Este trabajo está financiado por RJ Reynolds Tobacco Company (RJRT) bajo un acuerdo de investigación en colaboración con la Wake Forest University School of Medicina. GL Prasad es un empleado a tiempo completo de RJRT.

NOTA: consentimiento informado por escrito para hacer este estudio se obtuvo en una unidad de investigación clínica local bajo la aprobación del IRB, por Buenas Prácticas Clínicas. Procesamiento de la sangre, el aislamiento de PBMCs y otros experimentos de cultivo celular se realizan bajo condiciones estériles, utilizando suministros microbiológicamente estériles y reactivos. 1. WS-CM Preparación <ol><li> Generar WS-CM como se ha descrito previamente 12. <ol><li> Preparar WS-CM pasando humo de cuatro 3R4F cigarrillos de referencia a través de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 sin rojo fenol mediante el siguiente régimen de fumar: 35-60-2, el volumen de hojaldre en ml, intervalo de hojaldre en seg, y la duración de hojaldre en segundos, respectivamente. Cada preparación genera una muestra de 20 ml. </li></ol></li><li> Tubo (s) etiqueta con fecha, hora completado, y el nombre y el número de cigarrillos. Almacene los 500 ml de alícuotas a -80 ° C inmediatamente después de fumar se ha completado. </li><li> Analizar alícuotas de WS congelados-CM Para determinar los niveles de nicotina, las nitrosaminas específicas del tabaco y los hidrocarburos aromáticos policíclicos como se describió anteriormente 12. </li></ol> 2. Aislamiento de PBMC <ol><li> Recoger la sangre fresca de donantes sanos (que son los no consumidores de productos de tabaco) Aislar PBMCs de sangre fresca como se describe más adelante en obtener autorización de Wake Forest Baptist Health IRB 15. <ol><li> Antes de la llegada de la bolsa de sangre, una botella de 500 ml, tijeras, tampón de aislamiento, y salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) (RT) dispuestos en un nivel de bioseguridad 2 (BSL-2) campana de cultivo celular. Tampón de aislamiento debe ser protegido de la luz. </li><li> Mantenga la bolsa de sangre hacia abajo y cortar el tubo justo debajo de donde se ha sujetado dejando al menos 3 cm de tubo. </li><li> Retire el tapón de la botella de 500 ml y mantener el tubo por encima de la boca de la botella. Recojo la bolsa de sangre e invertirla para permitir que la sangre fluya libremente de la bolsa en tque la botella hasta que la bolsa está vacía. Deje que la sangre fluya hacia la pared interior de la botella frente hacia abajo para evitar la creación de burbujas. </li><li> Verter tampón de aislamiento dentro de la botella en una proporción de 1: 5 de tampón de aislamiento a la sangre. Se tapa el frasco bien y suavemente invertirlo, de extremo a extremo, 10 veces. Deja la botella en la campana de cultivo de células para la incubación con luces apagadas, durante 1 hora a RT. </li><li> Una capa de luz, color paja se acumula por encima de la sangre. Eliminar esta capa usando una pipeta serológica 25 ml en 50 ml tubos cónicos. El monto recaudado puede variar desde 50 hasta 300 ml, dependiendo del tema que donaron sangre. </li><li> Centrifugar los tubos a 200 xg durante 10 min a TA. </li><li> Aspirar el sobrenadante transparente, dejando el sedimento de color sangre oscura. El sedimento se suelta pero viscoso. </li><li> Pipetear 3 ml de tampón de aislamiento en tubos de 15 ml cónicos. </li><li> Para resuspender el pellet, añadir 20 ml de DPBS por cada 50 ml de líquido de color paja recogidos en sTep 2.1.5. Vortex para mezclar a fondo, y consolidar el líquido resuspendido de múltiples tubos. Este líquido contiene suspendió células sanguíneas. </li><li> Con una pipeta de transferencia, la transferencia de 5 ml de las células sanguíneas suspendidas en 3 ml de tampón de aislamiento en el paso 2.1.8. Incline el tubo cónico de 15 ml que contiene la suspensión celular lentamente y suavemente para crear dos capas separadas. Centrifugar los tubos a 400 xg durante 40 min a TA con una aceleración mínimo y sin freno. </li><li> Utilice una pipeta de transferencia para eliminar la capa resultante nublado medio (capa leucocitaria) que contiene PBMCs en un tubo cónico de 50 ml. Evite dibujar otras capas claras por debajo de ella. Transferencia no más de 25 ml en cada tubo cónico de 50 ml. </li><li> Añadir 25 ml de tampón corriente fría (o más para llenar todo el volumen restante del tubo cónico de 50 ml) para lavar las células. Centrifugar las células a 400 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Resuspender el precipitado con 10 ml tampón. Esta contiene las PBMC. Contar las células y usar immediata o lugar en hielo durante la congelación. </li></ol></li></ol> 3. La congelación y descongelación de las PBMCs <ol><li> Centrifugar las CMSP que se recogieron en el paso 2.1.13 durante 10 minutos a 400 x g. </li><li> Llenar el recipiente de congelación con alcohol isopropílico según las instrucciones del fabricante. PRECAUCIÓN: El alcohol isopropílico es inflamable y muy tóxico. </li><li> Resuspender el pellet con medio RPMI 1640 (4 ° C) que contenía suero bovino fetal al 20% (FBS) y 10% de sulfóxido de dimetilo (DMSO). Esto es RPMI 1640 medio de congelación. Resuspender el sedimento con una cantidad de medio de congelación que se traducirá en una suspensión tiene alrededor de 5 x 10 7 células / ml. El número de células disponibles para la congelación puede variar. </li><li> Dispensar alícuotas de 1 ml de suspensión celular en criotubos de 2 ml y colocar los criotubos en el recipiente de congelación. Coloque el recipiente de congelación con criotubos en un congelador a -80 ° C para almacenar O / N y luego retire los criotubos y traslado a almacenar en uncongelador criogénico entre -150 ° C a -190 ° C. </li><li> Retire el tubo criogénico de almacenamiento criogénico y descongelar rápidamente con agitación suave en un baño de agua a 37 ° C. </li><li> Inmediatamente transferir las PBMC descongeladas en el criotubo en un tubo cónico de 15 ml con 10 ml de RPMI 1640 medio completo (4 ° C) que contiene 10% de FBS, 1% Pen / Strep y 1% de L-glutamina. El contenido de la criotubo descongelados deben ser transferidos tan pronto como sea posible para obtener la viabilidad celular máxima 15. </li><li> Centrifugar los PBMCs a 400 xg durante 10 min. </li><li> Resuspender el precipitado con 5 ml de medio RPMI 1640 completo y contar las células. </li><li> Medir la viabilidad celular por métodos establecidos, tales como el método de exclusión con azul de tripano. Generalmente la viabilidad celular con este método es de aproximadamente 90 - 95%. Las PBMCs ahora están listos para usar en experimentos. </li></ol> 4. Determinación de la célula de la Muerte NOTA: Las diluciones que figuran aquí son para el propósito de este estudy. Las diluciones se pueden cambiar en consecuencia. <ol><li> Diluir WS-CM o la nicotina en una placa de 96 pocillos usando medio RPMI completo hasta un volumen total de 100 l / pocillo, como se indica a continuación. </li><li> Diluir WS-CM a las siguientes concentraciones: 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, y 5 mg / ml de unidades de equi-nicotina (basado en el contenido de nicotina en WS-CM) 12. </li><li> Diluir la nicotina en medio RPMI a las siguientes concentraciones: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000, y 3000 g / ml. PRECAUCIÓN: La nicotina es muy tóxico y peligroso para el medio ambiente. </li><li> Añadir 100 l de PBMCs en suspensión en medio RPMI completo a cada pocillo a una concentración de 1 x 10 6 células / pocillo. El volumen total de células más WS-CM o la nicotina será de 200 l / pocillo. </li><li> Para el propósito de este estudio, preparar dos conjuntos de placas como anteriormente. Cubrir las placas e incubar una placa durante 24 horas y una placa durante 3 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. Ajuste los puntos de tiempo como sea necesario. </li&gt; <li> Lavar las células a temperatura ambiente por centrifugación a 300 xg durante 3 min, aspirar el sobrenadante, vórtex la parte inferior de la placa con placa de cubierta y finalmente resuspender las células con 200 l de tampón de hielo frío, y repetir la etapa de lavado una vez más. </li><li> Añadir 95 l de tampón seguido de 5 l de 7-aminoactinomicina D (7AAD) a cada pocillo para un volumen total de 100 l / pocillo. Se incuba la placa en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Añadir 100 l de tampón a los tubos de racimo. Transferir todo el volumen de suspensión de células de cada pocillo de la placa a los tubos de racimo y adquirir las muestras en el citómetro de flujo. </li><li> Determinar el porcentaje de células positivas 7AAD utilizando citometría de flujo de software de análisis. </li></ol> 5. CE 50 Determinación <ol><li> Los valores de EC50 de WS-CM y la nicotina se determinan mediante tinción 7AAD-positivo de CMSP. </li><li> El valor de EC50 se define como la concentration en la que 50% de las células fueron ya no es viable en un ensayo de 24 h, y los valores se expresan como g de equi-nicotina unidades / ml. </li><li> A los efectos de este estudio, los valores de EC50 se determinó que eran 1,56 g / ml y 1,650 g / ml para WS-CM y la nicotina, respectivamente. </li></ol> 6. Las citoquinas secretadas NOTA: Las diluciones que figuran aquí son para el propósito de este estudio. Las diluciones se pueden ajustar en consecuencia. <ol><li> Diluir WS-CM en una placa de 96 pocillos usando medio RPMI completa a un volumen total de 100 l / pocillo a la concentración de 0,3, 1,56, 3, y 5 mg / ml de unidades de equi-nicotina. </li><li> Diluir la nicotina a las siguientes concentraciones: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000, y 3000 mg / mL. PRECAUCIÓN: La nicotina es muy tóxico y peligroso para el medio ambiente. </li><li> Añadir 100 l de PBMCs en suspensión en medio RPMI completo a cada pocillo a una concentración de 1 x 10 6 células / pocillo.El volumen total de células más WS-CM o la nicotina será de 200 l / pocillo. </li><li> Cubrir la placa e incubar durante 3 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Lavar las células a temperatura ambiente por centrifugación a 300 xg durante 3 min, aspirar el sobrenadante, vórtex la parte inferior de la placa con placa de cubierta y finalmente la suspensión de células con 200 l de hielo frío tampón y repetir la etapa de lavado una vez más. </li><li> Añadir 200 l de medio RPMI completo y repita el paso de lavado una vez más. </li><li> Añadir 200 l de 10 mg medio LPS / ml a cada pocillo. </li><li> Cubrir la placa e incubar durante 4 horas, 24 horas, 48 horas o 72 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. Ajuste los tiempos de incubación según sea necesario. </li><li> Centrifugar la placa a 300 × g durante 3 min. </li><li> Tomar 175 l de sobrenadante de cada bien y guardar en un congelador a -80 ° C para llevar a cabo los ensayos en los pasos 7 y 8. </li></ol> Ensayo matriz 7. citométricos de bolas &lt;ol&gt; <li> Descongelar los sobrenadantes de células preparados a partir de paso 6.10 y el uso en el ensayo de CBA. Realizar el ensayo de citometría de bolas de serie (CBA) según las instrucciones del fabricante. </li></ol> 8. IL-8 ELISA <ol><li> Descongelar los sobrenadantes de las células de la etapa 6.10 y su uso en la IL-8 ELISA. Realizar el ensayo ELISA según las instrucciones del fabricante. </li></ol> 9. Intracelular tinción y citometría de flujo NOTA: Las diluciones que figuran aquí son para el propósito de este estudio. Las diluciones se pueden ajustar en consecuencia. <ol><li> Diluir WS-CM en una placa de 96 pocillos usando medio RPMI completa a un volumen total de 100 l / pocillo a la concentración de 0,3, 1,56, 3, y 5 mg / ml de unidades de equi-nicotina. </li><li> En la misma placa, diluir la nicotina a las siguientes concentraciones: 2, 10, 50, 100, 500, 2000, y 4000 g / ml. PRECAUCIÓN: La nicotina es muy tóxico y ambientalmente hazardous. </li><li> Añadir 100 l de PBMCs en suspensión en medio RPMI completo a una concentración de 1 x 10 6 células / pocillo. El volumen total de células más WS-CM o la nicotina será de 200 l / pocillo. </li><li> Cubrir la placa e incubar durante 3 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Lavar las células a temperatura ambiente por centrifugación a 300 xg durante 3 min, aspirar el sobrenadante, vórtex la parte inferior de la placa con placa de cubierta y finalmente resuspender las células con 200 l de tampón de hielo frío, y repetir la etapa de lavado una vez más. </li><li> Añadir 200 l de medio RPMI completo a la placa, y repetir el paso de lavado una vez más. </li><li> Preparar las concentraciones de trabajo de 2 l / ml GolgiPlug y / ml de LPS 10 g utilizando medio RPMI completo y añadir 200 l a cada pocillo. </li><li> Incubar la placa durante 6 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Al final de la etapa 9.8, se lavan las células con tampón (4 ° C) y girando a 300g durante 3 min a 4 ° C. </li><li> Añadir 100 l de Cytofix a cada pocillo e incubar durante 20 min a 4 ° C. </li><li> Lavar las células 3 veces como se ha descrito en el paso 9.9 con 1x PermWash (4 ° C) a 300 xg durante 3 min a 4 ° C. </li><li> Añadir 45 l de 1x Cytoperm a cada pocillo seguido de 5 l de cada de uno de los siguientes anticuerpos a cada pocillo: TNF-α-Alexa Fluor 488, IFN-γ V500, MIP-1α PE. Incubar a 4 ° C durante 30 min. </li><li> Lavar las células dos veces tal como se describe en el paso 9.9 con 1x PermWash (4 ° C) y una vez con tampón (4 ° C) a 300 xg durante 3 min a 4 ° C. </li><li> Resuspender las células con 200 l de 2% de paraformaldehído (4 ° C). Transferir las células en tubos de 12 x 75 mm, y analizar las muestras en el citómetro de flujo. PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es corrosivo, tóxico agudo y un peligro para la salud. </li></ol> 10. K562 Ensayo Matar NOTA: K562 células deben cultivarseen cultivo a 37 ° C y 5% de CO 2 con medio RPMI completo hasta que alcanzan 80% de confluencia antes del ensayo. <ol><li> Preparar una solución de 5 mM de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) stock mediante la adición de 18 l de DMSO al vial. </li><li> Diluir WS-CM o la nicotina en una placa de 96 pocillos usando medio RPMI completo hasta un volumen total de 100 l / pocillo para lograr las unidades de equi-nicotina deseada o las concentraciones de nicotina para cada pocillo. PRECAUCIÓN: La nicotina es muy tóxico y peligroso para el medio ambiente. </li><li> Añadir 100 l de PBMCs en medio RPMI completo a una concentración de 1,5 x 10 6 células / pocillo. El volumen total de células con WS-CM o la nicotina será de 200 l / pocillo. </li><li> Cubrir la placa e incubar durante 3 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Lavar las células K562 mediante la adición de 10 ml de DPBS y centrifugar a 400 xg durante 8 min a TA. </li><li> Resuspender las células con 10 ml de DPBS y contar las células K562. </li><li> Preparar CFSE working solución mediante la adición de 1 l de solución madre CFSE a 1 ml de DPBS. </li><li> Añadir 1 ml de la solución de trabajo CFSE a 1 ml de la suspensión de células K562 que contiene 1 - 2 x 10 7 células. Vortex y se incuba precisamente por 2 min a TA. </li><li> Inmediatamente añadir 200 l de FBS. Vortex y se incuba precisamente por 2 min a TA. </li><li> Añadir 10 ml de medio RPMI completo y se centrifuga el tubo a 400 xg durante 8 min a TA. </li><li> Eliminar el sobrenadante RPMI y romper la pastilla y resuspender las células con 10 ml de medio completo RPMI y contar las células K562 marcadas con CFSE. </li><li> Lavar las PBMCs por centrifugación de la placa a 300 xg durante 3 min a TA. Aspirar el sobrenadante por decantación del líquido. Vuelva a colocar la tapa y agite la parte inferior de la placa. Añadir 200 l de medio RPMI completo y repita el paso de lavado una vez más. </li><li> Añadir células K562 marcadas con CFSE en una proporción de 01:15 (100.000 K562s: 1,5 x 10 6 PBMCs) a cada pocillo de muestra de la placa de PBMC y más incubate durante 5 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. </li><li> Lavar la mezcla de células por centrifugación a 300 xg durante 3 min a TA. Aspirar el sobrenadante por desechar el líquido. Coloque la tapa y agitar la parte inferior de la placa. </li><li> Añadir 200 l de tampón y repetir el paso de lavado descrito en la etapa 10.14 una vez más. </li><li> Añadir 95 l de tampón de ejecución seguido de 5 l de 7AAD a cada pocillo para un volumen total de 100 l / pocillo. Se incuba la placa en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 min. </li><li> Añadir 100 l de tampón a cada pocillo y transferir todo el volumen de suspensión de células de cada pocillo de la placa a los tubos de racimo y adquirir las muestras en el citómetro de flujo. </li><li> Determinar el porcentaje de células 7AAD-positivos y CFSE-positivos utilizando citometría de flujo de software de análisis. </li></ol>

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The authors declare that there are no conflicts of interest.

Nosotros y otros han demostrado previamente que el tratamiento de las PBMC con TPPs suprime varias respuestas, incluyendo la expresión y secreción de citoquinas y medidas funcionales tales como célula diana matando a 14. Los métodos experimentales descritos en el anterior trabajo requieren períodos de incubación más largos y fueron modestos en magnitud 14. Teniendo en cuenta las posibles aplicaciones de este atractivo modelo ex vivo para la investigación básica y aplicada, se inve...

Un importante conjunto de puntos de conocimiento a los efectos adversos para la salud del tabaquismo crónico, incluyendo la enfermedad cardiovascular (ECV), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y el cáncer de 1,2. Fumar cigarrillos crónica se ha sabido para causar la inflamación y la supresión inmune, y estas alteraciones se informó de contribuir a un mayor riesgo de infección microbiana y el cáncer en fumadores 3. In vitro y técnicas ex vivo son útiles en la elucidación de la base molecular de los efectos fisiopatológicos de el humo del cigarrillo 4-9 (Tabla 1) y se reconocen como importantes herramientas para guiar la regulación emergente de diversos productos del tabaco 10,11. Por ejemplo, hemos demostrado que materias inflamables de productos de tabaco (TPP), como medio de todo el humo acondicionado (WS-CM) y partículas totales (TPM) son mucho más citotóxica y perjudicial paraADN de los TPP no combustibles o la nicotina 12,13. De acuerdo con el trabajo publicado, se informó recientemente que los TPP combustibles o la nicotina 12,13. De acuerdo con el trabajo publicado, recientemente informó de que los TPP combustibles causados ​​inmunosupresión marcada. Esto se evidenció por la supresión de Toll-like receptor (TLR) -ligands, estimulado la secreción de citoquinas y célula diana (K562) matando por PBMCs en un modelo ex vivo 14. Dada la importancia de la inflamación en los procesos de enfermedad inducida por el humo de cigarrillos, una mayor optimización de las condiciones de ensayo para evaluar los efectos inmunomoduladores del humo del cigarrillo se presenta en este informe. Los ensayos ex vivo miden típicamente intracelular y citoquinas, así como la función citolítica de las células T citotóxicas y NK en células K562 matar ensayos de 14 secretadas. Los ensayos implicados pre-incubación con WS-CM y la nicotina y la posterior estimulación de PBMCs con TLR agonistas durante un período de 3 días; las lecturas finales se realizaron usando ensayos de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) y / o citometría de flujo. Hemos utilizado lipopolisacárido bacteriano (LPS), que se une a los receptores TLR-4 y estimula PBMCs que resulta en la producción de citocinas intracelulares y la secreción de citocinas. Además de la optimización de las diferentes etapas del ensayo para evaluar los efectos inmunomoduladores de TPP, nosotros también presentes métodos para el aislamiento de PBMCs, ensayos de muerte celular, y IL-8 cuantificación. Estos métodos pueden ser aplicados para abordar otras cuestiones de investigación y perfeccionar todavía más para evaluar los productos del tabaco en el marco regulatorio. Tabla 1. publicado informes de métodos in vitro y ex vivo utilizan para estudiar varilus efectos fisiopatológicos de las preparaciones de los productos de tabaco CS, medio humo del cigarrillo.; CSC, cigarrillo condensado de humo; CSE, extracto de humo de cigarrillo; ELISA, enzima-ensayo de inmunoabsorción ligado; GADPH, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa; qPCR, reacción de cadena de polimerasa cuantitativa; RT, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real; TS, humo de tabaco. <table><tbody><tr><td> Autor (año de estudio) </td><td> Laan et al. (2004) </td><td> Moodie et al. (2004) </td><td> Oltmanns et al. (2005) </td><td> Vayssier (1998) </td><td> Witherden et al. (2004) </td><td> Birrell et al. (2008) </td></tr><tr><td> Las células utilizadas </td><td> Células bronquiales humanas endotelio (BEAS-2B), neutrófilos humanos </td><td> Células epiteliales alveolares humanos (A549) </td><td> Las células del músculo liso de las vías respiratorias Humanos (HASMC) </td><td> Las células humanas U937 premonocítica, monocitos humanos </td><td> Alveolares tipo II las células epiteliales (ATII) </td><td> Monocítica humanalínea celular (THP-1), macrófagos pulmonares humanos </td></tr><tr><td> TPP utilizado </td><td> CSE </td><td> CSC </td><td> CSE </td><td> TS </td><td> CSE </td><td> CS </td></tr><tr><td> Método utilizado </td><td> ELISA, qPCR, migración, cambio electromovilidad </td><td> Inmunohistoquímica, electroforesis, kit ArrayScan, RT-PCR, ELISA </td><td> ELISA, RT-PCR, qPCR, electroforesis </td><td> Gel cambio de la movilidad </td><td> Microscopía de luz, microscopía electrónica, electroforesis, ELISA </td><td> qPCR, ELISA, kit E-Toxate (Sigma), ensayo de placa de p65 (TransAM), electroforesis, varios kits de inmunoensayo </td></tr><tr><td> Medida </td><td> IL-8, GM-CF, AP-1, NF-kB, la migración </td><td> Acetiltransferasas histonas, las histonas desacetilasas, NF-kB, IL-8, pI kappa B-α, GADPH </td><td> HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, eotaxina </td><td> Proteínas de estrés / tensión (HSP / Hsp70), factor de transcripción HF, NF-kB,TNF-α </td><td> Proteína surfactante (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, TNF-α, IL-1β, IFN-γ </td><td> IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, MAPK / JNK / fosforilación de ERK, cJUN: unión a ADN, el glutatión, p65: unión al ADN </td></tr><tr><td> Resultado final </td><td> CSE regula a la baja la producción de citoquinas a través de la supresión de la AP-1 de activación. </td><td> H 2 O 2 y CSC mejorar la acetilación de las histonas, disminuir la actividad de la histona deacetilasa, diferencialmente regular la liberación de citoquinas proinflamatorias. </td><td> El humo del cigarrillo puede causar la liberación de IL-8 de HASMC, reforzada por TNF-α, 20% CSE menos IL-8 liberación, inhibición de la eotaxina y RANTES por el humo del cigarrillo. </td><td> TS factor de transcripción HF, que se asoció con sobreexpresión de Hsp70 y la inhibición de la actividad NFkB y la liberación de TNF-α vinculante activados. </td><td> Reducción ATII niveles de quimioquinas derivadas de células compromiso alveoreparación lar, contribuyendo al cigarrillo daños y enfisema alveolar inducida por el humo. </td><td> Los datos proporcionan explicación mecanicista de por qué los fumadores han aumentado las infecciones respiratorias. Supresión de la respuesta innata está acompañado por un aumento en IL-8. </td></tr></tbody></table>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="712">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:148px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:223px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">12 X 75 tubes</td>
			<td style="width:148px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">15 ml conical tubes</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">2 mL Microtubes</td>
			<td style="width:148px;">Axygen</td>
			<td style="width:119px;">MCT-150-C-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">3R4F reference cigarettes&#160;&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Univ. of Kentucky, College of Agriculture</td>
			<td style="width:119px;">3R4F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">500 ml bottle</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">7AAD</td>
			<td style="width:148px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:119px;">559925</td>
			<td style="width:223px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96 well flat bottom plate</td>
			<td>Termo Nunc</td>
			<td>439454</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">96 well round bottom plates</td>
			<td style="width:148px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cell culture hood</td>
			<td style="width:148px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1300 Series A2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:148px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">58110R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">CFSE</td>
			<td style="width:148px;">Molecular Probes Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cluster tubes</td>
			<td style="width:148px;">Corning</td>
			<td>4401</td>
			<td>Harmful if swallowed, carcinogen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Cytofix/Cytoperm (Permwash)</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555028</td>
			<td>Flammable</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DMSO (Dimethyl sulfoxide )</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">DPBS</td>
			<td style="width:148px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">17-512F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">FBS</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">FCAP Array</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">652099</td>
			<td>Software analyzes CBA data</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Filter unit</td>
			<td style="width:148px;">Nalgene</td>
			<td style="width:119px;">156-4020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Flow Cytometer</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">FACS Canto II</td>
			<td>&#160;8 colors, at Ex 405 and Em785.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Flow Cytometer</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">FACS Calibur</td>
			<td>&#160;4 colors at Ex 495 and Em 785.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Flow cytometry analysis software</td>
			<td style="width:148px;">Tree Star</td>
			<td style="width:119px;">FlowJo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Freezing Container</td>
			<td style="width:148px;">Nalgene</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>Contains DMSO,&#160; irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">GogliPlug</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555029</td>
			<td>Carcinogen, Irritant, Corrosive&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:223px;">H2SO4</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">339741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Human Inflammatory Cytokine Kit</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">551811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">IFN-&#947; V-500 Antibody</td>
			<td style="width:148px;">BD Horizon</td>
			<td style="width:119px;">561980</td>
			<td>&#160;skin sensitizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">IL-8 ELISA Kit</td>
			<td style="width:148px;">R and D Systems</td>
			<td style="width:119px;">DY208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Isolation Buffer</td>
			<td style="width:148px;">Isolymph, CTL Scientific Corp.</td>
			<td style="width:119px;">1114868</td>
			<td>Flammable liquid, Irritant&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:148px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">LPS</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">MIP1-&#945; PE Antibody</td>
			<td style="width:148px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:119px;">554730</td>
			<td>Acute toxicity, Oral</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Monensin</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M5273</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">NaCl</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotine</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">N3876</td>
			<td>Acute toxicity, Environmental hazard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Parafilm</td>
			<td style="width:148px;">Bemis</td>
			<td style="width:119px;">&#8220;M&#8221;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td>Flammable, Skin irritation&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">Pen/strep</td>
			<td style="width:148px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:223px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:148px;">Gibco Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:223px;">Running buffer</td>
			<td style="width:148px;">MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech</td>
			<td style="width:119px;">130-091-221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Th1/Th2 CBA Kit</td>
			<td style="width:148px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">551809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:223px;">TNF-&#945; Alexa Fluor 488 Antibody</td>
			<td style="width:148px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">502915</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Transfer pipette</td>
			<td style="width:148px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-711-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Tris Base</td>
			<td style="width:148px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to evaluate cytotoxicity and immunosuppression of combustible tobacco product preparations

Entre otros cambios fisiopatológicos, la exposición crónica al humo del cigarrillo provoca inflamación y la supresión inmune, que han sido vinculados a un aumento de la susceptibilidad de los fumadores a infecciones microbianas y la incidencia de tumores. Ex vivo supresión de las respuestas inmunes mediadas por el receptor en las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) tratado con los componentes del humo es un enfoque atractivo para estudiar los mecanismos y evaluar los probables efectos a largo plazo de la exposición a los productos de tabaco. Aquí, hemos optimizado los métodos para llevar a cabo ensayos ex vivo utilizando PBMCs estimulados por lipopolisacárido bacteriano, un receptor-4 ligando Toll-like. Los efectos del humo de medio acondicionado conjunto (WS-CM), una preparación de productos de tabaco combustible (TPP), y la nicotina se investigaron sobre la secreción de citoquinas y la destrucción de células diana por PBMCs en los ensayos ex vivo. Se demuestra que las citoquinas secretadas IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6 e IL-8 y citoquinas intracelulares IFN47 ;, TNF-α, y MIP-1α fueron suprimidos en PBMCs expuestos-WS-CM. La función citolítica de PBMCs efectoras, tal como se determina mediante un ensayo de célula diana K562 matar se redujo también por la exposición a WS-CM; nicotina era mínimamente eficaz en estos ensayos. En resumen, presentamos un conjunto de ensayos mejorados para evaluar los efectos de los TPP en ensayos ex vivo, y estos métodos podrían adaptarse fácilmente para probar otros productos de interés.

Los resultados se presentan como media ± error estándar de la media (cuatro muestras de donantes). Se realizó la prueba t del estudiante entre las muestras de control de tratados y no tratados utilizando el software Excel, así como comparaciones de la prueba t para todos los tratamientos con sus correspondientes controles. La significación estadística se indica con: *, P &lt;0,05; **, P &lt;0,005; ***, P &lt;0,0005. Para medir el efecto de la exposición a WS-CM y la nicotina, PBMCs se...

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Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations

Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure.

Métodos para evaluar la citotoxicidad y la inmunosupresión de Combustible Tabaco Preparativos del producto

Among other pathophysiological changes, chronic exposure to cigarette smoke causes inflammation and immune suppression, which have been linked to ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.3K vistas.  Wake Forest University Health Sciences. Using optimized human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) ex vivo assays, we showed that a combustible tobacco product preparation markedly suppresses receptor-mediated intracellularly secreted cytokines and cytolytic ability of effector PBMCs. These rapid assays may be useful in product evaluation and understanding the potential long-term effects of tobacco exposure. 

Video: Methods to Evaluate Cytotoxicity and Immunosuppression of Combustible Tobacco Product Preparations

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

Método de aglutinación de partículas para la identificación de poliovirus

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Investigación

Inmunología e Infección

Two Methods of Heterokaryon Formation to Discover HCV Restriction Factors

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in human non-hepatic and murine cell lines, the efficiency was very low and required long-term selection procedures using HCV replicon constructs expressing dominant antibiotic-selectable markers1-5. HCV in vitro research is therefore limited to human hepatoma cell lines permissive for virus entry and completion of the viral life cycle. Due to HCVs narrow species tropism, there is no immunocompetent small animal model available that sustains the complete HCV replication cycle 6-8. Inefficient replication of HCV in non-human cells e.g. of mouse origin is likely due to lack of genetic incompatibility of essential host dependency factors and/or expression of restriction factors.
We investigated whether HCV propagation is suppressed by dominant restriction factors in either human cell lines derived from non-hepatic tissues or in mouse liver cell lines. To this end, we developed two independent conditional trans-complementation methods relying on somatic cell fusion. In both cases, completion of the viral replication cycle is only possible in the heterokaryons. Consequently, successful trans-complementation, which is determined by measuring de novo production of infectious viral progeny, indicates absence of dominant restrictions.
Specifically, subgenomic HCV replicons carrying a luciferase transgene were transfected into highly permissive human hepatoma cells (Huh-7.5 cells). Subsequently, these cells were co-cultured and fused to various human and murine cells expressing HCV structural proteins core, envelope 1 and 2 (E1, E2) and accessory proteins p7 and NS2. Provided that cell fusion was initiated by treatment with polyethylene-glycol (PEG), the culture released infectious viral particles which infected na&iuml;ve cells in a receptor-dependent fashion.
To assess the influence of dominant restrictions on the complete viral life cycle including cell entry, RNA translation, replication and virus assembly, we took advantage of a human liver cell line (Huh-7 Lunet N cells 9) which lacks endogenous expression of CD81, an essential entry factor of HCV. In the absence of ectopically expressed CD81, these cells are essentially refractory to HCV infection 10 . Importantly, when co-cultured and fused with cells that express human CD81 but lack at least another crucial cell entry factor (i.e. SR-BI, CLDN1, OCLN), only the resulting heterokaryons display the complete set of HCV entry factors requisite for infection. Therefore, to analyze if dominant restriction factors suppress completion of the HCV replication cycle, we fused Lunet N cells with various cells from human and mouse origin which fulfill the above mentioned criteria. When co-cultured cells were transfected with a highly fusogenic viral envelope protein mutant of the prototype foamy virus (PFV11) and subsequently challenged with infectious HCV particles (HCVcc), de novo production of infectious virus was observed. This indicates that HCV successfully completed its replication cycle in heterokaryons thus ruling out expression of dominant restriction factors in these cell lines. These novel conditional trans-complementation methods will be useful to screen a large panel of cell lines and primary cells for expression of HCV-specific dominant restriction factors.

We describe two methods for conditional trans-complementation of hepatitis C virus (HCV) assembly and the completion of the full viral life cycle, which rely on heterokaryon formation. These techniques are suitable to screen for cell lines that express dominant restriction factors, which preclude production of infectious HCV progeny.

Dos Métodos de Formación heterocarión para descubrir los factores de restricción del VHC

Hepatitis C virus (HCV) is a hepatotropic virus with a host-range restricted to humans and chimpanzees. Although HCV RNA replication has been observed in ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Cuantitativo de alto rendimiento de una sola célula de ensayo de citotoxicidad de las células T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

Establecimiento y Optimización de una instalación de alto rendimiento para el Estudio<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Y<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; La infección como modelo para el descubrimiento de fármacos

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

Here we describe a newly developed hepatitis B virus (HBV) reporter system to monitor the early stages of the HBV life cycle. This simplified in vitro system will aid in the screening of anti-HBV agents using a high-throughput strategy.

Desarrollo de un sistema reportero virus de la hepatitis B para supervisar las primeras etapas del ciclo de replicación

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&amp;#947; Receptor-mediated Phagocytosis

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

El uso de una monocapa de monocitos Ensayo para evaluar la fagocitosis mediada por el receptor Fc gamma

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to stimulate cell migration. Importantly, cell migration is a rate-limiting event during the wound-healing process to re-establish the integrity and normal function of tissue layers after injury. The advantage of this method over the classical assay, which is based on a manually made scratch in a cell monolayer, is the usage of special silicone culture inserts providing two compartments to create a cell-free pseudo-wound field with a well-defined width (500 &#956;m). In addition, due to an automated image analysis platform, it is possible to rapidly obtain quantitative data on the speed of wound closure and cell migration. More precisely, the effect of two frog-skin AMPs on the migration of bronchial epithelial cells will be shown. Furthermore, pretreatment of these cells with specific inhibitors will provide information on the molecular mechanisms underlying such events.

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Here, we present a protocol to evaluate the effect of peptides on the migration of bronchial epithelial cells. This method allows for the rapid and highly reproducible obtainment of quantitative data on the speed of cell migration and wound closure.

Una novela In Vitro de la herida curativa ensayo para evaluar la migración de la célula

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

Design of Cecal Ligation and Puncture and Intranasal Infection Dual Model of Sepsis-Induced Immunosuppression

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple organs. With the development of therapies, most patients survive the hyperinflammatory phase but progress to an immunosuppressive phase, which increases the emergence of secondary infections. Therefore, improved understanding of the pathogenesis underlying secondary hospital-acquired infections in the immunosuppressive phase during sepsis is of tremendous importance. Reported here is a model to test infectious outcomes by creating double-hit infections in mice. A standard surgical procedure is used to induce polymicrobial peritonitis by cecal ligation and puncture (CLP) and followed by intranasal infection of Staphylococcus aureus to simulate pneumonia occurring in immune suppression that is frequently seen in septic patients. This dual model can reflect the immunosuppressive state occurring in patients with protracted sepsis and susceptibility to secondary infection from nosocomial pneumonia. Hence, this model provides a simple experimental approach to investigate the pathophysiology of sepsis-induced secondary bacterial pneumonia, which may be used for discovering novel treatments for sepsis and its complications.

This protocol describes techniques to measure infectious outcomes underlying secondary hospital-acquired infections in the immunosuppressive condition, first by establishing cecal ligation/puncture mice then challenging them with intranasal infection to create a clinically relevant model of immunosuppression sepsis.

Diseño de Ligadura Cecal y Punción e Infección Intranasal Modelo Dual de Inmunosupresión Inducida por Sepsis

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte (CTL) responses elicited against tumor- and pathogen-derived peptides. They offer several advantages over traditional killing assays. First, they permit the monitoring of CTL-mediated cytotoxicity within architecturally intact secondary lymphoid organs, typically in the spleen. Second, they allow for mechanistic studies during the priming, effector and recall phases of CTL responses. Third, they provide useful platforms for vaccine/drug efficacy testing in a truly in vivo setting. Here, we provide an optimized protocol for the examination of concomitant CTL responses against more than one peptide epitope of a model tumor antigen (Ag), namely, simian virus 40 (SV40)-encoded large T Ag (T Ag). Like most other clinically relevant tumor proteins, T Ag harbors many potentially immunogenic peptides. However, only four such peptides induce detectable CTL responses in C57BL/6 mice. These responses are consistently arranged in a hierarchical order based on their magnitude, which forms the basis for TCD8 &#8220;immunodominance&#8221; in this powerful system. Accordingly, the bulk of the T Ag-specific TCD8 response is focused against a single immunodominant epitope while the other three epitopes are recognized and responded to only weakly. Immunodominance compromises the breadth of antitumor TCD8 responses and is, as such, considered by many as an impediment to successful vaccination against cancer. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular factors and mechanisms that dictate or shape TCD8 immunodominance. The protocol we describe here is tailored to the investigation of this phenomenon in the T Ag immunization model, but can be readily modified and extended to similar studies in other tumor models. We provide examples of how the impact of experimental immunotherapeutic interventions can be measured using in vivo cytotoxicity assays.

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

We describe here a flow cytometry-based in vivo killing assay that enables examination of immunodominance in cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses to a model tumor antigen. We provide examples of how this elegant assay may be employed for mechanistic studies and for drug efficacy testing.

Confección de ensayos de citotoxicidad in vivo para estudiar inmunodominancia en respuestas de células T CD8+ específicas de tumores

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

Prueba IN Vitro ELISA para evaluar la potencia de la vacuna contra la rabia

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...