Este trabajo es apoyado por NHMRC Programa de Becas # 568969 (PSS) y la Facultad de Medicina de la Universidad de Nueva Gales del Sur, la Iniciativa de Células Madre (KSS).

Todos los procedimientos que a continuación se llevó a cabo utilizando técnicas asépticas dentro de un Gabinete de Bioseguridad Clase II. Los reactivos y equipos utilizados se enumeran en las tablas siguientes. 1. Preparación de 1,1% de alginato (w / v) <ol><li> Añadir 0,275 g de alginato sódico purificado (alto contenido en ácido glucurónico ≥ 60%, la viscosidad&gt; 200 mPa s, y la endotoxina ≤ 100 UE / g) en un tubo estéril de 50 ml y añadir 25 ml de solución estéril de 0,1% de gelatina preparada anteriormente (0,5 g gelatin/500 ml mili-Q H 2 O y se disuelven en autoclave). </li><li> Vórtice del tubo durante aproximadamente 30 segundos para disolver parcialmente el polvo de alginato a continuación, colocar el tubo en un mezclador orbital a 10 xg durante toda la noche (temperatura ambiente). </li><li> Añadir 2,778 ml de 9% de NaCl estéril (4,5 g de NaCl/50 ml mili-Q O H 2) a 25 ml de solución de alginato. Vortex el tubo durante aproximadamente 30 segundos, seguido por centrifugación a 95 xg durante 5 min. </li><li> Guarde la solución de alginato a 4 °; C durante almacenamiento a corto plazo (1-2 meses) oa -20 ° C para almacenamiento a largo plazo (alrededor de un año). </li></ol> 2. Preparación de baño de CaCl Precipitaciones 2 <ol><li> Disolver 14,7 g de CaCl 2. 2H O 2 y 2,38 g de HEPES en 1 litro de Milli-Q O. H 2 </li><li> Ajuste el nivel de pH a 7,4. </li><li> Esterilizar la solución utilizando un filtro de 0,22 micras. </li><li> Baño de precipitación se puede almacenar a temperatura ambiente (6-12 meses). </li></ol> 3. Preparación de Solución decapsulating <ol><li> En 500 ml de fosfato de Dulbecco Buffered Saline (D-PBS), se añaden 50 ml de EDTA 0,5 M y 5 ml de HEPES 1M. </li><li> Esterilizar utilizando un filtro de 0,22 micras o autoclave a 121 ° C durante 20 min. </li><li> Guarde la solución decapsulating a temperatura ambiente (6-12 meses). </li></ol> 4. Preparación de la sustitución de suero (SR) Medio <ol><li> Antes de la encapsulación, preparar el medio de la RS en anticipación dedescrito en la Tabla de los reactivos y equipos específicos. </li></ol> 5. Preparación de inhibidor de ROCK (Y-27632) <ol><li> Diluir Y-27632 en polvo en 0,1% de albúmina sérica humana (HSA) en D-PBS para hacer una solución de 5 mM. </li></ol> 6. Preparación de hCME para la encapsulación <ol><li> Pre-tratamiento de las células con los medios de cultivo suplementado con 10 mM de inhibidor de ROCK (RI) durante dos horas a 37 ° C (protegerlo de la luz). </li><li> Después del tratamiento de RI, lavar las células con D-PBS dos veces y desalojar las células de placas de cultivo enzimáticamente con accutase durante 10 min a 37 ° C. </li><li> Suavemente raspar las células con el rascador pipeta o de células y recoger en un tubo de 15 ml. Neutralizar el accutase con el medio de SR en proporción de 1:1. </li><li> Para preparar una suspensión de células individuales, filtrar las células neutralizadas mediante un filtro de 40 micras y se recogen en un tubo de centrífuga fresco 50 ml. </li><li> Calcular el número total de células en la solución usando un hemocitómetro. </li&gt; <li> Centrifugar la suspensión celular 95 xg durante 5 min y cuidadosamente descartar el sobrenadante después. Se lavan las células con pre-calentado 0,9% de NaCl. Centrifugar 95 xg durante 5 minutos y descartar el sobrenadante. </li></ol> 7. La encapsulación de células <ol><li> Preparar una jeringa de 1 ml unido a un tubo de plástico blando de 14G x 2 &quot;catéter intravenoso. Esto se utiliza para aspirar la suspensión de células a ser cargados en la bomba de jeringa, como se muestra en la Figura 1. </li><li> Resuspender las células con solución de alginato pre-calentado a una densidad de 1,25 millones de células / ml de alginato. Mezclar suavemente con la jeringa y evitar la creación de burbujas. </li><li> Establecer el generador de talón, una bomba de jeringa y el medidor de flujo de aire como se muestra en la Figura 1. Más detalles de estos dispositivos se enumeran en la Tabla de los reactivos y equipos específicos. </li><li> Con las células aspiradas en la jeringa, deseche el tubo de plástico de la sonda intravenosa y conecte la jeringa a la máquina de encapsulación. Asegúrese de que existe una brecha de 10 cm que<html> interpolación el extremo de la máquina de encapsulación y el punto de recogida, como se muestra en la Figura 1. </li><li> Encapsular las células mediante el establecimiento de la bomba de jeringa de 20 ml / h, el caudal de aire a 8 l / min y una presión de 100 kPa (el tamaño de las cápsulas puede ser cambiado mediante la alteración de la tasa de flujo de aire). </li><li> Recoger las células encapsuladas en una placa Petri (100 x 15 mm) rellena con 20 ml de baño de precipitación precalentado durante 7 minutos para estabilizar las cápsulas. </li><li> Transferir las células encapsuladas por aspiración suave en 50 tubos de centrífuga ml llenas con 20 ml de NaCl al 0,9%. </li><li> Permitir las cápsulas para instalarse en la parte inferior del tubo suavemente descartar el sobrenadante. Repetir el proceso de lavado con NaCl al 0,9%. </li><li> Resuspender las células encapsuladas en medio de cultivo precalentado suplementado con RI (10 mM), la transferencia en un frasco de cultivo y se incubaron a 37 ° C / 5% de CO 2. </li></ol> 8. Diferenciación de hESC encapsulado de las neuronas DA ve_content &quot;&gt; El hESC encapsulado se tratan con RI durante 3 días antes de la diferenciación. <ol><li> Semillas de la línea de células del estroma del ratón, PA6 células a una densidad de 1,0 x 10 4 por cm 2 en 0,1% de gelatina recubierto T75 matraz y acondicionar las células en medio PA6 DA diferenciación neuronal (Tabla de Materiales) 24 horas antes de la diferenciación. </li><li> Transferir las cápsulas a un tubo de centrífuga de 50 ml y permitir que se asienten en el fondo del tubo. </li><li> Descartar el sobrenadante y resuspender las cápsulas en células PA6 acondicionado medio de diferenciación neuronal DA. </li><li> Cultura de la hESC encapsulado con la monocapa de células PA6 (9 x 10 6 hESCs por 7,5 x 10 5 células PA6) durante 28 días con un cambio de los medios de comunicación el día 4 y cada dos días a partir de entonces (cambiar sólo la mitad del medio de cada vez). </li><li> Después de 3 semanas en cultivo con células PA6, suplementar el medio DA diferenciación neuronal con 100 ng / SHH ml y 100 ng / ml para FGF8a la semana restante. </li&gt; </ol> 9. Decapsulation de hCME encapsulado <ol><li> Aspirar las cápsulas en un tubo de centrífuga de 15 ml y permitir que se depositan en el fondo del tubo. A continuación, descartar el sobrenadante con cuidado. </li><li> Lávese las cápsulas con D-PBS dos veces. Que las cápsulas se depositan en el fondo del tubo a continuación, eliminar el sobrenadante. </li><li> Añadir 5 ml de solución decapsulating a las cápsulas. Mezclar la suspensión a fondo a través de aspiración antes de la incubación a temperatura ambiente durante 4-5 min. </li><li> Centrifugar las células descapsulados a 95 xg durante 3 minutos y descartar el sobrenadante. </li><li> Lavar el precipitado celular con D-PBS seguido por centrifugación a 95 xg durante 3 minutos. Repita. </li><li> Las células descapsulados puede ser aún más cultivadas como una monocapa o utilizados para el análisis de aguas abajo. </li></ol> 10. Los resultados representativos El diámetro de las microcápsulas de alginato es micras 400-500. El número de células dentro de la cápsula era ESTIMACIONESed calculando el número total de células dividido por el número total de cápsulas por ejecución. Por lo tanto, aproximadamente 5,0 x 10 4 células por cápsula fue estimada. De esto, suponemos que el número máximo de células de la cápsula puede contener es de aproximadamente 1,0 x 10 5. La viabilidad de hCME encapsulado es&gt; 80% (Figura 2) como se determina mediante utilizando diacetato de carboxifluoresceína succinimidly éster (CFDA) / yoduro de propidio (PI) de ensayo. Hemos optimizado las condiciones de encapsulación hCME disminuyendo la concentración de alginato de 2,2% al 1,1% y cambiando el baño de precipitación a partir de cloruro de bario al cloruro de calcio. A partir de estas condiciones, se demostró que sólo las células que fueron encapsulados con alginato de calcio 1,1% podría sobrevivir, proliferar y formar EBS in vitro 1. Para optimizar aún más la condición, los efectos de los medios de cultivo y RI, Y-27632 se investigaron. Los datos presentados en la Figura 2 y 3 demuestran que prevente RId disociación de la apoptosis inducida y mantenida la viabilidad celular y la formación promovido grupo 1,6. Por otra parte, la viabilidad de hESC encapsulado cultivadas en HFF-CM + RI fue significativamente más alta que otros grupos sin suplementación de RI, sin embargo esto no fue significativamente diferente al encapsulado hESC cultivadas en RI + SR. De manera similar, la proliferación de células usando el ensayo de BrdU aumentó de 25% a 75% como células individuales desarrolladas en grupos (Figura 3). La apoptosis por TUNEL ensayo revelaron que las células individuales en microcápsulas cultivadas en medio SR fueron apoptóticas (datos no mostrados), mientras que los grupos recuperados a partir de la HFF-CM eran mayormente negativo para TUNEL. Hasta cierto punto, HFF-CM suplementados con bFGF también promueve la supervivencia y proliferación de hESCs encapsulados en ausencia de Y-27632. Sin embargo, el tratamiento con Y-27632 antes (2 horas) y después de la encapsulación (durante 4 días) viabilidad notablemente mejorada, la proliferación y la formación de agrupaciones de hCME encapsuladoen microcápsulas 1,1% de alginato de calcio. Anteriormente hemos demostrado que hESC encapsulado puede ser exitosamente diferenciada para endodermo definitivo 1. Aquí, se analizó la aplicación de encapsulación de células como una plataforma 3D para diferenciar hESC encapsulado dentro de las neuronas DA. hESC, que se formó cuerpos embrioides (EB) en cápsulas fueron directas diferenciada y en decapsulation en las condiciones descritas mostraron una morfología neuronal progresiva (Figura 4) después de 2-3 días de cultivo con la viabilidad de más del 90%. La expresión de genes mostró una baja regulación de marcador pluripotente, Oct4, mientras que el marcador neuroprogenitoras, PAX6 y el marcador de DA neuronal, TH fueron reguladas hasta después de 7 días de la diferenciación (Figura 5). Tinción inmunofluorescente reveló que hCME diferenciada fueron PAX6-positivo (&gt; 80%) pero OCT4 negativa en el día 7. HESC diferenciada posteriores mostraron TH-positivos (&gt; 90%), las neuronas después de 21 días (Figura 5b). Western blot también mostróuna regulación de la expresión de TH a partir del día 14 (Figura 5 C), mientras que la expresión de PAX6 se había reducido regulado después del día 21. En comparación, las células cultivadas en medio de dos dimensiones (2D) bajo condiciones similares (por ejemplo, RI pre-tratamiento durante 2 horas y RI post-tratamiento durante 3 días antes de la diferenciación) mantiene un alto porcentaje de células PAX6-positivos (&gt; 80 %) durante todo el período de diferenciación y no eran tan eficiente en la diferenciación de las células TH-positivas (&lt;60%) como en el entorno 3D proporcionado por encapsulación (Figura 5A y C).

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	<li>Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+microcapsule+for+propagation+and+directed+differentiation+of+hESCs+to+definitive+endoderm.">Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm.</a> Biomaterials. 31, 505-514 (2010).</li><li>Dean, S. K., Yulyana, Y., Williams, G., Sidhu, K. S., Tuch, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+encapsulated+embryonic+stem+cells+after+transplantation.">Differentiation of encapsulated embryonic stem cells after transplantation.</a> Transplantation. 82, 1175-1184 (2006).</li><li>Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+benefit+of+human+embryonic+stem+cell+encapsulation+for+prolonged+feeder-free+maintenance.">The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance.</a> Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).</li><li>Dawson, E., Mapili, G., Erickson, K., Taqvi, S., Roy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomaterials+for+stem+cell+differentiation.">Biomaterials for stem cell differentiation.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 60, 215-228 (2008).</li><li>Orive, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+encapsulation:+promise+and+progress.">Cell encapsulation: promise and progress.</a> Nat. Med. 9, 104-107 (2003).</li><li>Watanabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).</li><li>Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled,+scalable+embryonic+stem+cell+differentiation+culture.">Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture.</a> Stem Cells. 22, 275-282 (2004).</li><li>Drukker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+expression+of+MHC+proteins+in+human+embryonic+stem+cells.">Characterization of the expression of MHC proteins in human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 99, 9864-9869 (2002).</li><li>Calafiore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+Technical+Procedures+for+Microencapsulation+of+Human+Islets+for+Graft+into+Nonimmunosuppressed+Patients+With+Type+1+Diabetes+Mellitus.">Standard Technical Procedures for Microencapsulation of Human Islets for Graft into Nonimmunosuppressed Patients With Type 1 Diabetes Mellitus.</a> Transplantation Proceedings. 38, 1156-1157 (2006).</li><li>Cho, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+and+large-scale+generation+of+functional+dopamine+neurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Highly efficient and large-scale generation of functional dopamine neurons from human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3392-3397 (2008).</li><li>Vazin, T., Chen, J., Lee, C. T., Amable, R., Freed, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+stromal-derived+inducing+activity+in+the+generation+of+dopaminergic+neurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Assessment of stromal-derived inducing activity in the generation of dopaminergic neurons from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 26, 1517-1525 (2008).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

Varios estudios con células madre embrionarias de ratón y hESC han demostrado los beneficios del sistema de cultivo en 3D en biomateriales e ingeniería de tejidos 2,3. Se utilizó microcápsulas de alginato de calcio como una plataforma adecuada en 3D para estudiar la propagación hESC y la diferenciación en comparación con el alginato de bario ya hESC mostró la viabilidad significativamente mayor cuando se encapsula en alginato de calcio que el alginato de bario. Este sistema de cultivo también permit...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Notas </td></tr><tr><td> Alginato (Pronova UP MVG) </td><td> NovoMatrix </td><td> 4200101 </td><td> glucurónico alto contenido en ácido ≥ 60%, la viscosidad&gt; 200 mPa s, y la endotoxina &lt;100 UE / g </td></tr><tr><td> Gelatina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1890-100G </td><td></td></tr><tr><td> 0,9% de NaCl </td><td> Baxter Healthcare </td><td> AHF7123 </td><td></td></tr><tr><td> Tipo J1 cordón del generador </td><td> Nisco Engineering Inc </td><td> SPA-0447 </td><td></td></tr><tr><td> Multi-Phaser jeringa bomba </td><td> La Nueva Era de la bomba Systems Inc </td><td> Modelo NE-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Ezi-Flow caudalímetro Médico </td><td> Gascón Sistemas</td><td> G0149 </td><td></td></tr><tr><td> Y-27632 </td><td> Merck </td><td> 688000 </td><td></td></tr><tr><td> Albúmina sérica humana </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4327-1G </td><td></td></tr><tr><td> Accutase </td><td> Millipore </td><td> SCR005 </td><td></td></tr><tr><td> 14G x 2 &quot;catéter intravenoso </td><td> Terumo </td><td> SR-OX1451C </td><td></td></tr><tr><td> Knockout DMEM- </td><td> Invitrogen </td><td> 10829-018 </td><td> Por medio de SR (basal) </td></tr><tr><td> GlutaMAX-I </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> Por medio de SR (2 mM) </td></tr><tr><td> Knockout Suero Reemplazo </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> Por medio de SR (20%) </td></tr><tr><td> La penicilina-estreptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15070063 </td><td> Por medio de SR (2,5 U / ml) </td&gt; </tr><tr><td> La insulina-transferrina-selenio (ITS) </td><td> Invitrogen </td><td> 41400045 </td><td> Por medio de SR (1x) </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td> Por medio de SR (0,1 mM) </td></tr><tr><td> MEM AANE Solución </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> Por medio de SR (5 mM) </td></tr><tr><td> Glasgow medio esencial mínimo </td><td> Invitrogen </td><td> 11710035 </td><td> Por medio de DA diferenciación neural (basal) </td></tr><tr><td> Knockout Suero Reemplazo </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> Por medio de la diferenciación neuronal DA (10%) </td></tr><tr><td> Piruvato de sodio </td><td> Invitrogen </td><td> 11360070 </td><td> Por medio de DA diferenciación neural (1 mM) </td></tr><tr><td> MEM AANE Solución </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> Por DA nmedio de diferenciación EURAL (0,1 mM) </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanol </td><td> Invitrogen </td><td> 21985-023 </td><td> Por medio de la diferenciación neuronal DA (0,1 mM) </td></tr><tr><td> Sonic hedgehog (SHH) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 1314-SH-025/CF </td><td> Para la diferenciación neuronal DA (100 ng / ml) </td></tr><tr><td> Factor de crecimiento fibroblástico 8a (FGF8a) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 4745-F8-050 </td><td> Para la diferenciación neuronal DA (100 ng / ml) </td></tr></tbody></table>

alginate microcapsule as a 3d platform for propagation and differentiation of human embryonic stem cells (hesc) to different lineages

Las células madre embrionarias humanas) se están convirtiendo en una fuente alternativa atractiva para la terapia de reemplazo de células, ya que se puede ampliar en cultivo indefinidamente y diferenciarse a cualquier tipo de células en el cuerpo. Varios tipos de biomateriales se han utilizado también en cultivos de células madre para proporcionar un microambiente imitando el nicho de células madre 1-3. Esto último es importante para la promoción de la célula a célula interacción, la proliferación celular, y la diferenciación en linajes específicos, así como la organización del tejido, proporcionando una tridimensional (3D) 4 ambiente, tales como la encapsulación. El principio de encapsulación de células implica atrapamiento de las células vivas dentro de los confines de membranas semi-permeables en cultivos 3D 2. Estas membranas de permitir el intercambio de nutrientes, oxígeno y estímulos a través de las membranas, mientras que los anticuerpos y las células inmunes del huésped que son más grandes que el tamaño de poro cápsula se excluyen 5. En este sentido, preenvió un acercamiento a la cultura y diferenciar hESC neuronas DA en un microambiente 3D con microcápsulas de alginato. Hemos modificado las condiciones de cultivo de 2 a mejorar la viabilidad de hESC encapsulado. Anteriormente hemos demostrado que la adición de p160-Rho-asociado espiral de la bobina quinasa (ROCK) inhibidor, Y-27632, y fibroblastos de fetos humanos-medio condicionado de reemplazo de suero (HFF-CM) a la plataforma 3D mejorado significativamente la viabilidad de hESC encapsulado en la que las células expresan genes marcadores definitivos endodermo 1. Hemos utilizado esta plataforma 3D para la propagación de la diferenciación hESC y eficiente de las neuronas DA. Análisis de proteínas y genes de expresión después de la última etapa de la diferenciación neuronal DA mostró un incremento en la expresión de la tirosina hidroxilasa (TH), un marcador de las neuronas DA,&gt; 100 veces después de 2 semanas. La hipótesis de que nuestra plataforma 3D con microcápsulas de alginato puede ser útil para estudiar la proliferación y la diferenciación dirigidade hESC a linajes diferentes. Este sistema 3D también permite la separación de células alimentadoras de hCME durante el proceso de diferenciación y también tiene potencial para inmune-aislamiento durante el trasplante en el futuro.

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Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

Hemos optimizado una técnica de microencapsulación como una plataforma efectiva en 3D para la propagación y la diferenciación de células madre embrionarias para endodermo y las neuronas dopaminérgicas (DA). También proporciona una oportunidad para inmune-aislamiento de células del huésped durante el trasplante. Esta plataforma se puede adaptar para otros tipos de células.

Microcápsulas de alginato como una plataforma 3D para la propagación y diferenciación de las células estaminales embrionarias humanas (CMEH) para los diferentes linajes

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

16.2K vistas.  The University of New South Wales. Hemos optimizado una técnica de microencapsulación como una plataforma efectiva en 3D para la propagación y la diferenciación de células madre embrionarias para endodermo y las neuronas dopaminérgicas (DA). También proporciona una oportunidad para inmune-aislamiento de células del huésped durante el trasplante. Esta plataforma se puede adaptar para otros tipos de células.

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Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

The field of human trophoblast research aids in understanding the complex environment established during placentation. Due to the nature of these studies, human in vivo experimentation is impossible. A combination of primary cultures, explant cultures and trophoblast cell lines1 support our understanding of invasion of the uterine wall2 and remodeling of uterine spiral arteries3,4 by extravillous trophoblast cells (EVTs), which is required for successful establishment of pregnancy. Despite the wealth of knowledge gleaned from such models, it is accepted that in vitro cell culture models using EVT-like cell lines display altered cellular properties when compared to their in vivo counterparts5,6. Cells cultured in the rotating cell culture system (RCCS) display morphological, phenotypic, and functional properties of EVT-like cell lines that more closely mimic differentiating in utero EVTs, with increased expression of genes mediating invasion (e.g. matrix metalloproteinases (MMPs)) and trophoblast differentiation7,8,9. The Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (kindly donated by Dr. Guy Whitley and Dr. Judith Cartwright) is an EVT-like cell line that was used for testing in the RCCS.
The design of the RCCS culture vessel is based on the principle that organs and tissues function in a three-dimensional (3-D) environment. Due to the dynamic culture conditions in the vessel, including conditions of physiologically relevant shear, cells grown in three dimensions form aggregates based on natural cellular affinities and differentiate into organotypic tissue-like assemblies10,11,12 . The maintenance of a fluid orbit provides a low-shear, low-turbulence environment similar to conditions found in vivo. Sedimentation of the cultured cells is countered by adjusting the rotation speed of the RCCS to ensure a constant free-fall of cells. Gas exchange occurs through a permeable hydrophobic membrane located on the back of the bioreactor. Like their parental tissue in vivo, RCCS-grown cells are able to respond to chemical and molecular gradients in three dimensions (i.e. at their apical, basal, and lateral surfaces) because they are cultured on the surface of porous microcarrier beads. When grown as two-dimensional monolayers on impermeable surfaces like plastic, cells are deprived of this important communication at their basal surface. Consequently, the spatial constraints imposed by the environment profoundly affect how cells sense and decode signals from the surrounding microenvironment, thus implying an important role for the 3-D milieu13.
We have used the RCCS to engineer biologically meaningful 3-D models of various human epithelial tissues7,14,15,16. Indeed, many previous reports have demonstrated that cells cultured in the RCCS can assume physiologically relevant phenotypes that have not been possible with other models10,17-21. In summary, culture in the RCCS represents an easy, reproducible, high-throughput platform that provides large numbers of differentiated cells that are amenable to a variety of experimental manipulations. 
In the following protocol, using EVTs as an example, we clearly describe the steps required to three-dimensionally culture adherent cells in the RCCS.

Traditional, two dimensional cell culture techniques often result in altered characteristics with respect to differentiation markers, cytokines and growth factors. Three-dimensional cell culture in the rotating cell culture system (RCCS) reestablishes expression of many of these factors as shown here with an extravillous trophoblast cell line.

Rotación de sistemas de cultivos celulares de cultivo de células humanas: células humanas trofoblásticas como un modelo de

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Investigación

Bioingeniería

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

Desarrollo, la expansión y<em&gt; En vivo</em&gt; Monitoreo de las células NK humanas a partir de células madre embrionarias humanas (hESCs) y y células madre pluripotentes inducidas (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

Exprimir la célula como un robusto, Microfluidic intracelular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

Ordenando las células individuales y solo los embriones en 3D Confinamiento: un nuevo dispositivo para la selección de alto contenido

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Layered Alginate Constructs: A Platform for Co-culture of Heterogeneous Cell Populations

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential mechanosensing characteristics. Engineering and analysis of these tissue types remain a challenge. Layered hydrogel constructs provide an opportunity for investigating the interactions among multiple cell populations within single constructs. Alginate hydrogels are both biocompatible and allow for easy isolation of cells after experimentation. Here, we describe a method for the development of small sized dual layered alginate hydrogel discs. This process maintains high cell viability of human mesenchymal stem cells during the formation process and these layered discs can withstand unconfined cyclic compression, commonly used for stimulation of hMSCs undergoing chondrogenesis. These layered constructs can potentially be scaled up to include additional levels, and also be used to segregate cell populations initially after layering. This dual layer alginate hydrogel culture platform can be used for many different applications including engineering and analysis of cells of load bearing tissues and co-cultures of other cell types.

Engineering and analysis of load bearing tissues with heterogeneous cell populations are still a challenge. Here, we describe a method for creating bi-layered alginate hydrogel discs as a platform for co-culture of diverse cell populations within one construct.

Las construcciones en capas de alginato: Una plataforma para el co-cultivo de poblaciones celulares heterogéneas

Many load bearing tissues possess structurally and functionally distinct regions, typically accompanied by different cell phenotypes with differential ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning y Montaje de Microvasos 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Medición del potencial de acción óptica unicelular en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, unlike more differentiated progenitors, and enter the cell cycle rapidly after chemotherapy or irradiation to treat bone marrow injury or in vitro culture. By mimicking the bone marrow microenvironment in the presence of abundant fatty acids, cholesterol, low concentration of cytokines, and hypoxia, human HSCs maintain quiescence in vitro. Here, a detailed protocol for maintaining functional HSCs in the quiescent state in vitro is described. This method will enable studies of the behavior of human HSCs under physiological conditions.

This protocol enables the maintenance of quiescent human hematopoietic stem cells in vitro by mimicking the bone marrow microenvironment using abundant fatty acids, cholesterol, lower concentrations of cytokines, and hypoxia.

Un método de cultivo para mantener las células madre hematopoyéticas humanas quiescentes

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...

Real-Time Intravital Multiphoton Microscopy to Visualize Focused Ultrasound and Microbubble Treatments to Increase Blood-Brain Barrier Permeability

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles has emerged as an effective method to transiently and locally increase the permeability of the BBB, facilitating para- and transcellular transport of drugs across the BBB. Imaging the vasculature during ultrasound-microbubble treatment will provide valuable and novel insights on the mechanisms and dynamics of ultrasound-microbubble treatments in the brain.
Here, we present an experimental procedure for intravital multiphoton microscopy using a cranial window aligned with a ring transducer and a 20x objective lens. This set-up enables high spatial and temporal resolution imaging of the brain during ultrasound-microbubble treatments. Optical access to the brain is obtained via an open-skull cranial window. Briefly, a 3-4 mm diameter piece of the skull is removed, and the exposed area of the brain is sealed with a glass coverslip. A 0.82 MHz ring transducer, which is attached to a second glass coverslip, is mounted on top. Agarose (1% w/v) is used between the coverslip of the transducer and the coverslip covering the cranial window to prevent air bubbles, which impede ultrasound propagation. When sterile surgery procedures and anti-inflammatory measures are taken, ultrasound-microbubble treatments and imaging sessions can be performed repeatedly over several weeks. Fluorescent dextran conjugates are injected intravenously to visualize the vasculature and quantify ultrasound-microbubble induced effects (e.g., leakage kinetics, vascular changes). This paper describes the cranial window placement, ring transducer placement, imaging procedure, common troubleshooting steps, as well as advantages and limitations of the method.

This protocol describes the surgical and technical procedures that enable real-time in vivo multiphoton fluorescence imaging of the rodent brain during focused ultrasound and microbubble treatments to increase blood-brain barrier permeability.

Microscopía multifotónica intravital en tiempo real para visualizar ultrasonido enfocado y tratamientos de microburbujas para aumentar la permeabilidad de la barrera hematoencefálica

The blood-brain barrier (BBB) is a key challenge for the successful delivery of drugs to the brain. Ultrasound exposure in the presence of microbubbles ...

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. These include the limited number of cadaveric pancreas donors and the long-term use of immunosuppressants. Mesenchymal stem cells (MSCs) have been considered to be a potential candidate as an alternative source of islet-like cell generation. Our previous reports have successfully illustrated the establishment of induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) to insulin-producing cells (IPCs). However, the induction efficiency varied greatly. In this paper, we demonstrate the comparison of hDPSCs pancreatic induction efficiency via integrative (microenvironmental and genetic manipulation) and non-integrative (microenvironmental manipulation) induction protocols for delivering hDPSC-derived IPCs (hDPSC-IPCs). The results suggest distinct induction efficiency for both the induction approaches in terms of 3-dimensional colony structure, yield, pancreatic mRNA markers, and functional property upon multi-dosage glucose challenge. These findings will support the future establishment of a clinically applicable IPCs and pancreatic lineage production platform.

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

This protocol presents a comparison between two different induction protocols for differentiating human dental pulp stem cells (hDPSCs) toward pancreatic lineages in vitro: the integrative protocol and the non-integrative protocol. The integrative protocol generates more insulin producing cells (IPCs).

In vitro Inducción de células madre de pulpa dental humana hacia linajes pancreáticos

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...