Reconocemos Julie Heward para ayudar en la preparación de hNSCs y Lavaniya Thanabalasundaram por su apoyo técnico con HeLa cultivo y transfección.

1. Diferenciación HNSC en Tridimensional Cultura (3D) NOTA: Aislar y derivar hNSCs, a partir de un tejido ético aprobado, descrito en una publicación anterior 2. Por favor, siga los lineamientos éticos e institucionales, mientras que después de este procedimiento. 1.1) Cultura 3D Usando 12 pocillos Placa <ol><li> Utilice una técnica aséptica durante el procedimiento. En una cabina de seguridad biológica, andamios rehidratar añadiendo 2 ml / pocillo de etanol al 70% preparadas utilizando agua para riego (WFIr). Evite tocar los andamios dispensando el etanol al 70% por la pared de cada pozo. </li><li> Aspirar con cuidado el 70% de etanol y lavar inmediatamente los andamios con 2 ml / pocillo DMEM: F12 durante 1 min. Repita el procedimiento de lavado dos veces. Aspirar con cuidado la DMEM: F12 después del último lavado. </li><li> Andamios Coat por la adición de 2 ml / pocillo de laminina (10 mg / ml) en DMEM: F12. Incubar la placa a 37 ° C en un CO 2 hum 5%idified incubadora durante un mínimo de 2 horas. Lave la placa con DMEM caliente: F12. </li><li> Semillas cada andamio con aproximadamente 500.000 hNSCs en un volumen de 150 l de RMM + FG. </li><li> Incubar la placa durante 3 horas a 37 ° C en un incubador de CO2 humidificado 5% para permitir que las células se asienten en los andamios. </li><li> Añadir 3,5 ml de RMM a cada pocillo con cuidado de no desalojar a las células de los andamios. </li><li> Incubar la placa durante 7 días; reemplazar medio RMM (3,5 ml / pocillo) después de 1 día (primera alimentación) y de nuevo después de 2-3 días a partir de la primera alimentación. </li><li> Después de 7 días, retire medio y fijar las células con paraformaldehído al 4% (PFA) para inmunocitoquímica (CPI) o añadir 500 l / pocillo de reactivo de lisis para la extracción de ARN total (placa de tienda a ≤ -80 ° C o proceder a la extracción de ARN total) . </li></ol> 1.2) Medición de axón resultado de procesos <ol><li> Mancha PFA al 4% fijado hNSCs diferenciadas de acuerdo con un protocolo estándar ICC 20 utilizando β3-tubulina (TUBB3) anticuerpo primario se detectó con un anticuerpo secundario conjugado con fluorocromo. Núcleos celulares Contratinción con Hoechst (1 M). </li><li> Captura de imágenes representativas de las células teñidas-β3 tubulina utilizando un microscopio de fluorescencia; guardar imágenes como tiff o jpeg. Medida del crecimiento de proceso axón mediante una herramienta de medición del software (por ejemplo, Image-Pro Plus). </li><li> Abra la imagen, seleccione la opción de mediciones en la barra de herramientas y seleccione característica rastro. </li><li> Para iniciar el rastreo, seleccione el punto de inicio en el axón haciendo clic en el botón del ratón. Seguir la pista a lo largo de toda la longitud de la axón; haga clic derecho para terminar cada traza. Repita para medir todo outgrowthswith axón en el campo de visión. </li><li> Exprese mediciones como píxeles o micras (pendiente de calibración establecido). Mediciones de la longitud de exportación a un programa de hoja de cálculo para el análisis comparativo y estadístico de la muestra. </li></ol> 2. Mirna expresión usando una Células Madre yLas vías de desarrollo enfocada matriz miARN PCR 2.1) extracción de RNA total miARN <ol><li> Realizar la extracción miRNA en andamios y muestras crecidas 2D (diferenciado e indiferenciado, control HNSC). </li><li> Descongele los andamios, insertados en una placa de 12 pocillos, si es necesario. Combinar el contenido de reactivo de lisis (500 l) de 2 pocillos en el mismo 1,5 ml tubo Eppendorf, volumen final 1 ml de reactivo de lisis. Tenga cuidado de dejar el andamio en el pozo. </li><li> Para muestras recogidas previamente como secas celulares se sedimentaron 2D crecido (cultivos HNSC 2D diferenciados y de control indiferenciada) añadir 1 ml de reactivo de lisis y transferir contenido en 1,5 ml tubo de microcentrífuga. </li><li> Homogeneizar cada muestra de prueba utilizando una jeringa de 1 ml y una aguja corta de calibre 20 a 25. Pasar el lisado a través de la aguja utilizando una jeringa de 1 ml hasta 5 veces hasta que se logre un lisado homogénea. </li><li> Añadir 200 l de cloroformo a cada tubo Eppendorf y tape firmemente. Invertir y tubos de vórtice amezclar el contenido. </li><li> Centrifugar cada 1,5 ml tubo de microcentrífuga que contiene homogeneizado durante 15 min a ≥12,000 x g. </li><li> Pasar la fase acuosa superior de cada muestra (evitar la transferencia de cualquier interfase, líquido rosa color) a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml nuevo que contenía 750 l de etanol al 100%. Mezclar bien por inversión. </li><li> Pipetear hasta 700 l de cada muestra de prueba, incluyendo cualquier precipitado, en una mini columna en un tubo de recogida de 2 ml. Cierre la tapa y centrifugar a ≥8,000 xg durante aproximadamente 30 segundos a temperatura ambiente. Deseche el flujo directo. Repita este paso con el resto de la muestra. </li><li> Realizar una digerir el ADN durante 15 min. </li><li> Añadir 700 l RWT tampón a la mini columna y centrifugar durante aproximadamente 30 segundos a ≥8,000 x g. Deseche el flujo directo. </li><li> Lave la mini columna añadiendo 500 l de tampón RPE y centrifugar durante aproximadamente 30 segundos a ≥8,000 x g. Deseche el flujo directo. Repita wash.Centrifuge en ≥12,000 xg durante 1 min para secar la membrana más. </li><li> Eluir el ARN total en un tubo Eppendorf de 1,5 ml mediante la adición de 40 l de agua libre de RNasa a la mini columna y centrifugación durante 1 min a ≥8,000 x g. Medir la concentración de ARN total con la ayuda de un espectrofotómetro apropiado. </li></ol> 2.2) miARN Preparación de ADNc <ol><li> Preparar la mezcla maestra de transcripción inversa. Cada muestra requiere 4 l de tampón 5x miScript Hispec, 2 l de 10x energía atómica mezcla, 2 l miScript revertir mezcla transcriptasa. </li><li> Alícuota 8 l de mezcla maestra en un tubo de PCR, añadir volumen requerido de ARN total (250 ng), y agregue el agua libre de RNasa a un volumen final de 20 l. </li><li> Incubar durante 60 min a 37 ° C.Incubate durante 5 min a 95 ° C para inactivar miScript de la transcriptasa inversa Mix. </li><li> Añadir 200 RNasa libre de agua l de cada reacción de 20 l de transcripción inversa, almacenar a -20 ° C, o proceder con verdadero-time PCR inmediatamente. </li></ol> 2.3) Células Madre y las vías de desarrollo Enfocado matriz miARN PCR <ol><li> Preparar los componentes de la mezcla PCR en un tubo de 15 ml mediante la adición de 1.375 l de 2x mezcla maestra SYBR verde, 100 l preparación de ADNc de los genes miARN, 275 l de 10x miScript universal Primer, y 1.000 l de agua libre de RNasa (volumen total de 2.750 l). </li><li> Transferencia PCR componentes de la mezcla en un depósito de carga PCR. Retire con cuidado el 96 pocillos gama placa de PCR de su envase. </li><li> Añadir 25 l componentes de la PCR de la mezcla a cada pocillo de la matriz de PCR usando una pipeta de 8 canales, o una pipeta de 12 canales utilizando sólo 8 consejos. Cambie puntas de pipeta después de cada paso de pipeteado para evitar la contaminación cruzada entre los pozos. </li><li> Sellar la placa con película de adhesivo óptico, y centrifugar durante 1 min a 1000 xg a temperatura ambiente (15-25 ° C) para eliminar las burbujas. Inspeccione visualmente la placa de debajo para asegurar que no hay burbujas en los pocillos. </li><li> Coloque la placa de 96 pocillos matriz de PCR en el termociclador en tiempo real. </li><li> Programe el tiempo real termociclador en consecuencia: 1 ciclo a 95 ° C durante 10 minutos, y 45 ciclos de 15 segundos a 95 ° C y 1 min a 60 ° C establece una sola (la recolección de datos de fluorescencia). </li><li> Exportar los valores de Ct para todos los pozos a una hoja de cálculo de Excel en blanco para su uso con matriz PCR análisis de datos Plantilla Excel y el software basado en la web. NOTA: El software está disponible en <a href="http://www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php">www.SABiosciences.com/pcrarraydataanalysis.php</a> . </li></ol> 3. Análisis Computacional para miARN predicción y validación de objetivos de la meta ARNm por el reportero plásmido transfección y Ddual ensayo de luciferasa. 3.1) Análisis Computacional para la Predicción del miRNA Target <ol><li> Navegar PicTar ( <a href="http://pictar.mdc-berlin.de/">http://pictar.mdc-berlin.de/</a> ) 21, algoritmo disponible en línea para la identificación de miRNA objetivo mRNAs de predicción. </li><li> Haga clic en &quot;haga clic aquí para la predicción PicTar en los vertebrados&quot;. Una nueva página se abrirá. </li><li> En la nueva página, la interfaz web PicTar, elegir especies en el menú desplegable e introduzca miARN de interés en el cuadro de miRNA ID. Haga clic en la búsqueda de objetivos de un miRNA. </li><li> Observar una lista de mRNAs objetivo clasificados según su puntuación aPicTar. NOTA: PicTar calcula una puntuación que refleja la probabilidad de que un determinado UTR estará dirigido por el miRNA seleccionado, y se basa en la complementariedad de la semilla, la termodinámica y una predicción combinatoria de objetivos comunes en juegos de co-expresó miRNAs 22. </li><li> Del mismo modo recuperar la lista de los ARNm diana utilizando DIANA-LAB ( <a href="http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/">http://diana.cslab.ece.ntua.gr/microT/</a> ) 23, y TargetScan ( <a href="http://www.targetscan.org/">http://www.targetscan.org/</a> ) 24, alternativa en línea disponible algoritmos. </li><li> Compilar un cuadro comparativo de mIRNAS basado en el ranking obtenido utilizando diferentes herramientas de software. PicTar clasifica por puntuación, DianaLab por la precisión (basado en la relación señal a ruido y una puntuación de precisión para la evaluación de la significación de los resultados predichos), y por TargetScan PCT total (basado en la complementariedad de la semilla, la energía libre termodinámica de la unión, sobre la conservación diferentes especies), véase la Tabla 1. </li></ol> 3.2) Validación de Target ARNm por el reportero plásmido transfección y Dual ensayo de luciferasa. NOTA: 3 &#39;UTR reporteros luciferasa para la validación de ARNm objetivo ha sido descrito previamente 25. <ol><li> La transfección <ol><li> Semilla células HeLa a una densidad de 10 5 células / pocillo en placas de 24 pocillos. </li><li> Después de 24 horas, co-transfectar células HeLa con 1,5 l de reactivo de transfección y, o bien 100 ng de plásmido NR4A3 3 UTR &#39;Utror SOX5 3&#39;, así como 20 nM imita miARN (HSA-miR-96-5p para SOX5 3217; UTR, y hsa-miR-7-5p y hsa-miR-17-5p para NR4A3 3 &#39;UTR, respectivamente) por pocillo. </li><li> Pocillos de control cotransfectar con NR4A3 3 &#39;Utror SOX5 3&#39; UTRplasmid y fluorocromo marcado siRNAs control negativo. La transfección de los pocillos de control con fluorocromo etiquetados siRNAs control negativo permite la evaluación de la eficacia de transfección y representa el imitador especificidad se unen miARN 3&#39;UTR. </li></ol></li><li> Medición de doble luciferase Actividades <ol><li> Mida actividades luciferasa de luciérnaga y Renilla después de la transfección 24 horas. Retire medio de crecimiento celular. </li><li> Preparar la solución de trabajo I mediante la adición de 50 l de sustrato I en 10 ml de Solución I; mezclar bien. Añadir 300 l de solución de trabajo que en cada uno de 24 pocillos. </li><li> Transferir el contenido de cada 24 pocillos en 3 pocillos de una placa blanca 96, 100 l cada uno. Espere 10 minutos y medir luciferasa de luciérnaga en conjunto luminómetro para la adquisición de luminiscencia. </li><li> Preparar solut trabajoion II mediante la adición de 50 l de sustrato II en 10 ml de solución II; mezclar bien. Añadir 100 l de solución de trabajo que en cada 96 así que ya contiene 100 l de solución de trabajo I. </li><li> Espere 10 minutos y medir Renilla luciferasa en conjunto luminómetro para la adquisición de luminiscencia. Calcular la relación de la luminiscencia de la luciferasa de la luciérnaga de la luciferasa de Renilla. </li></ol></li></ol>

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	<li>Falanga, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+in+tissue+repair+and+regeneration.">Stem cells in tissue repair and regeneration.</a> J Invest Dermatol. 132 (6), 1538-1541 (2012).</li><li>Pollock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conditionally+immortal+clonal+stem+cell+line+from+human+cortical+neuroepithelium+for+the+treatment+of+ischemic+stroke.">A conditionally immortal clonal stem cell line from human cortical neuroepithelium for the treatment of ischemic stroke.</a> Exp Neurol. 199 (1), 143-155 (2006).</li><li>Hodges, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+stem+cell+lines+suitable+for+transplantation.">Making stem cell lines suitable for transplantation.</a> Cell Transplant. 16 (2), 101-115 (2007).</li><li>Smith, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implantation+site+and+lesion+topology+determine+efficacy+of+a+human+neural+stem+cell+line+in+a+rat+model+of+chronic+stroke.">Implantation site and lesion topology determine efficacy of a human neural stem cell line in a rat model of chronic stroke.</a> Stem Cells. 30 (4), 785-796 (2012).</li><li>Stroemer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neural+stem+cell+line+CTX0E03+promotes+behavioral+recovery+and+endogenous+neurogenesis+after+experimental+stroke+in+a+dose-dependent+fashion.">The neural stem cell line CTX0E03 promotes behavioral recovery and endogenous neurogenesis after experimental stroke in a dose-dependent fashion.</a> Neurorehabil Neural Repair. 23 (9), 895-909 (2009).</li><li>Kalladka, D., Muir, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+repair:+cell+therapy+in+stroke.">Brain repair: cell therapy in stroke.</a> Stem Cells Cloning. 7, 31-44 (2014).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Anokye-Danso, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+miRNA-mediated+reprogramming+of+mouse+and+human+somatic+cells+to+pluripotency.">Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 8 (4), 376-388 (2011).</li><li>Li, X., Jin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+small+regulatory+RNAs+in+determining+neuronal+identity.">Roles of small regulatory RNAs in determining neuronal identity.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 329-338 (2010).</li><li>Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+as+a+scaffold+for+tissue+reconstruction.">The extracellular matrix as a scaffold for tissue reconstruction.</a> Semin Cell Dev Biol. 13 (5), 377-383 (2002).</li><li>Buxboim, A., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells+feel+the+difference.">Stem cells feel the difference.</a> Nat Methods. 7 (9), 695-697 (2010).</li><li>Li, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+nanofibrous+scaffold+for+cartilage+tissue+engineering+using+human+mesenchymal+stem+cells.">A three-dimensional nanofibrous scaffold for cartilage tissue engineering using human mesenchymal stem cells.</a> Biomaterials. 26 (6), 599-609 (2005).</li><li>Lutolf, M. P., Gilbert, P. M., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+materials+to+direct+stem-cell+fate.">Designing materials to direct stem-cell fate.</a> Nature. 462 (7272), 433-441 (2009).</li><li>Ortinau, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+3D-scaffold+formation+on+differentiation+and+survival+in+human+neural+progenitor+cells.">Effect of 3D-scaffold formation on differentiation and survival in human neural progenitor cells.</a> Biomed Eng Online. 9 (1), 70 (2010).</li><li>Saha, K., Pollock, J. F., Schaffer, D. V., Healy, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+synthetic+materials+to+control+stem+cell+phenotype.">Designing synthetic materials to control stem cell phenotype.</a> Curr Opin Chem Biol. 11 (4), 381-387 (1016).</li><li>Knight, E., Murray, B., Carnachan, R., Przyborski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alvetex(R):+polystyrene+scaffold+technology+for+routine+three+dimensional+cell+culture.">Alvetex(R): polystyrene scaffold technology for routine three dimensional cell culture.</a> Methods Mol Biol. 695, 323-340 (2011).</li><li>Bokhari, M., Carnachan, R. J., Przyborski, S. A., Cameron, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emulsion-+templated+porous+polymers+as+scaffolds+for+three+dimensional+cell+culture:+effect+of+synthesis+parameters+on+scaffold+formation+and+homogenity.">Emulsion- templated porous polymers as scaffolds for three dimensional cell culture: effect of synthesis parameters on scaffold formation and homogenity.</a> J. Mater. Chem. 17, 4088-4094 (2007).</li><li>Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+culture+device+enabling+three-dimensional+cell+growth+and+improved+cell+function.">Novel cell culture device enabling three-dimensional cell growth and improved cell function.</a> Biochem Biophys Res Commun. 354 (4), 1095-1100 (2007).</li><li>Stevanato, L., Sinden, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+microRNAs+on+human+neural+stem+cell+differentiation+in+two-+and+three-dimensional+cultures.">The effects of microRNAs on human neural stem cell differentiation in two- and three-dimensional cultures.</a> Stem Cell Res Ther. 5 (2), 49 (2014).</li><li>Ippolito, D. M., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+synapses:+an+immunocytochemistry-based+assay+to+quantify+synapse+number.">Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse number.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li><li>Chen, K., Rajewsky, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+selection+on+human+microRNA+binding+sites+inferred+from+SNP+data.">Natural selection on human microRNA binding sites inferred from SNP data.</a> Nat Genet. 38 (12), 1452-1456 (2006).</li><li>Krek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+microRNA+target+predictions.">Combinatorial microRNA target predictions.</a> Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).</li><li>Maragkakis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+microRNA+target+prediction+correlates+with+protein+repression+levels.">Accurate microRNA target prediction correlates with protein repression levels.</a> BMC Bioinformatics. 10, 295 (2009).</li><li>Lewis, B. P., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+seed+pairing,+often+flanked+by+adenosines,+indicates+that+thousands+of+human+genes+are+microRNA+targets.">Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets.</a> Cell. 120 (1), 15-20 (2005).</li><li>Aldred, S. F., Collins, P., Trinklein, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+targets+of+human+micrornas+with+the+LightSwitch+Luciferase+Assay+System+using+3'UTR-reporter+constructs+and+a+microRNA+mimic+in+adherent+cells.">Identifying targets of human micrornas with the LightSwitch Luciferase Assay System using 3'UTR-reporter constructs and a microRNA mimic in adherent cells.</a> J Vis Exp. (55), (2011).</li><li>Ponnio, T., Conneely, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=nor-1+regulates+hippocampal+axon+guidance,+pyramidal+cell+survival,+and+seizure+susceptibility.">nor-1 regulates hippocampal axon guidance, pyramidal cell survival, and seizure susceptibility.</a> Mol Cell Biol. 24 (20), 9070-9078 (2004).</li><li>Martinez-Morales, P. L., Quiroga, A. C., Barbas, J. A., Morales, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX5+controls+cell+cycle+progression+in+neural+progenitors+by+interfering+with+the+WNT-beta-catenin+pathway.">SOX5 controls cell cycle progression in neural progenitors by interfering with the WNT-beta-catenin pathway.</a> EMBO Rep. 11 (6), 466-472 (2010).</li><li>Kwan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX5+postmitotically+regulates+migration,+postmigratory+differentiation,+and+projections+of+subplate+and+deep-layer+neocortical+neurons.">SOX5 postmitotically regulates migration, postmigratory differentiation, and projections of subplate and deep-layer neocortical neurons.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (41), 16021-16026 (2008).</li><li>Lai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX5+controls+the+sequential+generation+of+distinct+corticofugal+neuron+subtypes.">SOX5 controls the sequential generation of distinct corticofugal neuron subtypes.</a> Neuron. 57 (2), 232-247 (2008).</li></ol>

Todos los autores son empleados, de valores y / o titulares de opciones sobre acciones en ReNeuron Ltd o su compañía matriz. Este estudio fue apoyado por ReNeuron (RENE.L).

El desarrollo de nuevos ensayos in vitro para evaluar y mejorar la diferenciación de células madre siempre ha presentado un reto para la investigación de sus funcionalidades y capacidades terapéuticas. A largo plazo y el apego estable de hNSCs, necesaria para el desarrollo de un 3D robusto en ensayo de diferenciación in vitro, fue abordada por probar varios sustratos 3D con diferentes características en cuanto a materiales y estructuras. Como parte del desarrollo del ensayo también se evaluó la concentración óptima de siembra de células e identificamos la necesidad de los andamios que se laminina recubiertos. Aunque nuestros hNSCs pueden diferenciarse espontáneamente en 4-OHT y la eliminación del factor de crecimiento, la implementación de un sistema de cultivo 3D mostró una mejoría significativa en su capacidad de diferenciación medida por axón proceso de derivación en comparación con hNSCs 2D diferenciado estándar. Para investigar el efecto de difere inducida 3Dntiation sobre la expresión HNSC miRNA que utiliza una matriz de PCR. En comparación con chip de micromatriz estándar de PCR matriz ofrece las ventajas de una cuantificación directa y la validación de los genes miARN de interés. Aunque la matriz de PCR se limita en términos de número total de los genes miARN por matriz, por ejemplo en menos de 96 aquí, puede ser adaptado para incluir específicamente miRNAs de interés, en nuestro caso se informó anteriormente en el desarrollo de células madre. La expresión de la vía centrado miRNAs se perfila en hNSCs diferenciados 3D y 2D en comparación con hNSCs indiferenciadas. Se seleccionaron los más significativamente las reguladas miRNAs y se analizaron para evaluar sus mRNAs putativo objetivo con la intención de determinar su funcionalidad y la interpretación biológica utilizando algoritmos disponibles en línea (DIANA Lab, PicTar, y TargetScans). Un único miARN puede reconocer cientos de objetivos y por esta razón hemos validado interacciones miARN con 3 &#39;UTR mRNAsthat pueden ser candidatos adecuados en unregulación xonal. NR4A3, un objetivo de la HSA-miR-7, y miR-17 de la familia, es miembro de los receptores nucleares de la familia NR4A que, dependiendo de su nivel de expresión, están involucrados en la diferenciación, la supervivencia, la apoptosis y la regulación de los axones del hipocampo orientación 26. Del mismo modo SOX5, un objetivo de hsa-miR-96, se informó a controlar la progresión del ciclo celular en células progenitoras neurales 27 longitud axón 28, migración, diferenciación post-migratoria, y proyecciones de las neuronas 29. Tanto SOX5 y NR4A3 se identificaron como un ARNm diana directa de hsa-miR-96 y HSA-miR-7 y 17, respectivamente, mediante ensayos de doble reportero luciferasa. Dual luciferasa (luciérnaga y Renilla) se basa en dos genes indicadores diferentes en el mismo plásmido y ofrece un sistema mejorado permitiendo la normalización de los efectos causados ​​por la transfección subóptima y los efectos citotóxicos en comparación con un único sistema de plásmido de luciferasa. Como parte de nuestro desarrollo de ensayos también optimizamos nuestra conditi transfeccióncomplementos a fin de obtener una alta eficiencia. El protocolsdescribed el presente documento puede ser explotado para optimizar aún más y caracterizar la diferenciación in vitro HNSC que puede beimplemented protocolos intransplantation para los estudios pre-clínicos y futuras aplicaciones clínicas.

Investigación de células madre juega un papel central en la medicina regenerativa, que también se extiende por las disciplinas de ingeniería de tejidos, biología celular de desarrollo, la terapia celular, la terapia génica, y los biomateriales (andamios y matrices). Las células madre son importantes en tanto órgano reparación de tejidos developmentand; la comprensión de cómo funcionan las células madre es fundamental para el desarrollo de tratamientos basados ​​en células madre nueva 1. CTX0E03 es un condicionalmente inmortalizada de células madre neurales humanas (HNSC) línea clonal, 2 aislados del primer trimestre corteza fetal humano. CTX0E03 ha definido las características de calidad que son esenciales para la banca celular clínica bajo buenas prácticas de fabricación (GMP) 3. HNSCs pueden diferenciarse espontáneamente en neuronas, células gliales, y oligodendrocitos y se han demostrado para mejorar los déficits neurológicos cuando se trasplantan en un modelo de roedor de 2,4,5 isquemia focal. El CTX0E03 hNSCs están actualmente en ensayos clínicos para el accidente cerebrovascular Invalidezdad (NCT01151124 6 y NCT02117635, Clinicaltrials.gov). MiRNAs tienen un promedio de 22 nucleótidos de longitud y son probados moléculas reguladoras 7, que no codifican proteínas, sino más bien unirse región no traducida 3 prime (3&#39;UTR) de mRNAs, la regulación de su estabilidad y la traducción en proteínas. MiRNAs se reportan para participar en la regulación de una serie de procesos celulares, incluyendo el desarrollo, la proliferación y la diferenciación 8. Varios miRNAs se han implicado en la regulación de la suerte y la especificación de las células madre neurales 9. En dos dimensiones (2D) ambiente de cultivo estándar de la complejidad del entorno in vivo no se corresponde, en consecuencia, la inducción y regulación de la diferenciación HNSC no es óptima. In vivo, las células están rodeadas por un microambiente tres dimensiones (3D) compuesta por otra células y ligandos extracelulares, incluyendo muchostipos de colágenos, laminina, y otras proteínas de la matriz (matriz extracelular, ECM). Estudios previos han informado de que la topografía arquitectónica de los materiales que imitan ECM y su fenotipo celular influencia geometría y el destino 10-15. Un número de andamios 3D disponibles comercialmente están disponibles; se utilizó un andamio de poliestireno altamente poroso diseñado con una arquitectura bien definida y uniforme en una membrana de espesor de 200 micras que proporciona un espacio 3D en el cual las células pueden invadir y diferenciar 16-18. Ensayos de diferenciación en el presente documento en 2D y 3D se utilizan para evaluar consecuencia axonprocess. Además, se describe un método para el perfil de expresión de miRNA de una línea HNSC grado clínico para investigar más a fondo los efectos de miRNA en su diferenciación. Los métodos en aquí ilustradas se basan en las descritas originalmente en 19.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM:F12</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>21331-020</td>
			<td>For RMM medium preparation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Human Albumin Solution&#160;</td>
			<td>Baxter health care limited&#160;</td>
			<td>1501052</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 0.03%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Transferrin, Human recombinant</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8158</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 5 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Putrescine DiHCl&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5780</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 16.2 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin, Human recombinant&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9278</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 5 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Progesterone&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6149</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 60 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25030-24</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of&#160; 2 mM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Selenite&#160;&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9133</td>
			<td>For RMM medium used at a final concentration of 40 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">bFGF&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-15</td>
			<td>To be added to RMM medium, used at a final concentration of 10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGF&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-100-188</td>
			<td>To be added to RMM medium, used at a final concentration of 20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-OHT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7904</td>
			<td>To be added to RMM medium, used at a final concentration of 100 nM</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Laminin</td>
			<td>AMS Biotech</td>
			<td>3400-010-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TrypZean/EDTA</td>
			<td>Lonza&#160;</td>
			<td>BE02-034E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Water for irrigation</td>
			<td>Baxter Healthcare</td>
			<td>UKF7114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Defined Trypsin Inhibitor (DTI) (store -20&#176;C)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R007-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alvetex 12 well plate&#160;</td>
			<td>Reinnervate Ltd</td>
			<td>AVP002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol&#160;</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>1.00986.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;III tubulin antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hoechst</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B2261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">miRNeasy mini kit</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>217004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RNase free DNase&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloroform</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7559-5VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">miScript II RT Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>218160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SYBR green PCR kit</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>218073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell Development &#38; Differentiation miScript miRNA PCR Array</td>
			<td>Qiagen/ SABiosciences</td>
			<td>MIHS-103Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lightcycler 480 white 96 plate</td>
			<td>Roche</td>
			<td>&#160;4729692001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lightcycler 480&#160; sealing foil</td>
			<td>Roche</td>
			<td>&#160;4729757001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vector NR4A3 miRNA 3&#39; UTR target clones&#160;</td>
			<td>GeneCopeia</td>
			<td>HmiT019538-MT0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vector SOX5 miRNA 3&#39; UTR target clones&#160;</td>
			<td>GeneCopeia</td>
			<td>HmiT017632-MT01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Allstars negative control siRNA AF 488 (Qiagen).</td>
			<td>Qiagen&#160;</td>
			<td>1027284</td>
			<td>MiRNA transfection control</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Luc-Pair miR Luciferase Assay</td>
			<td>GeneCopeia</td>
			<td>LPFR-M010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lightcycler 480&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GloMax 96 microplate luminometer&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

differentiation of a human neural stem cell line on three dimensional cultures, analysis of microrna and putative target genes

Las células madre neurales (NSC) son capaces de auto-renovación y diferenciación en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos bajo microambientes locales específicas. Aquí, presentamos un conjunto de métodos utilizados para la diferenciación de tres dimensiones (3D) y el análisis de miRNA de una línea clonal de células madre neurales humanas (HNSC), actualmente en ensayos clínicos para la discapacidad accidente cerebrovascular (NCT01151124 y NCT02117635, Clinicaltrials.gov). HNSCs se derivan de un primer trimestre corteza fetal humano aprobado ético y condicionalmente inmortalizadas usando la integración retroviral de una sola copia de la c-MycER TAM construir. Describimos cómo medir proceso axón resultado de hNSCs diferenciados en andamios en 3D y la forma de cuantificar los cambios asociados en la expresión de los genes miARN utilizando variedad de PCR. Además, damos ejemplos de análisis computacional con el objetivo de seleccionar miARN putativo objetivos. SOX5 y NR4A3 fueron identificados como adecuados miARN putativo objetivo del seleccionado significativamente las regulanmiRNAs d en HNSC diferenciada. Validación miARN se realizó en SOX5 y NR4A3 3&#39;UTRs por doble transfección del plásmido reportero y ensayo de luciferasa dual.

En la Figura 1 se visualiza la investigación y cuantificación de HNSC diferenciación en andamios 3D en comparación con cultivos tradicionales superficie plana (2D) y expressedas mediciones excrecencia proceso de axón. En la Figura 2 es representedthe flujo de trabajo y los resultados de la cuantificación miARN utilizando células madre y las vías de desarrollo se centraron gama miARN PCR para investigar la expresión diferencial de miRNAs en hNSCs diferenciadas en 2D y 3D en comparación con el control indiferenciada. Siguiendo miARN análisis comparativo entre hNSCs diferenciadas y no diferenciadas y análisis computacional para la predicción de destino, SOX5 y NR4A3 (NOR1) fueron identificados como los ARNm putativo objetivo. Para estudiar la interacción directa entre los miRNAs y su sitio putativo en el 3&#39;UTR de ARNm se utilizó 2 plásmidos disponibles comercialmente que contienen ya sea SOX5 o secuencia 3&#39;UTR NR4A3 insertados aguas abajo del gen reportero de la luciferasa de luciérnaga, una<html> nd contiene en el mismo gen de la luciferasa Renilla plásmido para la normalización. Los resultados representativos de la actividad de luciferasa 3 &#39;UTR baja regulación se presenta en la figura 3. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig1.jpg" /> Figura 1:. La diferenciación de hNSCs en andamios 3D, y la medición del crecimiento de proceso axón es (A) Después de la tinción ICC estándar para β3-tubulina (verde) y núcleos counterstained con Hoechst (azul) microfotografías representativas fueron adquiridas y medición de los procesos de los axones fueron realizado con la ayuda de un software de análisis de imagen. (B) Diagramas de informes de la medición del crecimiento de axón proceso realizado en hNSCs diferenciados en 2D y 3D para 1 (1W) o 3 semanas (3W).com / files / ftp_upload / 52410 / 52410fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig2.jpg" /> Figura 2:. Workflow esquemática de miARN perfiles en hNSCs diferenciadas ARN total, incluyendo miRNAs, fue extraído de cualquiera hNSCs diferenciadas en andamios 3D y culturas 2D estándar, o el control indiferenciada. 250 ng de ARN total fueron transcritas-retro con un método que facilita la conversión selectiva de miRNAs maduros en ADNc adecuado para la cuantificación miRNA con la diferenciación celular y el desarrollo humanos matriz miScript miARN PCR. La geo-media de SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A y RNU6-2 se utilizó para el análisis de datos basado en el método 2 -ΔΔct. Cambios significativos se definieron como +/- 1.5 doblar y regulación a la baja a un stagrado estadísticamente significativo. Los datos fueron analizados mediante el software basado en web disponible en los resultados se expresan como clustergram. Modificado de la Figura 3 19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52410/52410fig3.jpg" /> Figura 3: Validación de miARN predijo mRNA utilizando un ensayo informe luciferasa dual. (A) Diagrama de Representante de un plásmido informador de luciferasa dual utilizado como una herramienta para validar secuencia 3&#39;UTR como un objetivo directo de un miARN. (B) Micrografía Representante mostrando la eficacia de transfección. (C) &#160; Señales, expresados ​​como actividad luciferasa relativa, de humano 3 y #39; genes reporteros UTR ofSOX5 y NR4A3 fueron eliminados de manera significativa en la presencia de hsa-miR-96 y HSA-miR-7 y 17 imita miARN respectivamente. Modificado de la Figura 5 19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52410/52410fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td colspan="2"> DIANALAB </td><td> PicTar </td><td> TargetScan </td></tr><tr><td> miRNA </td><td> Gen diana </td><td> Sitios objetivo / encontraron genes </td><td> Precisión </td><td> Puntuación </td><td> Agregada P CT </td></tr><tr><td> hsa-miR-96 </td><td> SOX5 </td><td> 1214/763 </td><td> 1 </td><td> 6.74 </td> &lt;td&gt; 0,94 </td></tr><tr><td> hsa-miR-183 </td><td> DUSP10 </td><td> 302/190 </td><td> 0.72 </td><td> 4.75 </td><td> 0.85 </td></tr><tr><td> hsa-miR-302a </td><td> NR4A3 </td><td> 863/473 </td><td> 0.84 </td><td> 3.05 </td><td> NF </td></tr><tr><td> hsa-miR-182 </td><td> FOXN3 </td><td> 1358/794 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> 0.96 </td></tr><tr><td> hsa-miR-7 </td><td> NR4A3 </td><td> NF </td><td> NF </td><td> 1.61 </td><td> 0.17 </td></tr><tr><td> hsa-miR-7 </td><td> FOXN3 </td><td> 399/136 </td><td> 0.17 </td><td> NF </td><td> 0.88 </td></tr><tr><td> hsa-miR-20a </td><td> NR4A3 </td><td> 1650/841 </td><td> 0.85 </td><td> 5.87 </td><td> 0.63 </td></tr><tr><td><strong&gt; hsa-miR-20b </td><td> NR4A3 </td><td> 1955/973 </td><td> 0.9 </td><td> 5.87 </td><td> 0.63 </td></tr><tr><td> hsa-miR-17 </td><td> NR4A3 </td><td> 1928/961 </td><td> 0.9 </td><td> 5.38 </td><td> 0,63 + 0,37 </td></tr><tr><td> hsa-miR-20a </td><td> EIF4G3 </td><td> 1650/841 </td><td> 0.97 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr><tr><td> hsa-miR-20b </td><td> EIF4G3 </td><td> 1955/973 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr><tr><td> hsa-miR-17 </td><td> EIF4G3 </td><td> 1928/961 </td><td> 0.94 </td><td> NF </td><td> NF </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Lista de miARN ARNm de predicción de destino. Mesa Representante de miRNAs, meta genes predictivos y análisis de algoritmos (predecirion / partitura / agregado proporcionado usando Diana Lab, PicTar y TargetScan respectivamente). Modificado de la tabla 3 19.

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Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.

La diferenciación de una línea de células madre neurales humanas en las Tres Culturas de dimensiones, Genes Análisis de microARN y putativo objetivo

Neural stem cells (NSCs) are capable of self-renewal and differentiation into neurons, astrocytes and oligodendrocytes under specific local ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.8K vistas.  ReNeuron. With the intent of characterizing changes in miRNAs on differentiated human neural stem cells (hNSCs) we describe hNSC differentiation on a three dimensional system,the evaluation of changes in microRNA expression by miRNA PCR array, and computational analysis for miRNA target prediction and its validation by dual luciferase assay.

Video: Differentiation of a Human Neural Stem Cell Line on Three Dimensional Cultures, Analysis of MicroRNA and Putative Target Genes

Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and the neurosciences. Traditional in vitro experimental models used in neurobiology include primary neuronal cultures from rats and mice, neuroblastoma cell lines including rat B35 and mouse Neuro-2A cells, rat PC12 cells, and short-term slice cultures. While many researchers rely on these models, they lack a human component and observed experimental effects could be exclusive to the respective species and may not occur identically in humans. Additionally, although these cells are neurons, they may have unstable karyotypes, making their use problematic for studies of gene expression and reproducible studies of cell signaling. It is therefore important to develop more consistent models of human neurological disease. 
The following procedure describes an easy-to-follow, reproducible method to obtain homogenous and viable human neuronal cultures, by differentiating the chromosomally stable human neuroblastoma cell line, SH-SY5Y. This method integrates several previously described methods1-4 and is based on sequential removal of serum from media. The timeline includes gradual serum-starvation, with introduction of extracellular matrix proteins and neurotrophic factors. This allows neurons to differentiate, while epithelial cells are selected against, resulting in a homogeneous neuronal culture. Representative results demonstrate the successful differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells from an initial epithelial-like cell phenotype into a more expansive and branched neuronal phenotype. This protocol offers a reliable way to generate homogeneous populations of neuronal cultures that can be used for subsequent biochemical and molecular analyses, which provides researchers with a more accurate translational model of human infection and disease.

It is critical in neurobiology and neurovirology to have a reliable, replicable in vitro system that serves as a translational model for what occurs in vivo in human neurons. This protocol describes how to culture and differentiate SH-SY5Y human neuroblastoma cells into viable neurons for use in in vitro applications.

La diferenciación de la línea celular SH-SY5Y de neuroblastoma humano

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

La cuantificación tridimensional de espinas dendríticas de piramidal neuronas derivadas de células madre humanas pluripotentes inducidas

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Generación de Genéticamente Modificados cultivos de piel organotípicos Uso Desvitalizada Dermis Humana

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.

Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

El cultivo humanas pluripotentes y células madre neurales en un sistema de cultivo celular cerrado para la investigación básica y preclínica

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

Análisis de inducida por ácido retinoico Neural diferenciación de células madre embrionarias de ratón en cuerpos embrioides dos y tres dimensiones

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Diferenciación rápida y dirigida de las células epiteliales del pigmento retiniano de humanos embrionarios o inducidas pluripotenciales células

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Zika Virus Infection of Cultured Human Fetal Brain Neural Stem Cells for Immunocytochemical Analysis

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental neurobiology. Rather than use an animal model or genetically modified induced pluripotent cells, human neural stem cells provide an effective in vitro system to examine the effects of treatments, screen drugs, or examine individual differences. Here, we provide the detailed protocols for methods used to expand human fetal brain neural stem cells in culture with serum-free media, to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes via different priming procedures, and to freeze and recover these cells. Furthermore, we describe a procedure of using human fetal brain neural stem cells to study Zika virus infection.

This article details the methods that are used to expand human fetal brain neural stem cells in culture, as well as how to differentiate them into various neuronal subtypes and astrocytes, with an emphasis on the use of neural stem cells to study Zika virus infection.

Infección por el Virus Zika de células madre neurales de cerebro Fetal humano cultivadas para análisis de Immunocytochemical

Human fetal brain neural stem cells are a unique non-genetically modified model system to study the impact of various stimuli on human developmental ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

Representación tridimensional y análisis de Immunolabeled, aclaró redes vasculares vellosas placentarias humanas

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. Moreover, although existing culture techniques allow biochemical perturbations, these methods do not provide a means to study the effects of mechanical force and tissue stiffness during development of the inner ear sensory organs. Here we describe a method for three-dimensional organotypic culture of the intact murine utricle and cochlea that overcomes these limitations. The technique for adjustment of a three-dimensional matrix stiffness described here permits manipulation of the elastic force opposing tissue growth. This method can therefore be used to study the role of mechanical forces during inner ear development. Additionally, the cultures permit virus-mediated gene delivery, which can be used for gain- and loss-of-function experiments. This culture method preserves innate hair cells and supporting cells and serves as a potentially superior alternative to the traditional two-dimensional culture of vestibular and auditory sensory organs.

Three-dimensional organotypic cultures of the murine utricle and cochlea in optically clear collagen I gels preserve innate tissue morphology, allow for mechanical stimulation through adjustment of matrix stiffness, and permit virus-mediated gene delivery.

Culturas Organotypic tridimensionales de órganos sensoriales vestibulares y auditivas

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell types include enzyme-secreting acinar cells, an arborized ductal system responsible for the transportation of enzymes to the gut, and hormone-producing endocrine cells. 
Endocrine beta-cells are the sole cell type in the body that produce insulin to lower blood glucose levels. Diabetes, a disease characterized by a loss or the dysfunction of beta-cells, is reaching epidemic proportions. Thus, it is essential to establish protocols to investigate beta-cell development that can be used for screening purposes to derive the drug and cell-based therapeutics. While the experimental investigation of mouse development is essential, in vivo studies are laborious and time-consuming. Cultured cells provide a more convenient platform for screening; however, they are unable to maintain the cellular diversity, architectural organization, and cellular interactions found in vivo. Thus, it is essential to develop new tools to investigate pancreatic organogenesis and physiology.
Pancreatic epithelial cells develop in the close association with mesenchyme from the onset of organogenesis as cells organize and differentiate into the complex, physiologically competent adult organ. The pancreatic mesenchyme provides important signals for the endocrine development, many of which are not well understood yet, thus difficult to recapitulate during the in vitro culture. Here, we describe a protocol to culture three-dimensional, cellular complex mouse organoids that retain mesenchyme, termed pancreatoids. The e10.5 murine pancreatic bud is dissected, dissociated, and cultured in a scaffold-free environment. These floating cells self-assemble with mesenchyme enveloping the developing pancreatoid and a robust number of endocrine beta-cells developing along with the acinar and the duct cells. This system can be used to study the cell fate determination, structural organization, and morphogenesis, cell-cell interactions during organogenesis, or for the drug, small molecule, or genetic screening.

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Here, we present a protocol to generate insulin expressing 3D murine pancreatoids from free-floating e10.5 dissociated pancreatic progenitors and the associated mesenchyme.

Generación de insulina libre de andamios, tridimensional expresar Pancreatoids de progenitores pancreáticos de ratón In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...