Los autores están muy agradecidos a Bob Fischer (LV, DIR, NIAID, NIH), que actuaba como narradora, así como Austin Athman (RTB, DIR, NIAID, NIH) y Megan Morgan (DOHS, ORS, OD, NIH) para su ayuda en hacer la película que acompaña a este manuscrito. Además, nos gustaría dar las gracias a Allison Groseth (LV, DIR, NIAID, NIH) para la lectura crítica del manuscrito. Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramural del NIH, el NIAID.

1. Fraccionamiento de células productoras para la producción inicial de trVLPs <ol><li> Quitar Medio 80-90% de confluencia las células 293 se cultivaron en matraces de 75 cm2 en medio de Eagle alto contenido de glucosa de Dulbecco modificado (DMEM) con 10% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM de L-glutamina y 1x penicilina / estreptomicina (DMEM10 ). Lavar las células dos veces con 10 de buffer fosfato salino ml (PBS), teniendo cuidado de no desalojar a las células, y añadir 2 ml de tripsina-EDTA a las células. </li><li> Se incuban las células a temperatura ambiente hasta que las células muestran redondeo significativa cuando se observa bajo un microscopio (aproximadamente 30 segundos). Desalojar células por frasco de tapping, y añadir 8 ml DMEM10. Minuciosamente resuspender las células pipeteando suavemente arriba y abajo hasta que se observa una única suspensión celular cuando se observa bajo el microscopio. </li><li> Contar las células utilizando un contador de células automatizado. Diluir las células a 2 x 10 5 células por ml en DMEM10. Pipetear 2 ml de suspensión celular por pocillo en placas de 6 pocillos (4 x 105 células por pocillo). </li><li> Incubar las placas en un incubador de cultivo de tejidos humidificado a 37 ° C con 5% de CO 2. </li></ol> 2. La transfección de células productoras para la producción inicial de trVLPs <ol><li> 24 horas después de la división de las células (véase la Figura 5 para una descripción general de la sincronización experimento), el plásmido ADN pipeta 15 (para cantidades ver Tabla 1) en unas estériles de 2 ml criovial utilizando puntas con filtro. Añadir 100 ml por pocillo de OptiMEM al ADN. Agite la mezcla brevemente y con cuidado de girar los tubos utilizando una microcentrífuga. Si varios pozos deben ser transfectadas con plásmidos idénticos, una mezcla maestra para varios pozos se puede hacer. </li><li> Brevemente agite el vial con Tránsito LT1 antes de su uso. Añadir 7,5 l de Tránsito LT1 por pocillo con el ADN diluido. Agite suavemente la mezcla, teniendo cuidado de no recoger el líquido en la tapa de la criovial, y se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Mezclar suavemente la transfeccióncomplejo pipeteando arriba y abajo. Añadir 100 l de los complejos de transfección gota a gota a cada pocillo. Roca la placa de adelante / atrás y de lado a lado para distribuir los complejos de transfección. No agite la placa ya que esto causará desigual difusión de los complejos de transfección. </li><li> Volver a las células a la incubadora. </li><li> Después de 24 horas, separar el sobrenadante de las células. Añadir 4 ml de DMEM con 5% de FBS, 2 mM L-glutamina, 1x penicilina / estreptomicina (DMEM5) a las células. Este paso se puede hacer para un máximo de 3 pozos en un momento sin secado de los pozos, suponiendo que los pocillos contienen muestras idénticas (de lo contrario, debido a la naturaleza auto-amplificación de las trVLPs En este sistema, la contaminación cruzada puede ser un problema y este paso se debe hacer un pozo a la vez). </li><li> Volver a las células a la incubadora. </li></ol> 3 Preparación de las células diana <ol><li> Dividir 293 células como se describe en la sección 1, la siembra de 4 x 10 5 células en 2 ml DMEM10 por pocillo de unaPlaca de 6 pocillos. </li><li> 24 h después de la división de las células diana y 24 horas antes de la infección, las células diana transfectar como se describe en la sección 2 utilizando el ADN asciende en la Tabla 1, y 4,5 l de Tránsito LT1 por pocillo. </li></ol> 4. infección de células diana y la cosecha de células productoras <ol><li> La transferencia de los sobrenadantes de las células productoras de tubos de 15 ml. Retire y deseche cualquier resto de sobrenadante usando una manguera de vacío. Añadir 250 l de tampón de lisis Glo a las células. </li><li> Sobrenadante Centrifugar durante 5 min a 800 xg y la temperatura ambiente para eliminar las muestras de los restos celulares. </li><li> Eliminar el sobrenadante de un pocillo de las células diana. Añadir con cuidado 3 ml de sobrenadante aclarado célula productora de células por medio de la velocidad más lenta de la pipeta objetivo. Evitar pipetear directamente sobre las células con el fin de no perturbar la monocapa de células. Este paso se tiene que hacer un pozo a la vez. </li><li> Cuando todas las muestras han sido transpreferido, volver las células diana a la incubadora para permitir la sedimentación de trVLPs y la infección de las células diana. </li><li> Después de 15 min de incubación a temperatura ambiente en el tampón de lisis Glo, resuspender las células productoras en el tampón de lisis usando una micropipeta ajustado a 150 l, y transferir la muestra en un 2 ml criovial. En este punto, lisados ​​pueden ser congeladas a -80 ° C, o directamente valoran según se describe en la sección 6. </li><li> 24 h después de la infección, eliminar el sobrenadante de las células diana. Añadir 4 ml DMEM5 por pocillo a las células. Este paso se puede hacer para hasta tres pozos en un momento, si los pozos contienen muestras idénticas (de lo contrario, debido a la naturaleza auto-amplificación de las trVLPs En este sistema, la contaminación cruzada puede ser un problema, y ​​esta etapa debe ser hecho de un pozo a la vez). </li></ol> 5. Cosecha de células diana para una infección de ciclo único <ol><li> Si un solo ciclo de infección se debe evaluar, a las 72 horas después de la infección remove tque el sobrenadante de las células diana utilizando una manguera de vacío. </li><li> Recoger las células en 250 l de tampón de lisis Glo como se describe en la sección 4 para obtener células productoras. </li></ol> 6. Cosecha de dirigirse a las células y los pases continuos de trVLPs <ol><li> Si trVLPs se deben a pases continuamente, preparar un nuevo conjunto de células diana como se describe en la sección 3 para que estén listas para la infección de 72 horas después de la infección de la primera serie de las células diana (ver Figura 5). </li><li> Infectar el nuevo conjunto de células diana como se describe en la sección 4 (usando el primer conjunto de células diana en lugar de las células productoras). </li><li> Repita estos pasos cada 72 horas. </li></ol> 7. Análisis de Periodista Actividad <ol><li> Si se congelaron los lisados ​​celulares, descongelar a temperatura ambiente. Asegúrese de que las muestras estén a temperatura ambiente antes de la medición. </li><li> Descongele la cantidad requerida (40 l por muestra) de tampón de ensayo Renilla Glo (i idealmente congeladon alícuotas) a temperatura ambiente. Asegúrese de que el buffer ha alcanzado la temperatura ambiente antes de la medición. </li><li> Añadir 1/100 º volumen de sustrato Renilla Glo para el tampón de ensayo Renilla Glo obtener reactivo Renilla Glo, y mezclar mediante agitación. Pipetear 40 l de reactivo de Renilla Glo en una placa de 96 pocillos blanco. </li><li> Añadir 40 l de muestra al reactivo de Renilla-Glo. Espere 10 minutos, luego medir las muestras en un luminómetro usando un tiempo de integración de 1 segundo. </li></ol>

<ol>
	<li>Kuhn, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+perceived+threat+differences+posed+by+filovirus+variants.">Evaluation of perceived threat differences posed by filovirus variants.</a> Biosecurity and bioterrorism : biodefense strategy, practice, and science. 9, 361-371 (2011).</li><li>Falzarano, D., Feldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possible+leap+ahead+in+filovirus+therapeutics.">Possible leap ahead in filovirus therapeutics.</a> Cell research. , (2014).</li><li>Hoenen, T., Groseth, A., Feldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+ebola+vaccines.">Current ebola vaccines.</a> Expert opinion on biological therapy. 12, 859-872 (2012).</li><li>Beniac, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organisation+of+ebola+virus+reveals+a+capacity+for+extensive,+modular+polyploidy.">The organisation of ebola virus reveals a capacity for extensive, modular polyploidy.</a> PloS one. 7, e29608 (2012).</li><li>Basu, A., Mills, D. M., Bowlin, T. L., Enna, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13,+Unit+13B+13,+High-throughput+screening+of+viral+entry+inhibitors+using+pseudotyped+virus.">Chapter 13, Unit 13B 13, High-throughput screening of viral entry inhibitors using pseudotyped virus.</a> Current protocols in pharmacology. , (2010).</li><li>Wong, A. C., Sandesara, R. G., Mulherkar, N., Whelan, S. P., Chandran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+forward+genetic+strategy+reveals+destabilizing+mutations+in+the+Ebolavirus+glycoprotein+that+alter+its+protease+dependence+during+cell+entry.">A forward genetic strategy reveals destabilizing mutations in the Ebolavirus glycoprotein that alter its protease dependence during cell entry.</a> J Virol. 84, 163-175 (2010).</li><li>Muhlberger, E., Weik, M., Volchkov, V. E., Klenk, H. D., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+transcription+and+replication+strategies+of+marburg+virus+and+Ebola+virus+by+using+artificial+replication+systems.">Comparison of the transcription and replication strategies of marburg virus and Ebola virus by using artificial replication systems.</a> J Virol. 73, 2333-2342 (1999).</li><li>Hoenen, T., Groseth, A., de Kok-Mercado, F., Kuhn, J. H., Wahl-Jensen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minigenomes,+transcription+and+replication+competent+virus-like+particles+and+beyond:+reverse+genetics+systems+for+filoviruses+and+other+negative+stranded+hemorrhagic+fever+viruses.">Minigenomes, transcription and replication competent virus-like particles and beyond: reverse genetics systems for filoviruses and other negative stranded hemorrhagic fever viruses.</a> Antiviral Res. 91, 195-208 (2011).</li><li>Hoenen, T., Feldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetics+systems+as+tools+for+the+development+of+novel+therapies+against+filoviruses.">Reverse genetics systems as tools for the development of novel therapies against filoviruses.</a> Expert Rev Anti Inf Ther. , 1253-1263 (2014).</li><li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+naive+target+cells+with+virus-like+particles:+implications+for+the+function+of+ebola+virus+VP24.">Infection of naive target cells with virus-like particles: implications for the function of ebola virus VP24.</a> J Virol. 80, 7260-7264 (2006).</li><li>Watanabe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+novel+ebola+virus-like+particles+from+cDNAs:+an+alternative+to+ebola+virus+generation+by+reverse+genetics.">Production of novel ebola virus-like particles from cDNAs: an alternative to ebola virus generation by reverse genetics.</a> J Virol. 78, 999-1005 (2004).</li><li>Hoenen, T., Jung, S., Herwig, A., Groseth, A., Becker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+matrix+proteins+of+Ebola+virus+contribute+to+the+regulation+of+viral+genome+replication+and+transcription.">Both matrix proteins of Ebola virus contribute to the regulation of viral genome replication and transcription.</a> Virology. 403, 56-66 (2010).</li><li>Watanabe, S., Noda, T., Halfmann, P., Jasenosky, L., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ebola+virus+(EBOV)+VP24+inhibits+transcription+and+replication+of+the+EBOV+genome.">Ebola virus (EBOV) VP24 inhibits transcription and replication of the EBOV genome.</a> J Infect Dis. 2 (196 Suppl 2), S284-S290 (2007).</li><li>Spiegelberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genus-specific+recruitment+of+filovirus+ribonucleoprotein+complexes+into+budding+particles.">Genus-specific recruitment of filovirus ribonucleoprotein complexes into budding particles.</a> J Gen Virol. 92, 2900-2905 (2011).</li><li>Watt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+lifecycle+modeling+system+for+Ebola+virus+shows+a+genome+length-dependent+role+of+VP24+on+virus+infectivity.">A novel lifecycle modeling system for Ebola virus shows a genome length-dependent role of VP24 on virus infectivity.</a> J Virol. , (2014).</li><li>Kondratowicz, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+immunoglobulin+and+mucin+domain+1+(TIM-1)+is+a+receptor+for+Zaire+Ebolavirus+and+Lake+Victoria+Marburgvirus.">T-cell immunoglobulin and mucin domain 1 (TIM-1) is a receptor for Zaire Ebolavirus and Lake Victoria Marburgvirus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 8426-8431 (2011).</li><li>Hoenen, T., Groseth, A., Callison, J., Takada, A., Feldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+Ebola+virus+expressing+luciferase+allows+for+rapid+and+quantitative+testing+of+antivirals.">A novel Ebola virus expressing luciferase allows for rapid and quantitative testing of antivirals.</a> Antiviral Res. 99, 207-213 (2013).</li><li>Hoenen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inclusion+bodies+are+a+site+of+ebolavirus+replication.">Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication.</a> J Virol. 86, 11779-11788 (2012).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

El ensayo trVLP tetracistronic se describe en este manuscrito permite el modelado del ciclo de vida del virus de Ébola en varios ciclos infecciosas. Es importante destacar que los trVLPs producidos en este sistema no contienen la información genética para las proteínas de la nucleocápside NP, VP35, VP30, y L, que en conjunto conforman casi el 60% del genoma del virus del Ébola y son esenciales para la replicación viral. Más bien, estas proteínas tienen que ser proporcionados en las células diana en trans a partir de plásmidos de expresión, y cualquier infección de las células que no expresan todos los 4 de esas proteínas es abortiva. Es importante destacar que no hay pruebas de la recombinación genética para filovirus, y no hay regiones homólogas compartidas entre el minigenoma tetracistronic y los plásmidos de expresión para las proteínas de la nucleocápside. Por lo tanto, no hay ni ninguna prueba práctica ni ninguna base teórica que podría prever la posibilidad de la generación de larga duración en los genomas del virus Ebola que podrían entonces potencialmente resultar enla producción de virus de Ébola infecciosas, por lo que este sistema seguro para el uso en condiciones BSL2. Hay dos pasos críticos en el ensayo trVLP tetracistronic que se ven influidas por las condiciones experimentales, es decir, la producción de trVLPs, y la infección de las células diana con estos trVLPs. Producción de trVLPs depende de altos niveles de replicación de minigenoma y la transcripción, que a su vez depende de una alta eficacia de transfección. La eficacia de transfección puede ser fácilmente evaluada mediante la inclusión de un control de L, en la que se intercambia el plásmido de expresión de L para un plásmido de expresión que codifican eGFP. Tasas de transfección en estas condiciones deben exceder 50% por inspección con un microscopio de fluorescencia 24 horas después de la transfección. Además, las células tienen que estar libres de micoplasma, ya que en nuestra experiencia contaminación por micoplasmas deteriora drásticamente la replicación y la transcripción minigenoma (datos no publicados). Debido a su alta transfectability 293 cells son la línea celular de elección para los ensayos trVLP; sin embargo, estas células son relativamente poco susceptible (aunque no completamente de refracción) a la infección con el virus de Ébola 16. La expresión de un factor de unión tales como Tim-1 mejora la infección de 293 células con trVLPs aproximadamente 100 veces, y es crucial para el éxito de este sistema a través de varios pasajes. Mientras trVLPs tetracistronic no son auto-replicante por su cuenta, que son auto-replicantes en las células que expresan las proteínas de la nucleocápside. Como tal, las precauciones tienen que hacerse para evitar la contaminación cruzada entre los pocillos que contenían diferentes trVLPs (por ejemplo, con diferentes mutaciones en el minigenoma). Desde un punto de vista más técnico, debido a la gran diferencia entre las señales positivas y negativas en este ensayo (aproximadamente 4 logs), la diafonía entre las muestras cuando se mide la actividad de luciferasa puede ser un problema; sin embargo, esto puede evitarse fácilmente dejando un pocillo vacío entre cada muestra en elPlaca de 96 pocillos se utiliza para medir la actividad luciferasa. Hay una multitud de posibles aplicaciones para trVLPs tetracistronic. Obviamente, son muy adecuadas para el estudio de la entrada de partículas filovirus, ya trVLPs infecciosas tienen la estructura de banda de rodadura típica de filovirus infecciosas 14, y contienen los mismos componentes virales como partículas filovirus. Es importante destacar, que no contienen componentes de otros virus, como es el caso cuando se utiliza pseudotyped viriones o partículas similares a virus, tales como partículas de retrovirus que llevan GP 1,2, o virus recombinantes, tales como virus de la estomatitis vesicular recombinante que expresa GP 1,2 . El requisito de factores de fijación cuando se utiliza 293 células como células diana en este sistema puede ser explotado para la detección de e investigar el papel de tales factores de fijación, mientras que las funciones de los otros factores celulares, tales como los implicados en la replicación del genoma y la transcripción, así como morfogénesis y broteding, se puede investigar mediante la tecnología RNAi. El efecto de las mutaciones en las proteínas virales en el ciclo de vida del virus también puede ser estudiada, aunque hay que tener en cuenta que mientras VP40, GP 1,2, y VP24 se expresan después de la transcripción viral, la expresión de las otras proteínas virales se logra a partir de la expresión plásmidos, de modo que los efectos debidos a la sobreexpresión de estas proteínas tienen que ser tomadas en cuenta. Además, se debe tener cuidado que las mutaciones en el minigenoma no alteran significativamente la longitud de la minigenoma, ya que la actividad del indicador se ve directamente afectado por la longitud del minigenoma 15. Por último, desde minigenomas tetracistronic son análogos del genoma viral que llevan genes virales, y se replican por el complejo de la polimerasa viral, debe también ser posible estudiar la evolución de estos genes en respuesta a las mutaciones en condiciones BSL2. Así, mientras que todavía se necesitan más estudios en esta dirección, debe ser posible, por ejemplo, para introducir subóptimamutaciones en los genes dentro de las minigenoma y luego trVLPs paso hasta mutaciones gratuitos emergen. Una limitación del ensayo trVLP tetracistronic que tiene que ser tenido en cuenta es el hecho de que mientras que los modelos de la mayor parte del ciclo de vida del virus, la transcripción primaria en las células diana no está modelado por este sistema, ya que las células diana tienen que expresar las proteínas de la nucleocápside en trans a fin de que los trVLPs para replicar. Si la transcripción primaria tiene que ser evaluado, es posible utilizar células diana ingenuos 10; Sin embargo, en este caso no tiene lugar la replicación del genoma en las células diana, y no hay más trVLPs infecciosas se producen, de abortar la infección. Este es un problema principal que no se puede superar sin hacer que los trVLPs completamente auto-replicante, incluyendo los genes para las proteínas de la nucleocápside en el minigenoma, lo que de hecho convertirlas en virus Ébola recombinantes infecciosas. De hecho, Ebolun virus que expresan luciferasa o otros reporteros se han generado y se puede utilizar para evaluar y estudiar la replicación del genoma y la transcripción 17,18; sin embargo, su uso está restringido a laboratorios BSL4. Además, tiene que tener en cuenta que mientras VP40, GP 1,2, y VP24 se expresa a partir de un análogo del genoma viral, su posición en el minigenoma (2 ª, 3 ª y 4 ª unidad de transcripción) no es idéntico al su posición en el genoma viral (3 ª, 4 ª, 6 ª y unidad de transcripción), que podría influir en sus niveles de expresión absolutos, así como sus niveles de expresión relativa con respecto a la otra. En general, el ensayo trVLP tetracistronic representa el sistema más completo de modelado del ciclo de vida de los virus Ébola disponibles hasta la fecha, y permite el modelado de la replicación del genoma y transcripción, la morfogénesis y la gemación de partículas, así como el apego y entratar en las células diana a través de múltiples ciclos infecciosas. Como tal, tiene un enorme potencial para su uso en la investigación de la biología de los virus Ébola en condiciones BSL2.

Virus Ebola son el agente causante de la fiebre hemorrágica grave en los seres humanos y los primates no humanos con las tasas de mortalidad de hasta el 90% en los brotes humanos 1. Si bien ha habido avances significativos en los últimos años en el desarrollo de vacunas, así como tratamientos específicos (revisado en 2,3), estos no son aprobados para el uso humano. Partículas de virus de Ébola tienen un aspecto similar al hilo característica con una longitud de aproximadamente 1 m y un diámetro de 96 a 98 nm 4. Se forma la nucleocápside el núcleo de las partículas virales y consiste en 1) el genoma de ARN de cadena simple no segmentado de sentido negativo, que codifica los genes 7 ebolavirus (Figura 1), 2) la nucleoproteína NP, que encapsida el genoma, 3 ) el complejo de la polimerasa viral que consiste en la polimerasa L y su cofactor VP35, y 4) el activador transcripcional VP30. Además, se ha demostrado recientemente que la proteína VP24 también se asocia con la nucleocápsides 4. La nucleocápside está rodeada por el espacio de la matriz en la que la proteína de la matriz VP40, que es responsable de la morfogénesis y la gemación de los viriones, se encuentra. Las partículas de virus son envueltos adicionalmente, y embebidos en el sobre es la única proteína de la superficie GP 1,2, que es responsable de la unión del virión y la entrada. Trabaja con virus de Ébola infecciosas tiene que realizarse en un laboratorio de contención máxima bajo nivel de bioseguridad (BSL) 4 condiciones, que restringe este trabajo a unas pocas instalaciones en todo el mundo. Con el fin de estudiar la biología de estos virus o para desarrollar nuevas terapias en condiciones BSL2, los investigadores se basan ya sea en la sobreexpresión recombinante de proteínas del virus de Ébola, o en sistemas de modelado del ciclo de vida, los cuales pueden ser trabajados con en ausencia del virus de Ébola infecciosa. La expresión recombinante de las proteínas del virus Ébola se logra ya sea a partir de plásmidos de expresión o vectores virales. Un caso especial de esta estrategia es elgeneración de viriones o partículas similares a virus basado en virus distintos del virus de Ébola (más comúnmente retrovirus o virus de la estomatitis vesicular) en presencia de GP recombinante expresada 1,2, que conduce a la generación de partículas pseudotyped, que se puede utilizar para estudiar la proceso de entrada de los filovirus y pantalla de inhibidores de la entrada 5. Alternativamente, los virus recombinantes (por ejemplo, virus de la estomatitis vesicular) que codifican el virus Ebola GP 1,2 en lugar de su propia glucoproteína pueden ser generados y utilizados para estudiar la entrada del virus bajo nivel de bioseguridad 2 condiciones 6. Sistemas de modelado del ciclo de vida son formas de sistemas de genética inversa que ofrecen el uso de análogos truncados del genoma del virus de Ébola (minigenomas), que son producidos inicialmente a partir de cDNA y luego replicados y transcritos por las proteínas del virus de Ébola proporcionadas en trans. El primer sistema de minigenoma del virus Ébola fue desarrollado hace más de 15 años 7, Y desde entonces ha sido utilizado para estudiar la replicación del genoma del virus de Ébola y la transcripción (revisado en 8,9). En este sistema un minigenoma monocistronic que consta de un solo gen reportero flanqueado por las regiones terminales no codificantes del genoma del virus de Ébola (llamado el líder y remolque) (Figura 1) se expresa en células de mamífero (por lo general mediante transcripción usando ARN polimerasa de T7) junto con las proteínas virales L, VP35, VP30 y NP. El minigenoma se encapsidated por NP, y luego replica y se transcribe por las otras proteínas de la nucleocápside utilizando señales que actúan en cis localizados en el líder y el remolque, que conduce a la actividad del indicador que refleja estos dos aspectos del ciclo de vida del virus (Figura 2). Con el fin de modelar pasos adicionales del ciclo de vida viral, transcripción y replicación competente partícula similar a virus sistemas (trVLP) se han desarrollado, que se basan en sistemas de minigenoma clásicos, pero una característica delexpresión complemen taria de las otras proteínas virales VP24, VP40 y GP 1,2 de plásmidos de expresión 10,11. La presencia de VP40 conduce a la formación de trVLPs, que llevan GP 1,2 en su superficie, y llevar a una nucleocápside que contiene minigenoma-en el interior. Estos trVLPs pueden usarse para infectar células diana, que o bien han sido pretransfected con plásmidos de expresión para L, VP35, VP30 y NP, para facilitar la replicación y transcripción de minigenomas introducidos en las células diana dentro de trVLPs 11, o las células diana son ingenuos (es decir sin expresión plásmido impulsado de proteínas del virus Ébola) 10. Esto resulta en la actividad del indicador en las células diana, lo que refleja la replicación de los minigenomas en las células productoras, la morfogénesis y la gemación de trVLPs, su entrada en las células diana, y 1) en el caso de las células diana pretransfected también la replicación y transcripción del genoma secundario ( es decir, la transcripción de proteínas virales produced en las células diana) en las células diana, o 2) en el caso de las células diana no tratados previamente también la transcripción primaria (es decir, la transcripción por las proteínas virales introducidos en células diana dentro de trVLPs) (Figura 3). Es importante destacar que estos sistemas sólo se han utilizado para modelar un único ciclo infeccioso, y se basan en la sobreexpresión de todas las proteínas virales, que en el caso de VP24 y VP40 es particularmente problemático, ya que estas proteínas han demostrado ser fuertes reguladores negativos de la replicación del genoma y la transcripción cuando se sobreexpresa a partir de plásmidos 12,13. Además, las preparaciones trVLP producidos en estos sistemas contienen una alta proporción de partículas no infecciosas, que presenta desafíos para el análisis bioquímico de trVLPs infecciosas 14. Con el fin de superar estos problemas, hemos desarrollado recientemente un sistema de minigenoma tetracistronic que, además de un gen reportero, también contiene los genes que codifican para VP40, GP y 1,2VP24 (Figura 1). Similar al sistema minigenoma monocistronic clásica, este sistema conduce a la producción de trVLPs que pueden infectar células diana (Figura 4) 15. Sin embargo, en contraste con el sistema minigenoma clásica, VP40, GP 1,2, y VP24 se producen después de la transcripción del genoma viral en lugar de ser sobreexpresado a partir de plásmidos. Como resultado, la cinética y los niveles de expresión de estas proteínas imitan mucho más estrechamente las que se encuentran durante el ciclo de vida viral, y por consiguiente la proporción de infecciosa a trVLPs no infecciosas se aumenta cerca de 500 veces en este sistema 15. Además, el uso de este sistema fue posible pasaje continuamente trVLPs que contiene minigenoma-tetracistronic, el modelado de múltiples ciclos infecciosas. Como tal, trVLPs tetracistronic Actualmente el sistema más completo de modelos de ciclo de vida disponible para estudiar la biología del virus Ébola en condiciones BSL2. Aquí, le ofrecemos información detallada sobre el uso of este sistema, así como en los resultados esperados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">75cm2 cell culture flask</td>
			<td style="width:157px;">Corning&#160;</td>
			<td style="width:123px;">430641</td>
			<td style="width:239px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DMEM</td>
			<td style="width:157px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">D6546</td>
			<td>preheat to 37&#176;C prior to use</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">FBS</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td>26140-079</td>
			<td>heat inactivate 30 min @ 56&#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">25030-081</td>
			<td>100X&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Pen Strep</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">15070-063</td>
			<td>100X&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="83">
			<td height="83" style="height:83px;width:259px;">PBS</td>
			<td style="width:157px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:239px;">8 g NaCl, 0.2g KCl, 1.44g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, H2O ad 1 liter; autoclave and store at room temperature&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6-well plates</td>
			<td style="width:157px;">Costar</td>
			<td style="width:123px;">3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Opti-MEM I</td>
			<td style="width:157px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:123px;">31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Transit LT1</td>
			<td style="width:157px;">Mirus</td>
			<td style="width:123px;">MIR 2300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Glo lysis buffer</td>
			<td style="width:157px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">E2661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Renilla Glo luciferase assay system</td>
			<td style="width:157px;">Promega</td>
			<td style="width:123px;">E2720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">96-well assay plate (white)</td>
			<td style="width:157px;">Costar</td>
			<td style="width:123px;">3912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Modulus microplate luminometer</td>
			<td style="width:157px;">Turner Microsystems</td>
			<td style="width:123px;">998-9300</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling the lifecycle of ebola virus under biosafety level 2 conditions with virus-like particles containing tetracistronic minigenomes

Virus Ebola causan fiebres hemorrágicas graves en los seres humanos y los primates no humanos, con tasas de mortalidad de hasta el 90%. No hay vacunas aprobadas o tratamientos específicos para la enfermedad causada por estos virus, y trabajan con virus de Ebola infecciosas está restringido a nivel de bioseguridad 4 laboratorios, lo que limita significativamente la investigación sobre estos virus. Sistemas de modelado del ciclo de vida del modelo de ciclo de vida del virus bajo nivel de bioseguridad 2 condiciones; Sin embargo, hasta hace poco tales sistemas se han limitado a cualquiera de los aspectos individuales del ciclo de vida del virus, o un único ciclo infeccioso. Minigenomas Tetracistronic, que consisten en regiones de virus Ébola no codificantes, un gen reportero, y tres genes de virus de Ébola implicados en la morfogénesis, en ciernes, y la entrada (VP40, GP 1,2, y VP24), se pueden utilizar para producir la replicación y transcripción partículas -competent similares al virus (trVLPs) que contienen estos minigenomas. Estos trVLPs pueden infectar continuamente las células que expresan el Ébolaproteínas responsables de la replicación del genoma y la transcripción, lo que nos permite modelar de forma segura múltiples ciclos infecciosos bajo nivel de bioseguridad 2 condiciones virus. Es importante destacar que los componentes virales de estos sistemas son exclusivamente derivados del virus de Ébola y no de otros virus (como es, por ejemplo, el caso en los sistemas que utilizan virus pseudotyped), y VP40, VP24 y 1,2 GP no se sobreexpresa en este sistema , por lo que es idealmente adecuado para el estudio de la morfogénesis, y la entrada en ciernes, aunque otros aspectos del ciclo de vida del virus, tales como la replicación del genoma y la transcripción también pueden ser modelados con este sistema. Por lo tanto, el ensayo trVLP tetracistronic representa el sistema más completo de modelos de ciclo de vida disponible para los virus de Ébola, y tiene un enorme potencial para su uso en la investigación de la biología de los virus Ébola en el futuro. Aquí, le ofrecemos información detallada sobre el uso de este sistema, así como sobre los resultados esperados.

La transfección de células 293 productores con plásmidos de expresión que codifica el virus Ebola proteínas de la nucleocápside NP, VP35, VP30, y L, un minigenoma tetracistronic y los accesorios T7 polimerasa resultados en minigenoma la replicación y la transcripción y la actividad reportero que es fácilmente detectable a las 72 horas (Figura 6 ). Es importante destacar que la actividad de reportero observado (10 5.6 unidades de luminiscencia relativas (RLU)) excede a la de un control negativo en el que el plásmido de expresión que codifica L fue omitido de la transfección (10 3 RLU) por más de 2 registros. El bajo nivel de actividad observada incluso en ausencia de L es más probable debido a un promotor críptico en el plásmido minigenoma. Las células diana infectadas con trVLPs del sobrenadante de células productoras muestran en realidad poco aumento de los niveles de actividad del indicador en comparación con células productoras, y los valores alcanzan entre 10 y 10 7 6 RLU, dependiendo del pasaje. En contraste, wgallina el sobrenadante de células productoras de control L se pasaron a las células diana (que expresan todas las proteínas de la nucleocápside, incluyendo L), la actividad de reportero, no exceda del ruido de fondo del luminómetro (alrededor de 10 2 RLU). El ensayo trVLP tetracistronic se puede utilizar para estudiar el ciclo de vida de los virus Ébola. Por ejemplo, la infección de células 293 con trVLPs es dependiente de la presencia de factores de fijación tales como Tim-1 16, que tiene que ser proporcionada en trans en estas células. En consecuencia, en un ensayo de trVLP tetracistronic se observa una caída en la actividad del indicador en las células diana de aproximadamente 100 veces en ausencia de Tim-1 (Figura 7A). El papel de las proteínas específicas (virales o celulares) en el ciclo de vida del virus también se puede evaluar utilizando la tecnología del RNAi junto con este enfoque. Como ejemplo, el ARNi mediado por la baja regulación de los resultados de L en una caída en la actividad reportera de alrededor de 100 veces, lo que refleja el papel central de L enla replicación y transcripción (Figura 7B) 7. Además, es posible manipular directamente el minigenoma para evaluar el efecto de mutaciones en el ciclo de vida del virus. A modo de ejemplo, cuando VP24-expresión del minigenoma es abolida por la introducción de 3 codones de terminación inmediatamente aguas abajo del codón de inicio, la actividad del indicador en células productoras no se cambia radicalmente; sin embargo, la actividad del indicador en las células diana se reduce en aproximadamente 20 veces después de un pasaje, y 400 veces después de dos pasajes, lo que indica un papel de VP24 en la producción de trVLPs infecciosas (Figura 7C) 15. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Estructura del genoma del virus de Ébola, así como minigenomas monocistronic y tetracistronic. Regiones de la proteína del virus de Ébola Codificación se muestran como rojo (NP,VP35, VP30, y L), amarillo (VP40 y VP24) o azul (GP 1,2) cajas. Regiones no codificantes (NCR) se muestran en verde, con las regiones líder y remolque indicados. El subíndice indica que se utilizó NCR viral para la unión de las regiones codificantes. La región que codifica para el reportero (rep) se muestra en color morado. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. ensayo de minigenoma monocistrónica. Las células se transfectaron con plásmidos de expresión para las proteínas de la nucleocápside del virus de Ébola (NP, VP35, VP30, L), un minigenoma monocistronic (mg) y la polimerasa de T7. El minigenoma se transcribe inicialmente por la polimerasa de T7 (a) en un ARN minigenoma unencapsidated en la misma orientación que el genoma viral (ARNv), que luego es encapsidado por NP (b). Este encapsidated vRNA se replica a través de un ARN minigenoma complementario (cRNA) intermedio (c), y luego se transcribe en ARNm reportero (d) que se traducen en proteínas reportero (e). <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. ensayo trVLP con un minigenoma monocistronic. Células son transfectadas con plásmidos de expresión para los componentes del ensayo (minigenoma las proteínas de la nucleocápside del virus de Ebola NP, VP35, VP30, L, A minigenoma monocistronic y la polimerasa T7), así como VP40, GP 1 , 2 y VP24. Esto conduce a la formación de trVLPs que incorporan nucleocápside que contiene minigenoma-(F). Estos trVLPs puede entonces infectar las células diana (g), que se pretransfected ya sea con plásmidos de expresión para NP, VP35, VP30, y L (parte superior), lo que resulta en la replicación y la transcripción secundaria (d) que conduce a la expresión del indicador (e), o ingenua células diana (abajo), lo que resulta en la transcripción primaria del minigenomes (h), que también conduce a la expresión de reportero (e). <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. ensayo trVLP con un minigenoma tetracistronic. Las células se transfectaron con plásmidos de expresión para las proteínas de la nucleocápside del virus de Ébola (NP, VP35, VP30, L), un minigenoma tetracistronic (mg) y la polimerasa de T7. La transcripción inicial (a), la encapsidación (b), la replicación del genoma (c) y la transcripción (d), así como la traducción (e) se producen como en un ensayo de minigenoma monocistronic. Sin embargo, además de ARNm reportero, mRNAs de VP40, VP24 y 1,2 GP también se transcribe a partir del minigenoma tetracistronic, resultando en la formación de trVLPs (f). Estos trVLPs infectan células diana que han sido pretransfected con plásmidos de expresión para las proteínas de la nucleocápside NP, VP35, VP30 y L, así como el virus Ébola celularfactor de unión Tim-1, lo que resulta en la replicación del genoma y la transcripción, y la producción de trVLPs que se pueden utilizar para infectar células diana frescas. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. Momento de un ensayo de trVLP tetracistronic para 3 pasos consecutivos. Los días de la siembra de células (s), la transfección de células (t), la infección de células (i), cambio de medio (c) y la cosecha de las células y trVLPs (h) son indicado para tres pasos consecutivos (indicado por flechas). <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. niveles típicos de la actividad del indicador observado en un ensayo trVLP tetracistronic. Un ensayo trVLP tetracistronic se realizó en 5 pasos siguiendo el protocol se describe en este manuscrito. Como control negativo el plásmido de expresión que codifica L se omitió (L) a partir de la transfección de las células productoras p0. Las células diana en pasajes P1 a P5 se transfectaron con plásmidos de expresión para todas las proteínas de la nucleocápside, incluyendo L. El ruido de fondo del luminómetro está indicado como una línea discontinua. Los medios y las desviaciones estándar de 4 repeticiones biológica de 3 experimentos independientes se muestran. <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52381/52381fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7. Evaluación del impacto de diversos factores virales y celulares en el ciclo de vida viral usando trVLPs tetracistronic. (A) Tim-1 como un factor de unión. Las células diana que fueron pretransfected con plásmidos de expresión que codifican para las proteínas de la nucleocápside y con o sin un plásmido que codifica para Tim-1 (descrito en 15) fueron infectadas con tettrVLPs racistronic. 72 horas después de la infección actividad de reportero en las células diana p1 se determinó. Las medias y las desviaciones estándar de 4 repeticiones biológica de 4 experimentos independientes se muestran. (B) Efecto de RNAi desmontables de L en la replicación del genoma y la transcripción. Células diana que se pretransfected con plásmidos de expresión de los componentes de la nucleocápside, Tim-1 y miRNAs dirigidos contra L (anti-L) o una proteína no relacionada (anti-GFP) (descrito en 15) se infectaron con trVLPs tetracistronic. 72 horas después de la infección actividad de reportero en las células diana p1 se determinó. Las medias y las desviaciones estándar de 5 repeticiones biológica de 2 experimentos independientes se muestran. (C) Efecto de mutaciones en el minigenoma en trVLP infectividad. Un ensayo trVLP tetracistronic se realizó utilizando un tipo salvaje minigenoma (4cis-WT) o un minigenoma en 3 codones de parada que se habían introducido inmediatamente después del codón de inicio de VP24, la supresión de la expresión of esta proteína pero introduciendo sólo cambios mínimos en el minigenoma en lo que respecta a la longitud, composición de ácido nucleico, etc estructuras secundarias actividad de reportero en p0, p1 y p2 se midió 72 horas después de la transfección / infección. Los medios y las desviaciones estándar de 3 réplicas biológicas de 3 experimentos independientes se muestran. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;width:115px;"></td><td style="width:127px;"> Las células productoras (P0) </td><td style="width:180px;"> Las células objetivo (p1 y superiores) </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-NP </td><td> 125 </td><td> 125 </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-VP35 </td><td> 125 </td><td> 125 </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-VP30 </td><td> 75 </td><td> 75 </td></tr><tr height="19"><td height = &quot;19&quot; style = &quot;height: 19px;&quot;&gt; pCAGGS-L </td><td> 1000 </td><td> 1000 </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> p4cis-vRNA-Rluc </td><td> 250 </td><td> - </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-T7 </td><td> 250 </td><td> - </td></tr><tr height="19"><td height="19" style="height:19px;"> pCAGGS-TIM1 </td><td> - </td><td> 250 </td></tr></tbody></table> Tabla 1. asciende ADN para la transfección. La cantidad de cada plásmido requerido para la transfección de células productoras y diana se muestra en ng por pocillo de una placa de 6 pocillos. Todos los plásmidos se describen en Watt et al 15.

Watch this Scientific Journal Video about Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes at JoVE.com

Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Trabaja con virus Ébola infecciosas está restringido a nivel de bioseguridad 4 laboratorios. Tetracistronic replicación y transcripción del virus competente como partículas que contienen minigenoma-(trVLPs) representan un sistema de modelado del ciclo de vida que permite modelar de forma segura múltiples ciclos infecciosos bajo nivel de bioseguridad 2 condiciones, depender exclusivamente de componentes del virus Ebola.

Modelado El ciclo de vida de Ebola Virus Bajo Nivel de Bioseguridad 2 Condiciones Con-Virus como partículas que contienen Tetracistronic minigenomas

Ebola viruses cause severe hemorrhagic fevers in humans and non-human primates, with case fatality rates as high as 90%. There are no approved vaccines or ...

modeling-lifecycle-ebola-virus-under-biosafety-level-2-conditions

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

35.9K vistas.  National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health.  Trabaja con virus Ébola infecciosas está restringido a nivel de bioseguridad 4 laboratorios. Tetracistronic replicación y transcripción del virus competente como partículas que contienen minigenoma-(trVLPs) representan un sistema de modelado del ciclo de vida que permite modelar de forma segura múltiples ciclos infecciosos bajo nivel de bioseguridad 2 condiciones, depender exclusivamente de componentes del virus Ebola. 

Video: Modeling The Lifecycle Of Ebola Virus Under Biosafety Level 2 Conditions With Virus-like Particles Containing Tetracistronic Minigenomes

Avian Influenza Surveillance with FTA  Cards: Field Methods, Biosafety, and Transportation Issues Solved

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral subtypes2. Human pandemics of flu originally stem from AIVs3. Many fatal human cases during the H5N1 outbreaks in recent years were reported. Lately, a new AIV related strain swept through the human population, causing the 'swine flu epidemic'4. Although human trading and transportation activity seems to be responsible for the spread of highly pathogenic strains5, dispersal can also partly be attributed to wild birds6, 7. However, the actual reservoir of all AIV strains is wild birds.
In reaction to this and in face of severe commercial losses in the poultry industry, large surveillance programs have been implemented globally to collect information on the ecology of AIVs, and to install early warning systems to detect certain highly pathogenic strains8-12. Traditional virological methods require viruses to be intact and cultivated before analysis. This necessitates strict cold chains with deep freezers and heavy biosafety procedures to be in place during transport. Long-term surveillance is therefore usually restricted to a few field stations close to well equipped laboratories. Remote areas cannot be sampled unless logistically cumbersome procedures are implemented. These problems have been recognised13, 14 and the use of alternative storage and transport strategies investigated (alcohols or guanidine)15-17. Recently, Kraus et al.18 introduced a method to collect, store and transport AIV samples, based on a special filter paper. FTA cards19 preserve RNA on a dry storage basis20 and render pathogens inactive upon contact21. This study showed that FTA cards can be used to detect AIV RNA in reverse-transcription PCR and that the resulting cDNA could be sequenced and virus genes and determined.
In the study of Kraus et al.18 a laboratory isolate of AIV was used, and samples were handled individually. In the extension presented here, faecal samples from wild birds from the duck trap at the Ottenby Bird Observatory (SE Sweden) were tested directly to illustrate the usefulness of the methods under field conditions. Catching of ducks and sample collection by cloacal swabs is demonstrated. The current protocol includes up-scaling of the work flow from single tube handling to a 96-well design. Although less sensitive than the traditional methods, the method of FTA cards provides an excellent supplement to large surveillance schemes. It allows collection and analysis of samples from anywhere in the world, without the need to maintaining a cool chain or safety regulations with respect to shipping of hazardous reagents, such as alcohol or guanidine.

A method to preserve, detect and sequence RNA from Avian Influenza Viruses was validated and extended using natural faecal samples from birds. This technique removes the necessity of maintaining a cool chain and handling of infectious viruses and can be applied in a 96-well high-throughput setup.

Vigilancia de la Gripe Aviar, con tarjetas FTA: Métodos de Campo, la bioseguridad y los problemas de transporte resueltos

Avian Influenza Viruses (AIVs) infect many mammals, including humans1. These AIVs are diverse in their natural hosts, harboring almost all possible viral ...

Investigación

Inmunología e Infección

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Aislamiento de células endoteliales de vena umbilical y su uso en el Estudio de la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Mimicking and exploiting virus properties and physicochemical and physical characteristics holds promise to provide solutions to some of the world's most pressing challenges. The sheer range and types of viruses coupled with their intriguing properties potentially give endless opportunities for applications in virus-based technologies. Viruses have the ability to self- assemble into particles with discrete shape and size, specificity of symmetry, polyvalence, and stable properties under a wide range of temperature and pH conditions. Not surprisingly, with such a remarkable range of properties, viruses are proposed for use in biomaterials 9, vaccines 14, 15, electronic materials, chemical tools, and molecular electronic containers4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
In order to utilize viruses in nanotechnology, they must be modified from their natural forms to impart new functions. This challenging process can be performed through several mechanisms including genetic modification of the viral genome and chemically attaching foreign or desired molecules to the virus particle reactive groups 8. The ability to modify a virus primarily depends upon the physiochemical and physical properties of the virus. In addition, the genetic or physiochemical modifications need to be performed without adversely affecting the virus native structure and virus function. Maize rayado fino virus (MRFV) coat proteins self-assemble in Escherichia coli producing stable and empty VLPs that are stabilized by protein-protein interactions and that can be used in virus-based technologies applications 8. VLPs produced in tobacco plants were examined as a scaffold on which a variety of peptides can be covalently displayed 13. Here, we describe the steps to 1) determine which of the solvent-accessible cysteines in a virus capsid are available for modification, and 2) bioconjugate peptides to the modified capsids. By using native or mutationally-inserted amino acid residues and standard coupling technologies, a wide variety of materials have been displayed on the surface of plant viruses such as, Brome mosaic virus 3, Carnation mottle virus 12, Cowpea chlorotic mottle virus 6, Tobacco mosaic virus 17, Turnip yellow mosaic virus 1, and MRFV 13.

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

A method to analyze the solvent accessibility of the thiol group of cysteine residues of Maize rayado fino virus (MRFV)-virus-like particles (VLPs) followed by a peptide cross-linking reaction is described. The method takes advantage of the availability of several chemical groups on the surface of the VLPs that can be targets for specific reactions.

El análisis de la accesibilidad al disolvente de los residuos de cisteína en<em&gt; Maize rayado fino virus</em&gt; Partículas similares al virus producidas en<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; Plantas y reticulación de péptidos a VLPs

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Biosafety level 4 (BSL-4) suit laboratories are specifically designed to study high-consequence pathogens for which neither infection prophylaxes nor treatment options exist. The hallmarks of these laboratories are: custom-designed airtight doors, dedicated supply and exhaust airflow systems, a negative-pressure environment, and mandatory use of positive-pressure (&#8220;space&#8221;) suits. The risk for laboratory specialists working with highly pathogenic agents is minimized through rigorous training and adherence to stringent safety protocols and standard operating procedures. Researchers perform the majority of their work in BSL-2 laboratories and switch to BSL-4 suit laboratories when work with a high-consequence pathogen is required. Collaborators and scientists considering BSL-4 projects should be aware of the challenges associated with BSL-4 research both in terms of experimental technical limitations in BSL-4 laboratory space and the increased duration of such experiments. Tasks such as entering and exiting the BSL-4 suit laboratories are considerably more complex and time-consuming compared to BSL-2 and BSL-3 laboratories. The focus of this particular article is to address basic biosafety concerns and describe the entrance and exit procedures for the BSL-4 laboratory at the NIH/NIAID Integrated Research Facility at Fort Detrick. Such procedures include checking external systems that support the BSL-4 laboratory, and inspecting and donning positive-pressure suits, entering the laboratory, moving through air pressure-resistant doors, and connecting to air-supply hoses. We will also discuss moving within and exiting the BSL-4 suit laboratories, including using the chemical shower and removing and storing positive-pressure suits.

Safety Precautions and Operating Procedures in an ABSL-4 Laboratory: 1. Biosafety Level 4 Suit Laboratory Suite Entry and Exit Procedures

Although researchers are generally knowledgeable about procedures and safety precautions required for biosafety level 1 or 2 (BSL-1/2) experiments, they may not be familiar with experimental procedures in BSL-4 suit laboratories. This article provides a detailed visual demonstration of BSL-4 suit laboratory systems check, laboratory entry, movement, and exit procedures.

Medidas de seguridad y procedimientos de operación en una (A) BSL-4 de laboratorio: 1. Nivel de Bioseguridad 4 Traje Laboratorio de Entrada y Salida Procedimientos suite

Biosafety level 4 (BSL-4) suit laboratories are specifically designed to study high-consequence pathogens for which neither infection prophylaxes nor ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In vitro e in vivo modelo para estudiar la adhesión bacteriana a la pared del recipiente en condiciones de flujo

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Co-inmunoprecipitación de la proteína de ratón Mx1 con la Influenza A nucleoproteína del virus

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Análisis de linfocitos extravasación El uso de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la barrera sangre-cerebro humano

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase reporter, using a simple transfection procedure of the widely available HEK-293T cell line. Once formed and released from producer cells, these pseudovirions incorporate a luciferase reporter gene. Since they only contain the heterologous coronavirus spike protein on their surface, the particles behave like their native coronavirus counterparts for entry steps. As such, they are the excellent surrogates of native virions for studying viral entry into host cells. Upon successful entry and infection into target cells, the luciferase reporter gets integrated into the host cell genome and is expressed. Using a simple luciferase assay, transduced cells can be easily quantified. An important advantage of the procedure is that it can be performed in biosafety level 2 (BSL-2) facilities instead of BSL-3 facilities required for work with highly pathogenic coronaviruses such as Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) and severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV). Another benefit comes from its versatility as it can be applied to envelope proteins belonging to all three classes of viral fusion proteins, such as the class I influenza hemagglutinin (HA) and Ebola virus glycoprotein (GP), the class II Semliki forest virus E1 protein, or the class III vesicular stomatitis virus G glycoprotein. A limitation of the methodology is that it can only recapitulate virus entry steps mediated by the envelope protein being investigated. For studying other viral life cycle steps, other methods are required. Examples of the many applications these pseudotype particles can be used in include investigation of host cell susceptibility and tropism and testing the effects of virus entry inhibitors to dissect viral entry pathways used.

Here, we present a protocol to generate pseudotyped particles in a BSL-2 setting incorporating the spike protein of the highly pathogenic viruses Middle East respiratory syndrome and severe acute respiratory syndrome coronaviruses. These pseudotyped particles contain a luciferase reporter gene allowing quantification of virus entry into target host cells.

Producción de partículas Pseudotyped estudiar coronavirus altamente patógena en un ambiente de nivel 2 de bioseguridad

The protocol aims to generate coronavirus (CoV) spike (S) fusion protein pseudotyped particles with a murine leukemia virus (MLV) core and luciferase ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of massage on skeletal muscles, the molecular mechanisms behind are poorly understood. We have recently developed a simple device to apply local cyclical compression (LCC), which can generate intramuscular pressure waves with varying amplitudes. Using this device, we have demonstrated that LCC modulates inflammatory responses of macrophages in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Here, we describe protocols for the optimization and application of LCC as a massage-like intervention against immobilization-induced inflammation and atrophy of skeletal muscles of mouse hindlimbs. The protocol that we have developed can be useful for investigating the mechanism underlying beneficial effects of physical exercise and massage. Our experimental system provides a prototype of the analytical approach to elucidate the mechanical regulation of muscle homeostasis, although further development needs to be made for more comprehensive studies.

Here we describe the protocols for applying defined mechanical loads to mouse calves and for monitoring the concomitant intramuscular pressure changes. The experimental systems that we have developed can be useful for investigating the mechanism behind the beneficial effects of physical exercise and massage.

Aplicación de Perturbaciones Consistentes Similares al Masaje en Los terneros de ratón y Monitoreo de los Cambios de Presión Intramuscular Resultantes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

In Vitro ELISA Test to Evaluate Rabies Vaccine Potency

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy for the Replacement, Reduction, and Refinement of the laboratory animal testing. The development of in vitro approaches is recommended at the WHO and European levels as alternatives to the NIH test for evaluating the rabies vaccine potency. At the surface of the rabies virus (RABV) particle, trimers of glycoprotein constitute the major immunogen to induce Viral Neutralizing Antibodies (VNAbs). An ELISA test, where Neutralizing Monoclonal Antibodies (mAb-D1) recognize the trimeric form of the glycoprotein, has been developed to determine the contents of the native folded trimeric glycoprotein along with the production of the vaccine batches. This in vitro potency test demonstrated a good concordance with the NIH test and has been found suitable in collaborative trials by RABV vaccine manufacturers and OMCLs. Avoidance of animal use is an achievable objective in the near future.
The method presented is based on an indirect ELISA sandwich immunocapture using the mAb-D1 which recognizes the antigenic sites III (aa 330 to 338) of the trimeric RABV glycoprotein, i.e., the immunogenic RABV antigen. mAb-D1 is used for both coating and detection of glycoprotein trimers present in the vaccine batch. Since the epitope is recognized because of its conformational properties, the potentially denatured glycoprotein (less immunogenic) cannot be captured and detected by the mAb-D1. The vaccine to be tested is incubated in a plate sensitized with the mAb-D1. Bound trimeric RABV glycoproteins are identified by adding the mAb-D1 again, labeled with peroxidase and then revealed in the presence of substrate and chromogen. Comparison of the absorbance measured for the tested vaccine and the reference vaccine allows for the determination of the immunogenic glycoprotein content.

Here we describe an indirect ELISA sandwich immunocapture to determine the immunogenic glycoprotein contents in rabies vaccines. This test uses a neutralizing Monoclonal Antibody (mAb-D1) recognizing glycoprotein trimers. It is an alternative to the in vivo NIH test to follow the consistency of vaccine potency during production.

Prueba IN Vitro ELISA para evaluar la potencia de la vacuna contra la rabia

The growing global concern for the animal welfare is encouraging manufacturers and the National Control Laboratories (OMCLs) to follow the 3Rs strategy ...