、既存および新規技術の開発の改善は、特に気候への影響の研究11の観点から、記録し、必要とされる過去と継続的な環境のプロセスを定量化する。生態学的にベースの木材解剖17に伝統的な木材解剖学的研究を展開し、デンドロ科学者は新しいパラメータを分析し、木本植物18の解剖学上の特定の環境要因の短期的および長期的な効果を理解するための新しい方法論を開発することができます。特定のドライバ（ 例えば 、機械的な力、気候変動）に関連する個々の環内の異なるセルパラメータの変動についての詳細な知識は、ツリーリング状に変動性を理解するための基本的な要件である。一般的なリング幅の測定値と比較して、木材解剖学的バリエーションを特定する労力と多くの時間を必要とする、より複雑かつ広大な製造技術を必要とする。試料を切断、染色、および埋め込 ​​みの詳細な手順はマニホールドであり、常に研究19の目的に依存している。 数、サイズや競合製品のための針葉樹あるいは構造におけるリング幅の巨視的分析について広葉樹における血管のibutionは、試料の表面は、一般に微細な研磨紙や特殊研削盤20を用いて研磨される。この方法の欠点は、さらに半自動顕微鏡分析21を防ぎほこりで個々の細胞の充填である。試料表面を剃刀の刃または他の鋭利なナイフを用いて切断された場合、巨視的試料調製のための最良の結果が達成される。 小さなサンプルのための一方で、かみそりの刃は、最適なツールです。コアなど大きなサンプルはコアの全体範囲にわたって平面表面の切断を必要とする。サンディングとは対照的に、細胞は、連続的な画像解析のためのさらなる調製を可能に塵埃が充填されていない。さらに、開放セルの内腔、正しくカット細胞壁、及びサンプル全体の平面は、コアの全体の程度に高周波デンシ22の適用を可能にする。画像は、試料の表面（細胞を分析するために壁）濃インクを用いて染色することができ、オープンセル内腔は、その後、細胞壁および管腔面積19,23の間のコントラストを高めるために白いチョークを充填することができる。このかなり単純な手法は、血管サイズ測定のためのより大きな細胞構造の基本的な巨視的な評価が可能になります。 平面表面を切断するためのこれらの技術は、巨視的な分析のために十分である。詳細な木材解剖学的（ すなわち、微視的）分析のために、透過光顕微鏡デンドロ科学で適用最も一般的な方法である。木部細胞は、細胞型決定、細胞分裂、細胞分化、およびプログラム細胞死24を包含する複雑な過程を経て分化する。これらのプロセスは、細胞の解剖学的特性を決定発生するタイミングや速度ので、これらのプロセスに影響を与える環境条件は、環構造内の解剖学的偏差を生成することができる。これらの分析のための重要な前提条件として、sは、マイクロセクションミクロトーム19を用いて調製する必要がある。セクショニングのための試料を調製する際に、仮道管または繊維方向の視認性が重要である。画像は19を分析するために、必要に応じて、この技術は、高品質のセクションを容易にしているためミクロトームをスライドさせる駆動手の使用はマイクロセクションをカットすることをお勧めします。特定の研究の特定の目的に依存して、マイクロセクションは、セルの長手方向に垂直または平行に切断される。これらのセクションは、次に、顕微鏡の下に撮影し、セルの寸法は、特殊なイメージは、ソフトウェアを解析使用して測定される。 最近まで、マイクロ切片を作製する能力は小さなサンプルサイズのみ（xは1センチメートル約1cm）に限られていた。これは、特定の年の障害のような単一のイベントを分析するために許容可能であるが、この技術は、環境の再構成に必要な拡張時系列分析を許可していません。この取り組みは、実現することができます、新しい効率的かつ経済的な準備手順及び分析技術の開発を通じて、D。近年では、スイスのスイス連邦研究所のWSLのツリーリングラボのメンバーは、このトピックに関する集中的な作業を開始している。結果として、新しいデバイスおよび分析技術は、環境研究テーマの広い範囲に木材解剖学的特徴を統合するという考えをサポートするために開発されてきた。

<table><tbody><tr><td>Increment corer</td><td></td><td></td><td>http://www.haglofinc.com/index.php?option=com_content&amp;amp;view=article&lt;br/&gt; &amp;amp;id=57&amp;amp;Itemid=88&amp;amp;lang=en</td></tr><tr><td>Core-Microtome</td><td></td><td></td><td>http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN</td></tr><tr><td>Laboratory microtome</td><td></td><td></td><td>http://www.wsl.ch/dendro/products/microtomes/index_EN</td></tr><tr><td>Trephor micro corer</td><td></td><td></td><td>http://intra.tesaf.unipd.it/Sanvito/trephorEn.asp</td></tr><tr><td>Nawashin solution</td><td></td><td></td><td>Ten parts 1% chromic acid, four parts 4% formaldehyde and one part acetic acid</td></tr><tr><td>Picric-Anilin blue</td><td></td><td></td><td>One part saturated aniline blue and four parts Trinitrophenol dissolved in 95% ethanol</td></tr><tr><td>Safranin</td><td></td><td></td><td>Empirical Formula (Hill Notation) C&lt;sub&gt;20&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;19&lt;/sub&gt;ClN&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Astra-blue</td><td></td><td></td><td>Empirical Formula (Hill Notation) C&lt;sub&gt;47&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;52&lt;/sub&gt;CuN&lt;sub&gt;14&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;S&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td>Linear Formula CH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;CH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;OH&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Xylol (Xylene)</td><td></td><td></td><td>Linear Formula C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;(CH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Canada Balsam</td><td></td><td></td><td>Embedding solution for microscopy</td></tr><tr><td>Roxas Software</td><td></td><td></td><td>http://www.wsl.ch/dienstleistungen/produkte/software/roxas/index_EN</td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td></td><td></td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>WinCell</td><td></td><td></td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr></tbody></table>

a technical perspective in modern tree-ring research - how to overcome dendroecological and wood anatomical challenges

Dendroecological研究は、単一の木、さらには全体の森林生態系は、環境変化に対応し、最終的にそのような変更を再構築する方法を理解するために木の年輪に格納された情報を使用しています。これは、時間を遡って、成長の変化を分析し、（例えば）温度記録を、様々な植物固有のパラメータを相関させることによって行われる。これらの分析における木材解剖学的パラメータを統合することさえ、イントラ年次解像度まで、再構成を強化する。そこで我々は、サンプルの準備、および一般的な巨視的な分析のためだけでなく、その後の顕微鏡分析のための木製の試料を分析する方法についてのプロトコルを提示する。さらに我々は、時系列分析をサポートするために、共通の小規模および大規模な標本から生成されたデジタル画像を分析するための潜在的な解決策を紹介する。プロトコルは、現在使用できるように基本的な手順を示す。これ以外にも、既存の技術の改善、および新規トンの開発のための継続的な必要性があるechniques、記録し、過去と継続的な環境のプロセスを定量化する。伝統的な木製の解剖学的研究では、この研究分野の生態学的情報を含むように拡張される必要がある。これは、新しいパラメータを分析し、木本植物の解剖学上の特定の環境要因の短期および長期の影響を理解するための新しい方法論を開発していきデンドロ研究者をサポートする。

すべてのdendroecological分析は正確なサンプルに依存して、どんなにディスク、コア、またはマイクロコアがとられている場合。このために、デバイスは、木製のサンプル内のマイクロクラックを避けるために（正確にシャープに）完全な形にしておく必要があります。インクリメントコア上表面を調製する場合、コアミクロトームの使用が必須である。さらに、画像のコントラストを向上させるために処理することができるオープンセルを有する能力を分析し、血管径の測定（ 図1）は 、時系列に解剖学的構造の適応に向けた最初の重要なステップで分析される。時には広葉樹のサンプルの密度はミクロトームの使用を防止します。その場合には、圧縮機や真空との適切な研磨と血管からの過度のおがくずのその後の除去は最良の選択肢である。 早材及び針葉樹における晩材仮道管、より小さいセル構造のより詳細な分析のために、高品質のマイクロセクションが必要とされている。ここでは、potentiこのような二次細胞壁は、一次壁から剥離されるものとしてらアーチファクトが（ 図2）を回避する必要がある。これらのアーティファクトは、デジタル画像に発生した場合、セル寸法の自動分析は、もはや不可能である。アーティファクトは、手動時間がかかり、セル寸法の不正確な測定値のほとんどの場合の結果であり、これを補正する必要がある。最小限に（ 図2）26 のアーチファクトの発生を低減しつつ、サンプルの上に非ニュートン流体の単純なアプリケーション、 すなわち 、トウモロコシデンプン溶液は、構造の安定性をサポートする。熱帯種を含むすべての木製サンプルに適しコーンスターチ、このアプリケーションは、冗長な切断前の試料と、埋め込み手順の適用を行う。 マイクロセクションでは、年輪のより安全な決定を可能にする。これは、特に彼らの自然の限界、 すなわち上に成長針葉樹の場合である&lt;/ em&gt;の、高山地域でツリーラインで。非常に狭い環は、巨視的（ 図3）を検出するために頻繁に困難である。極端な場合には、リングが早材細胞、および細胞壁肥厚（共通の晩材細胞とは対照的に）を欠いている扁平晩材細胞、一列の1つまたは2つの行で構成されている。マイクロセクションを使用する場合はこのために、彼らは良いかさえのみ表示されます。また、密度の変動は、特に地中海熱帯（ 図3）に年輪の検出を単純化する、より明確環境界から区別することができる。 40X以上の倍率で画像を分析する場合、単一のセルが表示され、それらの細胞壁の厚さも検出可能である。半自動解析ソフトウェアは、それらの時間的·空間的発展の方向（ 図4）以下の定義されたパスに沿った特定のパラメータの測定を可能にします。これにより、ちゃん例えば、細胞内腔や細胞壁の厚さのような単一のパラメータのGESは年輪（ 図4）の全範囲にわたって決定することができる。これは、画像内に見えるすべてのリングのために行うことができ、これは完全に伸長時系列分析の必要性をサポートする。 画像分析はまた、植生期間（ 図5）内の年輪の発生段階を決定するために用いることができる。二次細胞壁の完全な木化まで、細胞壁の最も外側の角から開始して、偏光を用いた木質化さえ異なる段階をサフラニンアストラブルーで染色された部分の画像を分析する場合、見えるようになる。木化（成熟した）細胞壁が偏光（ 図5）中に照らすためである。詳細な情報は、例えば、より詳細な気候成長relatiを決定するために、それぞれの植生期間文書化環境データに関連付けることができる<html> onship。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52337/52337fig1.jpg" /> 図1の微小部分の例には、リング幅と血管径の測定を含むオークの準備平面左：オークインクリメントコアの最も外側の部分。直径5mmのコアは、コアミクロトームを用いて切断した。表面は、フェルトマーカーを用いて、黒色染色し、汚れが乾燥した後、細胞を、白亜を充填した。右：グラフは、左に示すコアの表面上で行わリング幅および血管サイズ測定を示しています。いいえマイクロセクションは（21の後に変更された）コアミクロトームによって作成された明確な表面のために、これらの測定を行うために必要とされなかった。下：マイクロセクションには、脱水、染色し、カナダバルサムで固定、インクリメントコアを遮断する。厚さ：20ミクロン、長さ25 cmである。<html> G &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52337/52337fig2.jpg" /> 図コーンスターチ溶液を使用して、セクションカット対安定化することなく、カットマイクロセクションの2。画像左：針葉樹の早材の仮導管で切断アーティファクトを示すマイクロセクション。サンプルは埋め込まずに切断し、結果として早材細胞のではなく薄い二次壁は、一次壁（青矢印）をオフに分割した。右：針葉樹の早材の仮導管内の任意のアーティファクトのないマイクロセクション。このセクション（左図のように同じサンプル）は試料表面の上にブラシでコーンスターチ溶液を塗布した後、切断した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52337/52337fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> ove_content「FO：キープtogether.withinページ= &quot;常に&quot;&gt; <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52337/52337fig3.jpg" /> 図左ほとんど検出年輪界の3例：（ここで： ヨーロッパカラマツ ）増分コアのマイクロ部分が細胞壁の任意の肥厚なし扁平晩材細胞の単一の行によって示される環境界（黒矢印）を示すが。このリングは、肉眼では見えないだろう。右：イントラ年次密度の変動（白矢印）は地中海の種で共通している（マイクロセクション： コナラアイレックス ）。晩材とバック早材構造（白矢印）に向けたセル構造の緩やかな変化は、実際のリングの境界（黒矢印）から密度変動を区別するために可能にする。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52337/52337fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 図針葉樹の年輪内腔面積、壁の厚さの測定の4イラストトップ： アカマツ （ヨーロッパアカマツ）の年輪でROXAS解析結果の一例を示すカットアウト画像。リング境界はシアンに黄色と仮道管腔の輪郭に示されている。つの半径方向ファイル（青仮道管腔）が測定されたセル壁の厚さは、赤色円で表されている。ブラックスケールバー=100μmである。下：イントラ年次仮道管の内腔面積の変化と全体の年輪のための仮道管細胞壁の厚さ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52337/52337fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52337/52337fig5.jpg" /> 図5. Exampl形成年輪のE。イメージはで成長ヨーロッパカラマツから7月7日目 、2007年にサンプリングされたマイクロ·コアから得サフラニンとアストラ·ブルー染色のマイクロセクションから偏光で光顕微鏡下で撮影されましたレッチェンタール海抜1300メートルで。このマイクロ部形成層細胞に、拡大期における細胞は、壁肥厚期の細胞および成熟細胞が認識可能である。画像の接線幅は、木部断面の〜1ミリメートルをカバーしています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52337/52337fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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A Technical Perspective in Modern Tree-ring Research - How to Overcome Dendroecological and Wood Anatomical Challenges

Here we present a protocol outlining how to sample wooden specimens for the overall assessment of their growth structures. Macro- and microscopic preparation and visualization techniques necessary to generate well-replicated and highly resolved wood anatomical and dendroecological dataset, are described are described.

現代の木リング研究の技術的な観点 -  Dendroecologicalと木材解剖課題を克服する方法

Dendroecological research uses information stored in tree rings to understand how single trees and even entire forest ecosystems responded to ...

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29.0K ビュー.  Swiss Federal Research Institute WSL. Here we present a protocol outlining how to sample wooden specimens for the overall assessment of their growth structures. Macro- and microscopic preparation and visualization techniques necessary to generate well-replicated and highly resolved wood anatomical and dendroecological dataset, are described are described.

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Design and Construction of an Urban Runoff Research Facility

As the urban population increases, so does the area of irrigated urban landscape. Summer water use in urban areas can be 2-3x winter base line water use due to increased demand for landscape irrigation. Improper irrigation practices and large rainfall events can result in runoff from urban landscapes which has potential to carry nutrients and sediments into local streams and lakes where they may contribute to eutrophication. A 1,000 m2 facility was constructed which consists of 24 individual 33.6 m2 field plots, each equipped for measuring total runoff volumes with time and collection of runoff subsamples at selected intervals for quantification of chemical constituents in the runoff water from simulated urban landscapes. Runoff volumes from the first and second trials had coefficient of variability (CV) values of 38.2 and 28.7%, respectively. CV values for runoff pH, EC, and Na concentration for both trials were all under 10%. Concentrations of DOC, TDN, DON, PO4-P, K+, Mg2+, and Ca2+ had CV values less than 50% in both trials. Overall, the results of testing performed after sod installation at the facility indicated good uniformity between plots for runoff volumes and chemical constituents. The large plot size is sufficient to include much of the natural variability and therefore provides better simulation of urban landscape ecosystems.

This paper describes the design, construction, and function of a 1,000 m2 facility containing 24 individual 33.6 m2 field plots equipped for measuring total runoff volumes with time and collection of runoff subsamples at selected intervals for quantification of chemical constituents in the runoff water from simulated home lawns.

アーバン流出研究施設の設計と建設

As the urban population increases, so does the area of irrigated urban landscape. Summer water use in urban areas can be 2-3x winter base line water use ...

環境学

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. The standardized sampling component of the method concentrates viruses that may be present in water by passage of a minimum specified volume of water through an electropositive cartridge filter. The minimum specified volumes for surface and finished/ground water are 300 L and 1,500 L, respectively. A major method limitation is the tendency for the filters to clog before meeting the sample volume requirement. Studies using two different, but equivalent, cartridge filter options showed that filter clogging was a problem with 10% of the samples with one of the filter types compared to 6% with the other filter type. Clogging tends to increase with turbidity, but cannot be predicted based on turbidity measurements only. From a cost standpoint one of the filter options is preferable over the other, but the water quality and experience with the water system to be sampled should be taken into consideration in making filter selections.

EPA Method 1615 uses an electropositive filter to concentrate enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. This manuscript describes the procedure for collecting samples for Method 1615 analyses.

エンテロウイルスと文化およびRT-QPCRによる水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615測定。ウイルスサンプルのI.コレクション

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

Preparation and Testing of Plant Seed Meal-based Wood Adhesives

Recently, the interest in plant seed meal-based products as wood adhesives has steadily increased, as these plant raw materials are considered renewable and environment-friendly. These natural products may serve as alternatives to petroleum-based adhesives to ease environmental and sustainability concerns. This work demonstrates the preparation and testing of the plant seed-based wood adhesives using cottonseed and soy meal as raw materials. In addition to untreated meals, water washed meals and protein isolates are prepared and tested. Adhesive slurries are prepared by mixing a freeze-dried meal product with deionized water (3:25 w/w) for 2 hr. Each adhesive preparation is applied to one end of 2 wood veneer strips using a brush. The tacky adhesive coated areas of the wood veneer strips are lapped and glued by hot-pressing. Adhesive strength is reported as the shear strength of the bonded wood specimen at break. Water resistance of the adhesives is measured by the change in shear strength of the bonded wood specimens at break after water soaking. This protocol allows one to assess plant seed-based agricultural products as suitable candidates for substitution of synthetic-based wood adhesives. Adjustments to the adhesive formulation with or without additives and bonding conditions could optimize their adhesive properties for various practical applications.

To facilitate the effort in seeking more economic and environment-friendly formulations of natural product-based wood adhesives, this work demonstrates the preparation and testing of plant seed-based wood adhesives. This protocol allows one to assess plant seed-based agricultural products as suitable candidates for the substitution of synthetic-based wood adhesives.

植物種子ミールベースの​​木材接着剤の調製および試験

Recently, the interest in plant seed meal-based products as wood adhesives has steadily increased, as these plant raw materials are considered renewable ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

エンテロウイルスと文化およびRT-qPCRにより水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615測定。パートIII。 RT-qPCRによりウイルス検出

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Laboratory and Field Protocol for Estimating Sheet Erosion Rates from Dendrogeomorphology

Sheet erosion is among the crucial drivers of soil degradation. Erosion is controlled by environmental factors and human activities, which often lead to severe environmental impacts. The understanding of sheet erosion is, consequently, a worldwide issue with implications for both environment and economies. However, the knowledge on how erosion evolves in space and time is still limited, as well as its effects on the environment. Below, we explain a new dendrogeomorphological protocol for deriving eroded soil thickness (Ex) by acquiring accurate microtopographic data using both terrestrial laser scanning (TLS) and microtopographic profile gauges. Additionally, standard dendrogeomorphic procedures, dependent on anatomical variations in root rings, are utilized to establish the timing of exposure. Both TLS and microtopographic profile gauges are used to obtain ground surface pro&#64257;les, from which Ex is estimated after the threshold distance (TD) is determined, i.e., the distance between the root and the sediment knickpoint, which allows de&#64257;ning the lowering of the ground surface caused by sheet erosion. For each profile, we measured the height between the topside of the root and a virtual plane tangential to the ground surface. In this way, we intended to avoid small-scale impacts of soil deformation, which may be due to pressures exerted by the root system, or by the arrangement of exposed roots. This may provoke small amounts of soil sedimentation or erosion depending on how they physically affect the surface runoff. We demonstrate that an adequate microtopographic characterization of exposed roots and their associated ground surface is very valuable to obtain accurate erosion rates. This finding could be utilized to develop the best management practices designed to eventually halt or perhaps, at least, lessen soil erosion, so that more sustainable management policies can be put into practice.

Characterizing erosion from dendrogeomorphology has usually focused on accurately finding the starting time of root exposure, by examining macroscopic or cell level changes caused by exposure. Here, we offer a detailed description of different novel techniques to obtain more precise erosion rates from highly accurate microtopographic data.

実験室およびフィールド プロトコル Dendrogeomorphology からシート侵食速度の推定

Sheet erosion is among the crucial drivers of soil degradation. Erosion is controlled by environmental factors and human activities, which often lead to ...

Using Tree-Rings to Reconstruct Fire History Information from Forested Areas

Annual tree-ring patterns are a source of ecological and environmental information including the history of fires in forested areas. Tree-ring based fire histories include three fundamental phases: field collection, laboratory methods (preparation and dating), and data analysis. Here we provide step-by-step instructions and issues to consider, including the process for selecting the study area, sampling sites, plus how and which fire-scarred trees to sample. In addition, we describe fire-scar sample preparation and dating which are done in the laboratory. Finally, we describe basic analysis and relevant results, including examples from studies that have reconstructed fire history patterns. These studies allow us to understand the historical fire frequency, changes in those frequencies related to anthropogenic factors, and analyzes of how climate influences fire occurrence over time. The description of these methods and techniques should provide a greater understanding of fire history studies that will benefit researchers, educators, technicians, and students interested in this field. These detailed methods will allow new researchers to this field, a resource to start their own work and achieve greater success. This resource will provide a greater integration of tree-ring aspects within other studies and lead to a better understanding of natural processes with forested ecosystems.

<meta charset="utf8"></head><body>年輪を使用した森林地帯からの火災履歴情報の再構築

This work explains the most appropriate techniques and methods for conducting a fire history study from beginning site selection to final analysis of fire-climate relationship.

年輪を使用した森林地帯からの火災履歴情報の再構築

Annual tree-ring patterns are a source of ecological and environmental information including the history of fires in forested areas. Tree-ring based fire ...

How to Extract Climate Variability from Tree-Rings

Tree rings have been used to reconstruct climatological variables in many locations around the world. Moreover, tree-rings can provide valuable insights into climatic variability of the last few centuries and, in some areas, several millennia. Despite the important development, that dendrochronology has had in recent decades to study the dendroclimatic potential of a large number of species present in different ecosystems, much remains to be done and explored. In addition to this, in the last few years more people (students, teachers and researchers) around the world are interested in implementing this science to extend the timeline of climate information backwards and understand how climate has changed on scales of decades, centuries or millennia. Therefore, the objective of this work is to describe the general aspects and basic steps needed to conduct a tree-ring climate reconstruction, from site selection and field sampling to laboratory methods and data analysis. In this method's video and manuscript, the general basis in tree-ring climatic reconstructions is explained so newcomers and students can use it as an available guide into this field of research.

<meta charset="utf8"></head><body>年輪から気候変動を抽出する方法

Tree-ring climate reconstructions can be helpful to better understand past climate variability beyond instrumental records. This protocol shows how to reconstruct past climate using tree rings and meteorological instrumental records.

年輪から気候変動を抽出する方法

Tree rings have been used to reconstruct climatological variables in many locations around the world. Moreover, tree-rings can provide valuable insights ...

Advanced Workflow for Taking High-Quality Increment Cores - New Techniques and Devices

In dendroecological research, precise dating of each single growth ring is a basic requirement for all studies, focusing on ring-width variations only, chemical or isotope analyses, or wood anatomical studies. Independent of the sampling strategy for a certain study (e.g., climatology, geomorphology), the way samples are taken is crucial for their successful preparation and analyses.
Until recently, it was sufficient to use a (more or less) sharp increment corer to obtain core samples that could be sanded for further analyses. Since wood anatomical characteristics can be applied to long time series, the need to obtain high-quality increment cores has taken on a new meaning. Essentially, the corer needs to be sharp(ened) when used. When coring a tree by hand, there are some problems in handling the corer, resulting in the hidden occurrence of micro cracks along the entire core: When starting to drill by hand, the drill bit is strongly pressed against the bark and the outermost ring until the thread has fully entered the trunk. At the same time, the drill bit is moved up and down as well as sideward. Then, the corer is drilled all the way into the trunk; however, it is necessary to stop after each turn, change the grip, and turn again. All these movements, as well as the start/stop-coring, puts mechanical stress on the core. The resulting micro cracks make it impossible to create continuous micro sections, as they fall apart along all these cracks.
We present a protocol to overcome these obstacles by applying a new technique using a cordless drill to minimize these problems when coring a tree, as well as its effect on the preparation of long micro sections. This protocol includes the preparation of long micro sections, as well as a procedure to sharpen corers in the field.

Here, we present a protocol on how to avoid micro cracks in increment cores by applying a cordless drill with a torque multiplier to minimize problems when coring trees, as well as its effect on preparing long micro sections. This protocol also includes a procedure to sharpen corers in the field.

高品質のインクリメントコアを取得するための高度なワークフロー - 新しい技術とデバイス

In dendroecological research, precise dating of each single growth ring is a basic requirement for all studies, focusing on ring-width variations only, ...

現代の木リング研究の技術的な観点 - Dendroecologicalと木材解剖課題を克服する方法

要約

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この動画の章

アーバン流出研究施設の設計と建設

エンテロウイルスと文化およびRT-QPCRによる水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615測定。ウイルスサンプルのI.コレクション

植物種子ミールベースの木材接着剤の調製および試験

エンテロウイルスと文化およびRT-qPCRにより水中のノロウイルス発生のEPAメソッド1615測定。パートIII。 RT-qPCRによりウイルス検出

実験室およびフィールドプロトコル Dendrogeomorphology からシート侵食速度の推定

年輪を使用した森林地帯からの火災履歴情報の再構築

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年輪から気候変動を抽出する方法

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