Las células madre embrionarias humanas se pueden inducir a diferenciarse en células progenitoras neuronales y posteriormente en astrocito de neurona y oligodendrocitos. Sin embargo, el método de cultivo tipo para las células madre embrionarias humanas y su diferenciación en células progenitoras neuronales son un sistema de co-cultivo in vivo muy ineficiente y abierto Aquí presentamos un sistema de cultivo mejorado y robusto que es fácilmente escalable utilizando el cultivo de tipo de célula única de alta densidad con células madre embrionarias humanas. El cultivo de tipo celular único de células madre embrionarias humanas proporciona un sistema rápido y eficiente para estudiar los mecanismos moleculares que regulan la diferenciación de varios pasos a lo largo de diversos y distintos linajes diferenciados, incluidas las células progenitoras neuronales y su posterior diferenciación en linajes neuronales adicionales.
Comience preparando placas recubiertas de matriz de membrana de sótano calificadas con células madre embrionarias humanas. Descongelar lentamente la solución de matriz de membrana del sótano a cuatro grados centígrados durante al menos dos o tres horas o durante la noche. Cuando se descongele, diluya la matriz en frío DMEM/F-12 a 2% mezcle bien, y cubra cada pozo de una placa de seis pozos con un mililitro de la solución diluida.
Incubar las placas recubiertas a temperatura ambiente durante al menos tres horas o a cuatro grados centígrados durante la noche. Para pasar los cultivos libres de alimentadores de células madre embrionarias humanas tipo H9 de colonia cultivadas en la matriz de membrana del sótano, aspirar el medio de los pozos y lavar una vez con un mililitro de DPBS. Añadir un mililitro de solución dispase a cada pozo e incubar la placa a 37 grados centígrados durante 20 minutos.
Retire el Disase y lave suavemente las células una vez con dos mililitros de DMEM/F-12. Después del lavado, retire el medio y agregue dos mililitros de DMEM/F-12 a cada pozo. Separe suavemente las colonias pipeteando hacia arriba y hacia abajo y transfiéralas a un tubo de 15 mililitros.
Centrifugar el tubo a 370 g durante dos minutos. Aspirar el medio. Luego disocia los gránulos celulares en células individuales añadiendo dos mililitros de solución de desprendimiento celular e incubando a 37 grados Celsius durante 10 minutos.
Repita la centrifugación y retire la solución de desprendimiento. Resuspender las células en el medio ESC humano mTeSR-1 pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Para adaptar las células madre embrionarias humanas de tipo colonia a un cultivo de tipo de célula única, placa aproximadamente 1,5 a dos millones de células en cada pozo de la placa recubierta de matriz de membrana sótano en dos mililitros de mTeSR-1 que contiene 10 inhibidores de ROCK micromolares.
Después de 24 horas, sustituya el medio por mTeSR-1 fresco sin inhibidor de ROCK. Permita que las células crezcan como un tipo de celda única durante tres días cambiando el medio diario. Al cuarto día, disociar las células en la solución de desprendimiento y volver a plancharlas como se describió anteriormente.
Después de resuspender e incubar las células de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, transfiera los cuerpos embrionarios pequeños a un tubo de 15 mililitros, déjelas asentarse en el fondo y retire suavemente el medio con una pipeta. Transfiéralos al medio EB y deja que se expandan en platos de baja fijación durante siete días. Para inducir la diferenciación de células progenitoras neuronales o NPC, disocia las células madre embrionarias humanas de tipo célula única con un mililitro de solución de desprendimiento e incubarlas a 37 grados centígrados durante 10 minutos.
Centrifugar las células durante dos minutos a 370 veces g. Retire el sobrenadante de la solución de desprendimiento. Luego resuspend las células en DMEM/F-12.
Placar las células en una matriz de membrana sótano recubierta placa de seis pozos a una densidad de dos veces 10 a la quinta célula por pozo en dos mililitros de mTeSR-1 con 10 inhibidores de ROCK micromolar. Después de 24 horas, reemplace el medio de cultivo con medio de inducción neuronal complementado con un micromolar Dorsomorfina y cinco micromolares SB431542. Cambie el medio cada dos días durante los primeros cuatro días de inducción neuronal, luego todos los días hasta que se alcance la confluencia en el día siete.
Después de siete días de inducción neuronal, disocia las células añadiendo un mililitro de solución de desprendimiento e incubando durante 10 minutos a 37 grados centígrados. Centrifugar las células a 370 g y quitar la solución de desprendimiento sobrenadante. Agregue un mililitro de medio de expansión NPC y pipetee suavemente las células hacia arriba y hacia abajo para resuspend.
A continuación, la placa de una por 10 a las quintas células por pozo en dos mililitros de medio de expansión NPC en la matriz de membrana del sótano recubierto de placas de seis pozos. Pasar las células según sea necesario cuando los cultivos alcancen el 90% de confluencia añadiendo 10 inhibidores de ROCK micromolares durante los primeros tres a cuatro pasajes. Cambia el medio cada dos días durante la expansión.
Para preparar las placas recubiertas con laminina oLP, diluir la solución de stock de OLP en PBS o agua a una concentración final de 10 microgramos por mililitro, mezclar bien, luego cubrir cada pozo de una placa de seis pozos con un mililitro de la solución. Incubar las placas durante al menos dos horas a 37 grados centígrados o durante la noche a cuatro grados centígrados. A continuación, lavar cada pozo con PBS e inmediatamente después de cubrir cada pozo con un mililitro de solución de laminina preparada de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.
Mantenga las placas a cuatro grados centígrados durante hasta una semana. Para diferenciar los PNJ en neuronas dopaminérgicas, plate las células en platos recubiertos con laminina OLP en medio de expansión NPC a una densidad de aproximadamente 50%Después de 24 horas, cambie el medio a DA1 y cambie el medio cada dos días a partir de entonces. Para pasar cultivos cuando alcanzan la confluencia, disociar las células con un mililitro de solución de desprendimiento e incubarlas durante 10 minutos a 37 grados centígrados.
A continuación, centrifugarlos a 370 veces g y quitar la solución de desprendimiento sobrenadante. Resuspender las células en un mililitro de medio DA1 y placa una veces 10 a las quintas células en dos mililitros de medio en las placas de seis pozos recubiertas con laminina oLP. Para diferenciar los PNJ en astrocitos, plate las células en las placas de laminin de la OLP y el medio de expansión NPC a una densidad del 50% cambie el medio a medio de astrocitos después de 24 horas, y pase las células como se describió anteriormente.
Cuando las células madre embrionarias humanas de tipo colonia se adaptaron al cultivo de tipo de célula única, se encontró que las células eran capaces de mantenerse a alta densidad, luego fácil y eficientemente subculturada cuando se alcanzó la confluencia. Estas células retuvieron las características típicas del ciclo celular típico de las células madre embrionarias humanas de tipo colonia, como una fase G1 corta y una alta proporción de células en la fase S. El análisis cuantitativo de PCR también confirmó que expresan marcadores ESC a niveles comparables a los de las células de tipo colonia.
Además, se demostró que las células madre embrionarias humanas de una sola célula eran capaces de formar cuerpos embrionarios que contenían células de las tres capas germinales: endodermo, mesodermo y ectodermo. Luego se demostró que las células madre embrionarias humanas de tipo de célula única se diferenciaban eficientemente en PNJ, como lo indica la pérdida de morfología típica de células madre embrionarias humanas y la aparición de morfología de NPC. La diferenciación se apoyó en el aumento de la expresión de los marcadores NPC de firma y se confirmó mediante la inmunosumanidad y el análisis FACS.
El mismo análisis también mostró que más del 90% de las células se tiñen positivas para las proteínas SOX1, PAX6 y NCAM. Además, los PNJ derivados fueron capaces de diferenciarse en neuronas dopaminérgicas y astrocitos como lo indica la aparición de morfologías características y la expresión de marcadores específicos del linaje. Al intentar este procedimiento, es esencial placar las células madre embrionarias humanas a alta densidad con el fin de mantener un cultivo de células madre embrionarias humanas sanas e indiferenciadas.
Este protocolo proporciona una plataforma para la producción simple, robusta y escalable de progenitor y células diferenciadas que serán escalables para el estudio básico, la pantalla de fármacos y la aplicación en medicina neurodegenerativa.
