Estamos muy agradecidos a Leonie de Boer y Bas Zaat (Centro Médico Académico) por darnos la S. cepa epidermidis O-47. Agradecemos Rico Bongaarts, Francis Smet y Angela Comas (Unión Biometrica) en busca de ayuda y asesoramiento con el COPAS XL y análisis Bioimager VAST. Agradecemos a Davy de Witt, Ulrike Nehrdich y Laura van Hulst, de portería peces, y otros colegas de la Universidad de Leiden útil para los debates. Esta investigación forma parte del Proyecto P5.03 IBIZA del programa de investigación del Instituto de Biomédica Materiales, co-financiado por el Ministerio holandés de Asuntos Económicos, y del Programa de Mix Inteligente (NWOA_6QY9BM) del Ministerio de Asuntos Económicos de los Países Bajos y El Ministerio holandés de Educación, Cultura y Ciencia. El apoyo adicional se obtuvo a partir del proyecto de la UE ZF-Salud (FP7-HEALTH-2009-242.048), y RMJ fue apoyado por becas Marie Curie como investigador experimentado en la formación inicial de la red FishForPharma (PITN-GA-201 de la UE1-289209). SJR recibió fondos de la Iniciativa sobre Medicamentos Innovadores empresa común en virtud del acuerdo de subvención n ° 115337, los recursos de los que se componen de la contribución financiera del Séptimo Programa Marco de la Unión Europea (FP7/2007-2013) y las empresas de la EFPIA en autores contribution.The amables RECONOCE el apoyo financiero del Fondo de la Universidad de Leiden (LUF) para la robótica y de Cyttron, en el programa de Subvenciones Investeringen Kennisinfrastructuur Besluit, que a su vez cuenta con el apoyo financiero de la Organización Holandesa para la Investigación Científica de las instalaciones de formación de imágenes. La adquisición del sistema COPAS fue parcialmente apoyado por la División de la Tierra y Ciencias de la Vida (ALW) con la ayuda financiera de la Organización Holandesa para la Investigación Científica (NWO, 834.10.004).

1. Cepas bacterianas y condiciones de cultivo <ol><li> Preparar S. epidermidis inóculo <ol><li> Tome varias colonias individuales de S. epidermidis cepa S-47, que contiene un vector de expresión deriva pWVW189 mCherry (De Boer L. no publicado) a partir de un medio Luria Bertani (LB) placa de agar suplementado con 10 mg / ml de cultivo y cloranfenicol durante la noche a 37 ° C en 25 ml de medio LB suplementado con 10 mg / ml de cloranfenicol a midlog etapa. </li><li> Centrifugar 1 ml del cultivo a 12.000 xg durante 1 min y, posteriormente, se lavan 3 veces con ellos 1 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS) con 0,3% (v / v) de Tween-80. </li><li> Medir la densidad óptica a 600 nm (DO 600), y diluir la suspensión bacteriana a una DO 600 de 0,3 en 2% (w / v) de polivinilpirrolidona 40 (pvp 40) en PBS. Nota: un OD 600 de 0,3 corresponde a 1,0 x 10 8 unidades formadoras de colonias / ml (ufc / ml). </li></ol&gt; </li><li> Preparar M. marinum inóculo <ol><li> Tome varias colonias individuales de M. marinum cepa M o E11 contiene el vector pSMT3-mCherry que expresan establemente mCherry 10 de una placa de agar Middlebrook 7H10 con 10% (v / v) de enriquecimiento de Middlebrook OADC suplementado con 50 mg / ml de higromicina y la cultura durante la noche a 28 ° C en 10 ml de caldo de Middlebrook 7H9 con 10% (v / v) de enriquecimiento de Middlebrook ADC suplementado con 50 g / ml de higromicina. </li><li> Centrifugar 1 ml del cultivo a 12.000 xg durante 1 min y, posteriormente, la lavan 3 veces con 1 ml de PBS estéril con 0,3% (v / v) de Tween-80. </li><li> Medir el diámetro exterior 600, y diluir la suspensión bacteriana a una DO 600 de 0,3 en 2% (w / v) pvp 40 en PBS. Nota: un OD 600 de 1 corresponde a 1,0 x 10 8 ufc / ml. </li></ol></li></ol> 2. Preparar huevos de pez cebra <ol><li> Coloque un máximo de 70 hombres y 50 mujeres ty salvajepe pez cebra por separado en el recipiente de cría de gran tamaño. Nota: Coloque el pescado de la mujer en la parte inferior del recipiente de cría de gran tamaño. </li><li> Retire el separador al día siguiente por la mañana, para que el pez cebra se inicia la reproducción. </li><li> Recoger los huevos en la parte inferior del criadero flotante grande a través del colector de huevo en un tubo de 50 ml llena con agua de huevo (60 g de sal marina Instant Ocean ml /). </li></ol> 3. Las agujas de inyección <ol><li> Obtener disponibles comercialmente por encargo agujas capilares de vidrio con un diámetro interno de 10 micras. </li></ol> 4. Esquema experimental de Inyección <ol><li> Hervir 100 ml de 1% (w / v) de agarosa en agua de huevo y fresco hasta aproximadamente 40 º C. Verter en la placa de agarosa microinyectores automatizado y colocar el sello de 1024-hasta bien entrada la agarosa. Nota: La placa está listo para usar cuando se enfría. </li><li> Por microinyector operativo de software automatizado clic en &quot;Calibrar etapa &#39;,a continuación, haga clic en la parrilla bien &#39;1024 &#39;y coloque la placa de agarosa en microinyector y calibrar la placa haciendo clic en la pantalla en la posición del centro del pozo. </li><li> Ir al menú &#39;aguja&#39; y haga clic en &quot;soporte de la aguja de calibración &#39;. </li><li> Llene la aguja de inyección usando una punta microloader con 10 l pvp 40 que contiene 100 ufc / nl S. epidermidis o 30 ufc / nl M. marinum o uso pvp 40 como inyección simulada. </li><li> Coloque la aguja en el micro-inyector automatizado y calibrar la posición x, y al bajar o mover la aguja hacia arriba y haciendo clic en la pantalla en la posición de la aguja. Luego calibrar la posición z de la aguja haciendo clic en la pantalla en la posición de la punta de la aguja. </li><li> Distribuya los huevos sobre la cuadrícula de agarosa utilizando una pipeta de plástico y retire el exceso de agua del huevo. Coloque la rejilla de agarosa en el microinyector automatizado. </li><li> Ir a la &#39;injectioMenú n &#39;y cambie la &quot;presión de inyección&quot; establecer a 200 hPa,&#39; Tiempo de inyección &#39;0.2 segundos y la &quot;presión de Compensación&#39; 15 hPa, que se correlaciona con 1 nl, en el menú de ajustes FemtoJet. </li><li> Haga clic en &#39;Inyectar todo&#39; para inyectar toda la placa. </li><li> Recoger los huevos después de la inyección mediante el lavado de ellos en una placa de Petri (92 x 16 mm), con un máximo de 70 embriones por placa de Petri, y se incuba a 28 ° C. </li></ol> 5. Análisis citómetro de flujo <ol><li> Preparar el flujo de partícula grande citómetro de acuerdo con las instrucciones del fabricante y llenar la copa de muestra y el contenedor de fluido de funda con agua huevo. </li><li> En el software operativo, vaya al menú &quot;PMT&quot; y utilizar los siguientes valores: 650 V para el canal &#39;Red&#39; y 0 V para la &#39;Verde&#39; y canales &#39;Yellow&#39;. A continuación, vaya al menú &quot;Umbrales&quot; y utilice la siguiente configuración: &#39;Optical densidad &#39;señal de umbral: 975 mV (valor COPAS XL: 50) y el &quot;tiempo de vuelo&quot; (TOF) como mínimo a 320 microsegundos (valor COPAS XL: 800) con el fin de reducir la influencia de los escombros. </li><li> Para el análisis sin clasificar los embriones vaya al paso 5.4, para el análisis y la clasificación de los embriones en una placa de Petri vaya al paso 5.5 o para el análisis y la clasificación de los embriones en una placa de 96 pocillos vaya al paso 5.6. </li><li> Colocar los embriones en la copa de muestra y haga clic en &quot;Inicio&quot; para iniciar el análisis. Cuando se analizan los embriones detener el análisis, haga clic en &#39;stop&#39;. Guarde los datos haciendo clic en &quot;tienda de todo &#39;. Nota: Todos los datos se almacenan como TXT, LMD, DAT, archivos CSV y MRSE. Siga el protocolo en el paso 5.7. </li><li> Colocar los embriones en el recipiente para muestras y definir el máximo de 70 embriones por placa para ser resuelto mediante la introducción de 70 en el menú &quot;Ordenar&quot;. Coloque un plato vacío Petri bajo el clasificador y haga clic en &#39;Ordenar Manual&#39;. Cuando el di Petri<html> sh está lleno, guardar los datos haciendo clic en &quot;Tienda de todos&quot;. Nota: Todos los datos se almacenan como TXT, LMD, DAT, archivos CSV y MRSE. Siga el protocolo en el paso 5.7. </li><li> Colocar los embriones en el recipiente para muestras y definir el máximo de 1 embrión por pocillo para ser resuelto mediante la introducción de 1 en el menú &quot;Ordenar&quot;. Coloque una placa de 96 pocillos vacíos en el soporte de la placa de la izquierda y haz clic en &quot;Fill placa &#39;. Cuando se llena la placa de 96 pocillos, guardar los datos haciendo clic en &quot;tienda de todo &#39;. Nota: Todos los datos se almacenan como TXT, LMD, DAT, archivos CSV y MRSE. Siga el protocolo en el paso 5.7. </li><li> Obtener el archivo TXT para procesar los datos en bruto, utilice los siguientes ajustes de filtro de datos: &#39;seleccione Estado&#39;: 40, y si se utiliza el módulo de clase &#39;Estado sort&#39;:. 6 A continuación, utilice los números de la señal de fluorescencia total de la &#39;Red &#39;canal para calcular la media y el error estándar de la media. Trazar estos conjuntos de datos en la barra o de dispersión gráficos. </li></ol>ve_title &quot;&gt; 6. Tratamiento de Drogas <ol><li> Analizar e inyección especie a los 3 días post (dpi), M. marinum infectado embriones en dos grupos iguales utilizando la partícula grande citómetro de flujo (paso 5.5). Tratar a un grupo con un compuesto de interés en su vehículo disolvente y otro con disolvente portador solo (control). Aplicar tratamientos similares para burlarse de control inyectado a la prueba de los efectos secundarios de los antibióticos. </li><li> Repetir a las 4 y 5 dpi análisis (paso 5.5) y refrescar el agua de huevo o agua de huevo que contiene el compuesto. </li></ol> 7. Imágenes de alta resolución <ol><li> Anestesie los embriones con 0,02% (w / v) tamponada éster etílico del ácido 3-aminobenzoico (tricaína) en agua de huevo 10 min antes del análisis. </li><li> Prepare el sistema de tecnología de tramado de Vertebrados automatizado y el sampler de partículas Large acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Seleccione las imágenes de referencia correspondientes a la edad de los embriones del &#39;Imaging - Objeto211; Menú Configuración de detección ». </li><li> Seleccione la cantidad de imágenes y orientación a realizar por el sistema de tecnología de tramado de Vertebrados Automatizado del &#39;Imaging - Almacenamiento automático de imágenes &quot;del menú. </li><li> Coloque una placa de 96 pocillos llenos de embriones (desde el paso 5.6) en el soporte de la placa izquierda de la partícula grande Sampler, y haga clic en &quot;Ejecutar placa &#39;. </li><li> Cuando se detecta un embrión y correctamente posicionado; la imagen de la cabeza y la cola por separado con el CLSM utilizando un objetivo de llanura seca 10X y unir las imágenes después utilizando el software de procesamiento de imágenes. </li></ol>

<ol>
	<li>Meijer, A. H., Spaink, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-pathogen+interactions+made+transparent+with+the+zebrafish+model.">Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model.</a> Curr Drug Targets. 12, 1000-1017 (2011).</li><li>Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pathogenesis+of+Mycobacterium+marinum+and+Mycobacterium+tuberculosis.">Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis.</a> Cell Microbiol. 10, 1027-1039 (2008).</li><li>Boelens, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterial-associated+persistence+of+Staphylococcus+epidermidis+in+pericatheter+macrophages.">Biomaterial-associated persistence of Staphylococcus epidermidis in pericatheter macrophages.</a> J Infect Dis. 181, 1337-1349 (2000).</li><li>Broekhuizen, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+around+catheters+is+a+niche+for+bacteria+associated+with+medical+device+infection.">Tissue around catheters is a niche for bacteria associated with medical device infection.</a> Crit Care Med. 36, 2395-2402 (2008).</li><li>Busscher, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterial-associated+infection:+locating+the+finish+line+in+the+race+for+the+surface.">Biomaterial-associated infection: locating the finish line in the race for the surface.</a> Sci Transl Med. 4, (2012).</li><li>Benard, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+zebrafish+embryos+with+intracellular+bacterial+pathogens.">Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens.</a> J Vis Exp. , (2012).</li><li>Carvalho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+screen+for+tuberculosis+progression.">A high-throughput screen for tuberculosis progression.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Veneman, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+high+throughput+screening+system+used+for+Staphylococcus+epidermidis+infection+marker+discovery.">A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery.</a> BMC Genomics. 14, 255 (2013).</li><li>Sar, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mycobacterium+marinum+strains+can+be+divided+into+two+distinct+types+based+on+genetic+diversity+and+virulence.">Mycobacterium marinum strains can be divided into two distinct types based on genetic diversity and virulence.</a> Infect Immun. 72, 6306-6312 (2004).</li><li>Stoop, E. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryo+screen+for+mycobacterial+genes+involved+in+the+initiation+of+granuloma+formation+reveals+a+newly+identified+ESX-1+component.">Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component.</a> Disease Model., &amp; Mechanisms. 4, 526-536 (2011).</li><li>Adatto, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+system+for+the+rapid+collection+of+large+numbers+of+developmentally+staged+zebrafish+embryos.">A new system for the rapid collection of large numbers of developmentally staged zebrafish embryos.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Kimmel, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).</li><li>Spaink, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robotic+injection+of+zebrafish+embryos+for+high-throughput+screening+in+disease+models.">Robotic injection of zebrafish embryos for high-throughput screening in disease models.</a> Methods. 62, 246-254 (2013).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish.">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Dev Biol. 248, 307-318 (2002).</li><li>Mathias, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+chronic+inflammation+caused+by+mutation+of+zebrafish+Hai1.">Live imaging of chronic inflammation caused by mutation of zebrafish Hai1.</a> J Cell Sci. 120, 3372-3383 (2007).</li><li>Henkel, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+exomes+of+common+carp+(Cyprinus+carpio)+and+zebrafish+(Danio+rerio).">Comparison of the exomes of common carp (Cyprinus carpio) and zebrafish (Danio rerio).</a> Zebrafish. 9, 59-67 (2012).</li><li>Chang, T. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+automated+cellular-resolution+vertebrate+screening+platform+with+parallel+animal+processing.">Fully automated cellular-resolution vertebrate screening platform with parallel animal processing.</a> Lab on a Chip. 12, 711 (2012).</li><li>Pardo-Martin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+in+vivo+vertebrate+screening.">High-throughput in vivo vertebrate screening.</a> Nature Methods. 7, 634-636 (2010).</li></ol>

JS es propietario de Life Science BV Métodos que produce instrumentos utilizados en este artículo.

La metodología de alto rendimiento se describe en este documento se proporciona una tubería rápida y rentable para la detección de alto número de embriones y larvas de peces con diferentes tipos de infecciones. El uso de la gran criadero flotante en lugar de tanques de cría individuales o familiares tradicionales facilitó el control del proceso de desove y la generación de mayor número de huevos síncronos. Con una versión mejorada del sistema de micro-inyección automatizada 7, es posible inyectar hasta 2.500 huevos casi todos en la misma etapa de célula dentro de 1 h. Con estas actualizaciones y software mejorado que es factible inyectar más huevos que previamente era posible que se pueden utilizar para llevar a cabo grandes pantallas de drogas con la proliferación bacteriana como leer. Sin embargo este método es todavía limitada a la yema de la inyección, otras vías de inyección, por ejemplo, descritos por Benard et al. (2012) 6, esperemos que se incorporarán en el sistema de micro-inyección automatizada en el futuro cercano. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Aunque estos métodos son comparados para el cribado de pez cebra, que sería útil para aplicaciones con otras especies de peces también. Por ejemplo, la carpa común se ha indicado que tienen ventajas para el análisis de drogas. Al igual que el pez cebra, huevos y embriones en fase inicial de la carpa común son transparentes pero con la principal ventaja de su gran tamaño desove de cientos de miles de huevos y la disponibilidad de líneas puras que ofrecen una base genética más constante 16. El análisis de grandes cantidades de embriones infectados se realiza con el alto rendimiento de gran flujo de partículas citómetro. Este dispositivo especie puede analizado embriones en placas de pocillos múltiples o una placa de Petri por lo que es especialmente adecuado para probar un gran número de compuestos. Si se necesita una resolución de imágenes superior, que la configuración se adapta de una manera que el gran flujo de partículas citómetro de la tecnología se puede utilizar para la selección previa y posteriormente analizar las muestras en un medio a travésponer en una resolución más alta. Esto se puede hacer utilizando la tecnología de tramado de Vertebrados automatizado 17, 18. Este dispositivo puede recopilar automáticamente embriones vivos o fijas entre 2 y 7 días después de la fecundación de una placa de múltiples pozo o recipiente a granel, la imagen 360 ° a través de un capilar mediante CLSM o microscopia estéreo y disponer de nuevo en 2 contenedores a granel que permite la selección manual de los embriones basada en las imágenes microscópicas. Futuras mejoras permitirán la clasificación del embrión después de la formación de imágenes en la placa de pocillos múltiples, por lo tanto, por lo que es posible seleccionar automáticamente gran número de embriones individuales en el tiempo con CLSM. Suponiendo que en futuras aplicaciones del sistema de tecnología de tramado vertebrado automatizados también se puede conectar a la gran flujo de partículas citómetro de la tecnología sin la necesidad de larvas de dispensación antes en placas de pocillos múltiples, dará lugar a una clasificación más avanzada. En este trabajo se describe la creación de und optimización de una instalación de alto rendimiento para estudiar S. epidermidis y M. infección marinum como un modelo para el descubrimiento de fármacos. Esto demuestra que el resultado de estas bacterias inyectadas en la yema depende de la etapa de desarrollo de los huevos en el momento de la inyección. La inyección de M. marinum E11 en la etapa de células 16-128 o de la cepa M en la etapa de células 16-64 conduce al mismo patrón de infección como inyección en la vena caudal 2, 6. Sin embargo, esta configuración no se limita a la proliferación de sólo patógenos bacterianos. Se ha demostrado antes que es posible inyectar robóticamente soluciones que contienen ADN, ARN o morfolinos para la transgénesis, la sobre expresión y el gen knock-down estudios, respectivamente 13. Además, se demostró que esta configuración también es útil para el estudio de la proliferación de células cancerosas y la migración. Por lo tanto esta tubería presenta un método versátil para pantallas de alto rendimiento de una variedad de mecanismos de señalización en el contextode la inmunidad innata, aplicada a las enfermedades infecciosas y el desarrollo de cáncer. Estas pantallas se pueden combinar con otros para el descubrimiento de la medicina, sino también con el análisis de los posibles efectos tóxicos de los fármacos aplicables identificados.

Hasta la fecha, el pez cebra (Danio rerio) se ha establecido con éxito como un modelo eficiente para estudiar una variedad de enfermedades infecciosas 1. El embrión de pez cebra ofrece único en posibilidades de formación de imágenes in vivo debido a su transparencia y el gran número de líneas transgénicas reportero existentes que expresan proteínas fluorescentes. Esta poderosa combinación hace posible el seguimiento de diferentes tipos de células inmunes en el tiempo, mientras que la interacción con patógenos tales como Mycobacterium marinum, el pariente más cercano de M. tuberculosis 2, o Staphylococcus epidermidis, el causante principal del biomaterial infección asociada 3-5. Diferentes rutas de infección se pueden utilizar en embriones de pez cebra en función de los propósitos del estudio 6. Una de estas vías de infección es la inyección de yema de las bacterias. La principal ventaja de este método en comparación con los otros es que infecti yemaen se puede realizar de forma automática a través de la inyección robótico, reduciendo significativamente el tiempo de inyección y lo que permite una alta reproducibilidad de la infección 7, 8. El trabajo previo, usando el pez cebra como un alto rendimiento del sistema modelo in vivo para el estudio de S. en epidermidis y M. infección marinum demostró ser acertado 7, 8. Este sistema es capaz de detectar la progresión de la enfermedad a través de la inyección de yema de robótica de embriones tempranos y el uso de la fluorescencia de lectura como una medida para la carga bacteriana. De acuerdo con esta noción, esta configuración ha sido optimizado y establecido una tubería de alto rendimiento altamente eficiente con el potencial de generar un gran número de embriones infectados de forma homogénea y realizar un seguimiento de la progresión de la infección durante el tiempo después del tratamiento con un número de compuestos. Con la configuración establecida es posible generar hasta 8.000 embriones sincrónicos a la pantallapara la progresión de la enfermedad, el procesamiento de esta manera hasta 2.500 embriones por hora. Los embriones se clasifican en función de su carga bacteriana mediante un sistema automatizado, asegurando grupos homogéneos de larvas infectadas. Además, para validar la configuración, efectos de referencia conocidos para prevenir la progresión de la tuberculosis en mamíferos se han probado en embriones infectados con M. cepa marinum E11 o la cepa más virulenta M 9. Este estudio describe en detalle la tubería de alto rendimiento que se ha establecido para ser capaz de generar un gran número de embriones infectados y el posterior análisis de la progresión bacteriana durante el desarrollo y después de tratamiento con compuesto.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H10 agar</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>262710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Middlebrook 7H9 broth</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Middlebrook oleic acid albumin dextrose catalase (OADC) enrichment</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>211886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BBL Middlebrook albumin dextrose catalase (ADC) enrichment</td>
			<td>BD Bioscience, Franklin Lakes, New Jersey, USA</td>
			<td>211887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>L5542</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>L3022</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloramphenicol</td>
			<td>Bio-connect, Huissen, the Netherlands</td>
			<td>16785.03</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hygromycin</td>
			<td>Bio-connect, Huissen, the Netherlands</td>
			<td>25966.01</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-80</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>P1754</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone40</td>
			<td>Calbiochem, San Diego, California, USA&#160;</td>
			<td>529504</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sphaero-Q, Gorinchem, the Netherlands</td>
			<td>S103</td>
			<td>Multiple suppliers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instant ocean sea salt</td>
			<td>Sera Marin, Heinsberg, Germany</td>
			<td>5460</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iSPAWN</td>
			<td>Techniplast, Buguggiate, Italy</td>
			<td>iSPAWN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated microinjection system</td>
			<td>Life Science Methods BV, Leiden, the Netherlands</td>
			<td>Automated microinjection system</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complex Object Particle Analyzer and Sorter XL (COPAS XL)</td>
			<td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td>
			<td>COPAS XL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertebrate Automated Screening Technology BioImager (VAST BioImager)</td>
			<td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td>
			<td>VAST BioImager</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LP Sampler</td>
			<td>Union BioMetrica Inc., Holliston, Massachusetts, USA</td>
			<td>LP Sampler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germany</td>
			<td>TCS SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection needle 10 &#181;m inner diameter</td>
			<td>Qvotek, Mississauga, Canada</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment and optimization of a high throughput setup to study staphylococcus epidermidis and mycobacterium marinum infection as a model for drug discovery

El pez cebra se están convirtiendo en una herramienta valiosa en la fase preclínica de exámenes de detección de drogas como un modelo animal entero con alto rendimiento posibilidades de detección. Ellos se pueden utilizar para cerrar la brecha entre ensayos basados ​​en células en las etapas anteriores y en la validación in vivo en modelos de mamíferos, reduciendo, de esta manera, el número de compuestos que pasan a través de la prueba en los modelos mucho más caros de roedores. En este sentido, en el presente manuscrito se describe una nueva tubería de alto rendimiento utilizando el pez cebra como sistema modelo in vivo para el estudio de Staphylococcus epidermidis y la infección por Mycobacterium marinum. Esta configuración permite la generación y el análisis de gran número de embriones síncronos infectados de forma homogénea. Además, la flexibilidad de la tubería permite al usuario implementar fácilmente otras plataformas para mejorar la resolución del análisis cuando sea necesario. La combinación de la pez cebra junto con innovadora alta TE rendimientochnologies abre el campo de pruebas de drogas y el descubrimiento de nuevas posibilidades no sólo debido a la fuerza de la utilización de un modelo de animal completo, pero también a causa de la gran cantidad de líneas transgénicas disponibles que se pueden utilizar para descifrar el modo de acción de nuevos compuestos.

Los presentes resultados muestran que la tubería de alto rendimiento para estudiar S. epidermidis y M. infección marinum se ha establecido con éxito y que puede ser extendido a otros modelos de la infección. En primer lugar, el uso de la vasija grande de cría (Figura 1A), basado en el sistema publicado por Adatto et al. (2011) 11, permite generar un gran número de huevos síncronos en eventos individuales que ofrezcan un alto control del proceso de desove. Siguiente a ser capaz de inyectar gran número de embriones en un corto período de tiempo, se utilizó una versión mejorada del sistema de micro-inyección automatizado desarrollado previamente 7 (Figura 1A). Para evaluar cual es la mejor etapa de desarrollo para la infección yema de huevo, inyecciones con S. epidermidis y M. marinum se realizaron en todas las diferentes etapas entre células etapa 1 y 512, de acuerdo con la descripción hecha por Kimmel et al. (1995) 12 </sup&gt;. Las inyecciones con 100 ufc de S. epidermidis entre la etapa 16 y 128 células proporcionado el mejor patrón de la infección (Figura 2). Las bacterias proliferan dentro de la yema durante 3 días y se propagan en el cuerpo a partir de 3 dpi en adelante. Realizar inyecciones antes de la etapa 16 de células condujo a una alta mortalidad de 4 dpi, y la inyección después de la etapa de célula 256 mostró un crecimiento principalmente bacteriana dentro de la yema sin apenas difusión de bacterias dentro del cuerpo del embrión. La cuantificación de la carga bacteriana se realizó por análisis de la intensidad de fluorescencia usando la partícula grande citómetro de flujo como se describe por Veneman, et al. (2013) 8 (Figura 3). Las observaciones mostraron que la etapa de desarrollo óptimo para la inyección de 30 ufc M. inyección marinum es de entre 16 a 128 células etapa para la cepa E11 (Figura 4A) y entre la etapa de células 16-64 con el strai M más virulentaN (Figura 4B). Los embriones inyectados en estas etapas mostraron crecimiento bacteriano dentro de la yema y la propagación de las bacterias a través del embrión (Figura 7). La infección con ambas cepas en las primeras etapas presentó crecimiento bacteriano generalizado inespecífico llevando a los embriones a morir después de 4 dpi. Por otro lado, en embriones inyectados en etapas posteriores carga bacteriana se restringió a la yema. A continuación, la clasificación previa con partículas grandes citómetro de flujo (Figura 1B) genera grandes grupos homogéneos de peces infectados con exclusión de los embriones no-o altamente infectadas (Figuras 5A y 6A). Después de la clasificación previa, M. embriones infectados marinum fueron tratados con rifampicina, un fármaco de primera línea contra la tuberculosis. Estudios previos demostraron que el tratamiento con rifampicina a una dosis de 200 M reduce de manera eficiente M. infección marinum en el pez cebra 7, 13. Tomando advantage de la gran número de embriones homogéneamente infectadas generadas con el alto rendimiento de configuración, el tratamiento con diferentes dosis se realizó. Los embriones infectados con M. marinum cepa M y se trató durante 48 h con 12, 24, y 200 mM rifampicina mostraron para reducir la infección micobacteriana de manera eficiente en una manera dependiente de la dosis (Figura 5B). En vista de la reducción eficaz de la infección usando Rifampicina a una dosis de 200 mM esta concentración se utilizó para los experimentos futuros. En línea con el resultado anterior, el estudio de la progresión de la carga bacteriana mediante M. cepa marinum E11 se observó una significativa reducción de las 24 horas en adelante después del tratamiento con rifampicina 200 mM (Figura 6B). Además, si se requiere imágenes de gran aumento de estos embriones, que se puede mostrar de forma automática en placas de 96 pocillos (Figura 1C), desde donde las muestras se pueden analizar utilizandoel sistema de tecnología de tramado de Vertebrados automatizado con el grande de partículas Sampler montado sobre un CLSM. El sistema de tecnología de tramado de Vertebrados automatizado con el sampler de partículas Large es un sistema que puede montarse sobre una CLSM o un microscopio estéreo. Este dispositivo permite la carga de embriones vivos o fijos a partir de una placa de 96 pocillos o recipiente a granel de forma automática a través de un capilar de vidrio, y se orienta en frente de la cámara en el ángulo deseado (por ejemplo, dorsal o lateral). Las imágenes del embrión en todas las orientaciones se pueden hacer con la cámara de a bordo o con un CLSM externa (Figura 7). Los embriones serán posteriormente transferidos en el recipiente de recogida o de residuos. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig1.jpg" /> Figura 1. Outl experimental Mainstreamine. A) Los peces adultos se juntan para aparearse, los huevos se recogen, alineados en una placa de agarosa y se inyecta. B) los óvulos inyectados se incuban a 28 ° C y serán pre-ordenados para su posible tratamiento farmacológico. C) El análisis posterior por el gran partículas citómetro de flujo y / o partículas grandes Sampler / Vertebrados Automatizado tecnología de tramado con CLSM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig2.jpg" /> Figura 2. Establecimiento de mejor etapa celular para S. epidermidis yema de inyección. embriones de pez cebra fueron inyectados en la yema en distintas etapas de desarrollo 1-512 fase celular con 100 ufc de S. epidermidis. Los embriones inyectados entre 1 unaetapa de célula ND 8 mostró el crecimiento bacteriano en la yema y la alta mortalidad de 4 dpi. Los embriones inyectados entre la etapa celular 16 y 128 mostraron crecimiento bacteriano en la yema y el interior del cuerpo a partir de 3 dpi. Los embriones inyectados entre la etapa 256 y 512 células mostraron muchos crecimiento bacteriano dentro de la yema. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig3.jpg" /> Figura 3. Cuantificación de la carga bacteriana mediante flujo de partículas grandes citómetro. 100 ufc de S. epidermidis se inyecta en la yema de embriones de pez cebra. a) hasta el 5 dpi, cada día, grupos de 10 embriones fueron homogeneizados y se sembraron directamente, que muestra el promedio de crecimiento exponencial basado en dos réplicas biológica (barras de error= SEM). B) Ampliación de flujo de partículas citómetro de análisis muestra la media de la señal de fluorescencia de no inyectada y S. epidermidis inyecta embriones. Se analizaron 30 a 160 embriones por condición (barras de error = SEM), letras diferentes indican diferencias estadísticamente significativas por ANOVA de una vía seguida por el test de Tukey post-hoc (P &lt;0,001), ns:. No diferencias significativas C) Correlación entre UFC y media de la señal de fluorescencia de los grupos de 10 S. epidermidis infectado embriones (barras de error = SEM). Esta cifra ha sido modificado desde Veneman et al. (2013) 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig4.jpg" /> Figura 4. EstablisADJUNTO de la mejor etapa de célula de M. marinum yema de inyección. embriones de pez cebra fueron inyectados en todas las diferentes etapas de desarrollo 1-512 fase móvil con 30 ufc de M. marinum E11 y la tensión M. A, B) a partir de embriones inyectados etapa de célula 1-8 mostró similares difusión y la mortalidad con ambas cepas. A) embriones inyectados entre la etapa de células 16-128 con la cepa E11 mostró la formación de granulomas y la infección sistémica, mientras que aquellos inyectados 256-512 células etapa mantuvo la carga bacteriana en la yema. B) Los embriones inyectados entre la etapa de células 16-64 con la cepa M mostraron formación de granuloma como las estructuras y la infección sistémica, mientras que los inyectados de 128 a 512 células etapa mantiene la carga bacteriana en la yema . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig4highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="La figura 5" fo: Content-width = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51649/51649fig5.jpg&quot; /&gt; Figura 5. Tratamiento de M. infección aguda marinum con una primera línea de medicamentos contra la tuberculosis. Los embriones inyectados entre la etapa de células 16-64 con 30 cfu de M. cepa M marinum se realizaron a través de la partícula grande citómetro de flujo a 3 dpi ser clasificados en dos grupos después de descartar las que no y / o embriones altamente infectados. A) de fluorescencia de embriones individuales en ambos grupos. B) Los embriones tratados con rifampicina (RIF ) durante 48 horas a dosis de 12, 24, y 200 mM se analizaron a 4 ppp; su carga bacteriana se reduce significativamente. C) COPAS perfiles representativos de los embriones tratados con DMSO y rifampicina a dosis de 12, 24, y 200 mM durante 24 horas. Carga y distribución bacteriana está indicado por los picos rojos. La línea azul representa el perfil del elemento ordenados (4 dpf pez cebra embryo) por las COPAS. Se analizaron 60-90 embriones por condición. Cada punto de datos representa un embrión individual. Los valores se indican como media ± SEM. ns: diferencias no significativas. Análisis de la significación estadística de las diferencias se realizó mediante ANOVA de una vía seguida por el test post hoc de Tukey. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig5highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="La figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51649/51649fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51649/51649fig6.jpg" /> Figura 6. Tratamiento de M. marinum infección crónica con un fármaco de primera línea contra la tuberculosis. Los embriones inyectados entre la etapa de células 16-64 con 30 cfu de M. cepa marinum E11 se ejecuta a través del flujo de partículas grandes citómetro a 3 dpi ser clasificados en dos grupos después de descartar las que no y / o embriones altamente infectados.<html> A) Fluorescencia de embriones individuales en ambos grupos. B) se analizaron los embriones tratados con rifampicina (RIF) en 200 mM durante 4 días mostrando una reducción significativa de la carga bacteriana después de 1 día de tratamiento. Se analizaron 90 embriones por condición. Los valores se indican como media ± SEM. Letras diferentes indican diferencias significativas entre los puntos de tiempo del mismo tratamiento. * Indica diferencias significativas con el grupo control. ns: diferencias no significativas. El análisis de significación estadística de las diferencias se realizó por ANOVA de una vía seguido por la prueba post hoc de Tukey. (P &lt;0,05). Figura B) ha sido modificado desde Spaink et al. (2013) 13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51649/51649fig6highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> hres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/51649/51649fig7.jpg &quot;/&gt; Figura 7. Resultado de la M. inyección yema marinum E11 fotografiada usando Vertebrados automatizada tecnología de tramado y CLSM. pila Z Confocal (cosido 3 imágenes) de un 5 dpi fli1-egfp 14 embriones. A) embrión vivo que muestra proliferación de M. bacterias marinum E11 (rojo) en todo el cuerpo. B) fija 5 dpi fli-egfp embrión mostrando M. bacterias marinum E11 (rojo) en todo el cuerpo co-localizar con leucocitos (azul claro) detectada por L-plastina inmunotinción 15.

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Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Este artículo describe la tubería de vídeo de alto rendimiento que se ha establecido con éxito para infectar y analizar un gran número de embriones de pez cebra que proporcionan una nueva herramienta potente para las pruebas de compuesto y el descubrimiento de fármacos usando todo un organismo animal vertebrado.

Establecimiento y Optimización de una instalación de alto rendimiento para el Estudio<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Y<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; La infección como modelo para el descubrimiento de fármacos

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

13.1K vistas.  Leiden University.  Este artículo describe la tubería de vídeo de alto rendimiento que se ha establecido con éxito para infectar y analizar un gran número de embriones de pez cebra que proporcionan una nueva herramienta potente para las pruebas de compuesto y el descubrimiento de fármacos usando todo un organismo animal vertebrado. 

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Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Investigación

Inmunología e Infección

Facilitating Drug Discovery: An Automated High-content Inflammation Assay in Zebrafish

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and observation, as well as the fact that compounds can simply be added to the bathing water and are readily absorbed when administered in a &lt;1% DMSO solution. Due to the optical clarity of zebrafish larvae and the availability of transgenic lines expressing fluorescent proteins in leukocytes, zebrafish offer the unique advantage of monitoring an acute inflammatory response in vivo. Consequently, utilizing the zebrafish for high-content small molecule screens aiming at the identification of immune-modulatory compounds with high throughput has been proposed3-6, suggesting inflammation induction scenarios e.g. localized nicks in fin tissue, laser damage directed to the yolk surface of embryos7 or tailfin amputation3,5,6. The major drawback of these methods however was the requirement of manual larva manipulation to induce wounding, thus preventing high-throughput screening. Introduction of the chemically induced inflammation (ChIn) assay8 eliminated these obstacles. Since wounding is inflicted chemically the number of embryos that can be treated simultaneously is virtually unlimited. Temporary treatment of zebrafish larvae with copper sulfate selectively induces cell death in hair cells of the lateral line system and results in rapid granulocyte recruitment to injured neuromasts. The inflammatory response can be followed in real-time by using compound transgenic cldnB::GFP/lysC::DsRED26,9 zebrafish larvae that express a green fluorescent protein in neuromast cells, as well as a red fluorescent protein labeling granulocytes.
In order to devise a screening strategy that would allow both high-content and high-throughput analyses we introduced robotic liquid handling and combined automated microscopy with a custom developed software script. This script enables automated quantification of the inflammatory response by scoring the percent area occupied by red fluorescent leukocytes within an empirically defined area surrounding injured green fluorescent neuromasts. Furthermore, we automated data processing, handling, visualization, and storage all based on custom developed MATLAB and Python scripts.
In brief, we introduce an automated HC/HT screen that allows testing of chemical compounds for their effect on initiation, progression or resolution of a granulocytic inflammatory response. This protocol serves a good starting point for more in-depth analyses of drug mechanisms and pathways involved in the orchestration of an innate immune response. In the future, it may help identifying intolerable toxic or off-target effects at earlier phases of drug discovery and thereby reduce procedural risks and costs for drug development.

Here we describe a novel high-content chemically induced inflammation assay aiming at the identification of immune-modulatory bioactives. We have successfully combined automated microscopy with custom developed software scripts enabling automated quantification of the inflammatory response as well as further data processing, analysis, mining, and storage.

Facilitar el descubrimiento de fármacos: Un sistema automatizado de alta el contenido del ensayo La inflamación en el pez cebra

Zebrafish larvae are particularly amenable to whole animal small molecule screens1,2 due to their small size and relative ease of manipulation and ...

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and replicates within alveolar macrophages. Its virulence depends on the Dot/Icm type IV secretion system (T4SS), which is essential to establish a replication permissive vacuole known as the Legionella containing vacuole (LCV). L. pneumophila infection can be modeled in mice however most mouse strains are not permissive, leading to the search for novel infection models. We have recently shown that the larvae of the wax moth Galleria mellonella are suitable for investigation of L. pneumophila infection. G. mellonella is increasingly used as an infection model for human pathogens and a good correlation exists between virulence of several bacterial species in the insect and in mammalian models. A key component of the larvae&#39;s immune defenses are hemocytes, professional phagocytes, which take up and destroy invaders. L. pneumophila is able to infect, form a LCV and replicate within these cells. Here we demonstrate protocols for analyzing L. pneumophila virulence in the G. mellonella model, including how to grow infectious L. pneumophila, pretreat the larvae with inhibitors, infect the larvae and how to extract infected cells for quantification and immunofluorescence microscopy. We also describe how to quantify bacterial replication and fitness in competition assays. These approaches allow for the rapid screening of mutants to determine factors important in L. pneumophila virulence, describing a new tool to aid our understanding of this complex pathogen.

Use of Galleria mellonella as a Model Organism to Study Legionella pneumophila Infection

The larva of the wax moth Galleria mellonella was recently established as an in vivo model to study Legionella pneumophila infection. Here, we demonstrate fundamental techniques to characterize the pathogenesis of Legionella in the larvae, including inoculation, measurement of bacterial virulence and replication as well as extraction and analysis of infected hemocytes.

El uso de<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Como organismo modelo para estudiar<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infección

Legionella pneumophila, the causative agent of a severe pneumonia named Legionnaires&#39; disease, is an important human pathogen that infects and ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

Demostración de un resistente a múltiples fármacos<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Microarray Amplificación

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

De Alto Rendimiento Cuantitativa en tiempo real RT-PCR ensayo para determinar los perfiles de expresión de los tipos I y III de interferón subtipos

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Establecimiento de un programa de instalación de alto rendimiento para la detección de pequeñas moléculas que modulan la c-di-GMP Señalización en el<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Un ensayo compatible de alto rendimiento para evaluar la eficacia del fármaco contra los macrófagos a pases<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

Análisis de 18FDG PET/CT la proyección de imagen como una herramienta para estudiar la tuberculosis del Mycobacterium infección y tratamiento en Primates no humanos

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

Modelado de la Tuberculosis de Mycobacterium marinum infección pez cebra adulto

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence rates of S. aureus infection climbing annually, there is a demand for additional research in its&#160;pathogenicity. Animal models of infectious disease advance our understanding of the host-pathogen response and lead to the development of effective therapeutics. Neutrophils play a primary role in the innate immune response that controls S. aureus infections by forming an abscess to wall off the infection and facilitate bacterial clearance; the number of neutrophils that infiltrate an S. aureus skin infection often correlates with disease outcome. LysM-EGFP mice, which possess the enhanced green fluorescent protein (EGFP) inserted in the Lysozyme M (LysM) promoter region (expressed primarily by neutrophils), when used in conjunction with in vivo whole animal fluorescence imaging (FLI) provide&#160;a means of quantifying neutrophil emigration noninvasively and longitudinally into wounded skin. When combined with a bioluminescent S. aureus strain and sequential in vivo whole animal bioluminescent imaging (BLI), it is possible to longitudinally monitor both the neutrophil recruitment dynamics and in vivo bacterial burden at the site of infection in anesthetized mice from onset of infection to resolution or death. Mice are more resistant to a number of virulence factors produced by S. aureus that facilitate effective colonization and infection in humans. Immunodeficient mice provide a more sensitive animal model to examine persistent S. aureus infections and the ability of therapeutics to boost innate immune responses. Herein, we characterize responses in LysM-EGFP mice that have been bred to MyD88-deficient mice (LysM-EGFP&#215;MyD88-/- mice) along with wild-type LysM-EGFP mice to investigate S. aureus skin wound infection. Multispectral simultaneous detection enabled study of neutrophil recruitment dynamics by using in vivo FLI, bacterial burden by using in vivo BLI, and wound healing longitudinally and noninvasively over time.

A Mouse Model to Assess Innate Immune Response to Staphylococcus aureus Infection

An approach is described for real-time detection of the innate immune response to cutaneous wounding and Staphylococcus aureus infection of mice. By comparing LysM-EGFP mice (which possess fluorescent neutrophils) with a LysM-EGFP crossbred immunodeficient mouse strain, we advance our understanding of infection and the development of approaches to combat infection.

Un modelo de ratón para evaluar respuesta inmune innata a la infección por Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus (S. aureus)&#160;infections, including methicillin resistant stains, are an enormous burden on the healthcare system. With incidence ...