Agradecemos al Dr. U. Ashery por el don de cDNA NPY-mRFP. Agradecemos a los Dres. MJ Kofron, L. Mittleman, M. Shaharbani y Y. Zilberstein por su valiosa asistencia con microscopía y análisis de imagen. También agradecemos al Dr. Joseph Orly para la lectura crítica de este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación de Ciencias de Israel, fundado por la Academia Israelí de Ciencias (1139-1112 a RS-E.).

1. Preparación de RBL Cell Culture Media <ol><li> Mezclar 500 ml de medio de Eagle modificado bajo nivel de glucosa de Dulbecco (DMEM) con 56 ml de suero fetal bovino (esto hace que el 10% de FBS), y luego añadir 5,5 ml de penicilina estreptomicina (esto hace ~ 1% de plagas). </li><li> Filtra los medios de comunicación mediante el uso de 500-1.000 ml Botella-Top Filtros de Vacío con 0,22 m de tamaño de poro y se almacena a 4 ° C. </li></ol> 2. Cultura de células RBL <ol><li> Se cultivan las células RBL en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 a 37 ° C, ya sea en placas o frascos. Células RBL que crecen en placas de 10 cm deben ser complementados con 10 ml de medio y forman monocapa confluente de ~ 10 7 células / placa. </li><li> Cuando la capa de células se está acercando a la confluencia, replate el cultivo a una densidad más baja. <ol><li> Retire el medio de cultivo de la placa / matraz utilizando una pipeta pasteur estéril conectado al vacío. </li><li> Enjuague la monocapa celular con precalentado (37° C) 0,25% de tripsina / EDTA que cubre toda la monocapa (el volumen depende del tamaño de la placa de cultivo / matraz; 2 ml para 10 cm de placa). Esto separar las células. </li><li> Alternativamente, enjuague la monocapa celular con tampón fosfato salino (PBS), eliminar el PBS y añadir precalentado (37 ° C) de tripsina / EDTA. Este paso se separa de las células más rápido. </li><li> Colocar la placa / matraz en una incubadora a 37 ° C (no más de 10 min). </li><li> Inspeccione las células bajo el microscopio óptico para comprobar si se han desprendido. Si las células no se separan después de 10 minutos, toque suavemente sobre la placa / matraz. </li><li> Añadir medio a la placa de cultivo / matraz para suspender las células (el volumen del medio debe ser al menos 2 veces mayor que el volumen de la solución de tripsina). </li><li> Sedimentar las células por centrifugación durante 3 min a 200 g a 25 ° C. </li><li> Resuspender las células en medio. Diluir las células por 1:10 y sembrar en una nueva placa de cultivo. Se incuban las células durante 48 a 72 horas, hasta que REACh aproximadamente 90% de confluencia. </li><li> Repita el mismo procedimiento (sección 2.2.1-2.2.8) durante un máximo de 3 meses (30 pases). </li></ol></li></ol> 3. Preparación de transfección de medios. <ol><li> Preparar una solución de K-Pipes pH 7, solución 1 mM de Ca 2+ de etilo y solución de Mg 2 + acetato de 100 mM 100 mM. </li><li> Diluir la solución 100 mM de K-Pipes pH 7 en 20 mM utilizando medios DMEM, añadir la solución de 1 mM de Ca 2+ de etilo a una concentración final de 10 mM y la solución de Mg 2+ acetato 100 mM a una concentración final de 2 mM. </li><li> Pesar glutamato de potasio y añadir a la solución a una concentración final de 128 mM, mezclar bien y mantener a 4 ° C hasta su uso. Mantenga las soluciones restantes (es decir., K-Tubos, Ca 2+ acetato, Mg 2 + acetato) a -20 ° C. </li></ol> 4. La transfección de células RBL <ol><li> Retire el medio de cultivo de la placa / matraz utilizando unapipeta Pasteur estéril conectado al vacío. </li><li> Enjuague la monocapa de células con precalentado (37 ° C) de tripsina / EDTA que debe cubrir toda la monocapa. Colocar la placa / matraz en una incubadora a 37 ° C (no más de 10 min). Compruebe si las células se han separado utilizando el microscopio óptico. </li><li> Añadir medio a la placa de cultivo / matraz para suspender las células (el volumen de los medios debe ser de al menos 2 más grande más que el volumen de la solución de tripsina). </li><li> Contar el número de células usando un hemocitómetro. </li><li> Pellet 1,5 × 10 7 células por centrifugación durante 3 min a 200 xg a 25 ° C. Descartar el sobrenadante y añadir 280 l de medio de transfección. Transfiera la mezcla de reacción a 4 mm cubeta. </li><li> Añadir 20 g de plásmido NPY-mRFP y, o bien 30 g de control de plásmido vacío o un plásmido probado. El volumen final de la mezcla de reacción debe ser de 300 l. </li><li> Colocar inmediatamente en hielo durante 10 min. Limpiar la cubeta del agua residual y proceed a electroporación a 300 V durante 9 mseg. </li><li> Para las mediciones de la exocitosis, replate las células inmediatamente en 24 platos de cultivo de tejidos que contienen 300 l de medio. Añadir 8 l de la mezcla de reacción (4 × 10 5 células) a cada pocillo. Añadir células 4 × 10 5 no transfectadas para pozos adicionales para el control. Prepare suficientes pocillos para tener al menos pocillos duplicados para cada tratamiento para cada transfección. </li><li> Para microscopía lapso de tiempo, replate las células inmediatamente en un sistema cubreobjetos borosilicato cámara de 8 pocillos que contiene 80 l medio. Añadir 1,5 l de la mezcla de reacción (7,5 × 10 4 células) a cada cámara. (Trate de evitar el uso de las cámaras en el borde del cubreobjetos, las cámaras en el centro del cubreobjetos son más fáciles de imagen). NOTA: Es importante destacar que no todas las células de respuesta a un factor desencadenante y de vez en cuando la microscopía de lapso de tiempo se suprime debido a la pérdida de foco y de la deriva de la Borosi cámara de 8 pocillossistema cubreobjetos licate. Por lo tanto, preparar al menos 8 cámaras para cada tratamiento para cada transfección. </li><li> Para sensibilizar a las células para la activación mediada por Fc RI, añadir 1 g / ml de DNP ratón monoclonal IgE específica frente a los medios de comunicación (incubar las células con IgE durante al menos 2 h). </li><li> Después de 18-24 hr utilizar un microscopio de fluorescencia para confirmar que las células expresan los plásmidos. Las longitudes de onda de excitación y emisión de fluorescencia mRFP son:? Ex 584, λEm 607 nm. NPY-mRFP debe aparecer en estructuras vesiculares que corresponden a los SGS. Si el segundo gen de interés se fusiona con una etiqueta fluorescente utilizar un microscopio de fluorescencia para confirmar la co-expresión de ambos plásmidos en las mismas células. Por ejemplo, si el gen probado está fusionado a GFP, Las longitudes de onda de excitación y emisión de fluorescencia de GFP son:? Ex 488, λEm 507 nm. La proteína GFP etiquetado deberá figurar en las mismas células que expresan NPY-mRFP. </li><li> Para las mediciones de exocitosis proceder to el paso 5 y para microscopía lapso de tiempo, vaya al paso 6. </li></ol> 5. Medición de NPY-mRFP exocitosis <ol><li> Preparación de tampón Tyrode: <ol><li> Preparar una solución de 54 mM KCl, 20 mM MgCl 2, NaCl 2,74 y 8 mM NaH 2 PO 4 en DDW. Mezclar bien y almacenar a 4 ° C. Este paso es para la preparación de 20x tampón Tyrode. </li><li> Preparar una solución de Hepes 20 mM pH 7, 1,8 mM CaCl 2, 1 mg / ml de BSA, glucosa 5,6 mM y 1 a 20 dilución de Tyrode 20x en DDW y mezclar bien. Este paso es para la preparación de tampón 1x Tyrode. </li><li> Alícuota de la memoria intermedia 1x Tyrode y se almacena a -20 ° C. Evite los ciclos de congelación y descongelación. </li></ol></li><li> Retire el medio de cultivo de la placa de 24 pocillos y lavar 3 veces con tampón de Tyrode. Preparar las células no estimuladas mediante la adición de tampón de Tyrode 200 l a los pocillos de control. </li><li> Preparar 10 l / pocillo de 20X concentró reactivo activador [(por ejemplo, 1.000 ng / ml de DNP-BSA o DNP-HSA (Ag), 200 mM Ca 2 + ionóforo (por ejemplo, A23187), y una combinación de 20 mM Ca 2 + ionóforo y 1000 nM 12-O- tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA)]. Si los reactivos se almacenan en DMSO, diluir los reactivos en la concentración 20x en tampón de Tyrode que contiene 1% de DMSO. Incubar a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Retire los sobrenadantes de cada pocillo con cuidado a una placa de 96 pocillos, colocar en hielo y evitar la luz. (Los sobrenadantes contienen el péptido quimérico NPY-mRFP que se libera de las células). </li><li> Añadir 200 l de tampón de Tyrode que contenía 0,5% de Triton X-100 a cada pocillo e incubar a 37 ° C durante 10 min. (Este paso es importante para la preparación de los lisados ​​celulares que contienen el restante de NPY-mRFP que no se libera de las células). Recoge los lisados ​​celulares y transferir a una placa de 96 pocillos, colocar en hielo y evitar la luz. </li><li> Medir la fluorescencia de los sobrenadantes de las células y lisados ​​de células utilizando un FLUORESCcia lector de placas, utilizando un 590-, 20 nm de ancho de banda de excitación filtro y 635-, 35 nm filtro de emisión de ancho de banda. </li><li> Calcular el porcentaje de NPY-mRFP lanzado: NOTA: La medida lector de fluorescencia unidades arbitrarias de fluorescencia (AFU). AFU valores dependen de la máquina y su sensibilidad y la eficiencia de transfección. <ol><li> Establezca la autofluorescencia de las células RBL no transfectadas como en blanco. Divida la AFU de cada sobrenadante a la fluorescencia total (AFU de los sobrenadantes + AFU del lisado correspondiente) y se multiplica por 100. </li></ol></li></ol> 6. Time-lapse microscopía de exocitosis <ol><li> Semillas 7,5 × 10 4 de la células / cámara transfectadas en un sistema de cubreobjetos de borosilicato cámara de 8 pocillos. Después de 18 a 24 horas, retire el medio de cultivo de las cámaras y lavar 3 veces con tampón de Tyrode </li><li> Añadir 72 l de tampón de Tyrode a cada cámara. Diluir los reactivos activantes en tampón de Tyrode a 10 veces la concentración. </li> &lt;li&gt; usar un microscopio de fluorescencia confocal equipado con una cámara calentada (37 ° C) y CO 2 controlador (4,8%) y un objetivo de 40X o 63X. Encienda los sistemas de microscopio: lámpara de mercurio, el ordenador y los láseres. Asegúrese de que la cámara climatizada está a la temperatura adecuada antes de iniciar el experimento. </li><li> Coloque la cámara en la cámara climatizada y asegúrese de que la cámara esté correctamente instalado y estable. </li><li> Encienda la luz de fluorescencia de acuerdo con el fluoróforo relevante y visualizar las células transfectadas. Apague la fluorescencia una vez una célula de interés está en el campo con el fin de minimizar la decoloración y la citotoxicidad. Es importante que este campo contendrá alrededor de 2-3 células transfectadas. Las células transfectadas deben estar bien distribuidas, pero no se toquen entre sí. </li><li> Ajustar la potencia del láser (dependiendo del microscopio) para minimizar el ruido y la sobresaturación, así como la toxicidad, y ajustar la ganancia y el desplazamiento para modificar la relación de señal a ruido. Escaneado rápido en oder reducir al mínimo la duración de la exposición láser (promedio 2). </li><li> Ajuste el tamaño del agujero de alfiler a un máximo, esto permite la disminución de la potencia del láser y de mantener las imágenes enfocadas por un largo período de tiempo. Si lo desea, establezca los parámetros para la pila de Z a reconstruir la imagen en tres dimensiones, ajustar el tamaño del agujero de alfiler a 1 unidad aireado (UA) que le da la mejor relación señal-ruido y adquirir sucesiva exploración de rebanadas óptica confocal de dos dimensiones en el -axes z con rodajas ópticos ≤0.7 micras. </li><li> Ajuste el intervalo de tiempo entre cada adquisición de 15 a 30 segundos y la duración de la adquisición de un total de 15 minutos y comenzar a adquirir las imágenes. Después de 5 minutos de la adquisición de una pausa en la serie de tiempo. Añadir 8 l de 10x el gatillo y continuar la adquisición de inmediato. </li><li> Guardar las imágenes, realizar deconvolución utilizando un software de deconvolución y reconstruir las pilas a imágenes en tres dimensiones y con una película utilizando el software Imaris. </li></ol><ol><li> Importar los datos de las imágenes de series de tiempo deconvoluted que se obtuvieron por el microscopio de fluorescencia confocal de software Imaris. Este software lee más de 40 archivos de microscopía. Si el software no puede leer los archivos; convertir los archivos en archivos tif y de importación. </li><li> Para agregar puntos de tiempo hasta el final de un conjunto de datos abierto pulse editar -&gt; Añadir puntos de tiempo e importar el nuevo conjunto de datos. </li><li> Crear superficie del canal mRFP usando opción del asistente superficie. Elija el algoritmo predeterminado. Elija el canal de NPY-mRFP. Marque la opción de suavizado para reducir el ruido. Para evitar la pérdida de pequeños detalles reducen el nivel de detalle área de 0,05 m. </li><li> Ajuste el umbral de intensidad. Se mostrará Nueva superficie gris. Ir a &quot;Configuración&quot; y cambiar el estilo de &quot;punto central&quot; de &quot;Surface&quot;. </li><li> Ir a la ficha estadística en las propiedades del objeto seleccionado, seleccione la ficha detallada y la suc valor específicoh como la intensidad de fluorescencia, volumen, etc. </li><li> Revise los datos y confirme que los valores son compatibles con las imágenes. Por ejemplo, dos o más gránulos adyacentes pueden ser medidos como un gránulo más grande. Para cuantificar el tamaño medio de gránulo dividir el tamaño de los gránulos fusionados al número real de gránulos. </li><li> Exportar los conjuntos de datos que desee en los archivos de Excel y analizar los datos. </li></ol> F

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The authors have no financial conflicts of interest.

Se describe una estrategia innovadora que combina la cuantificación de MCs exocitosis y cuatro (x, y, z, t) cuantificaciones dimensión por imágenes en tres dimensiones de tiempo transcurrido de las Comisiones de Estudio en las células vivas utilizando un gen reportero de exocitosis. Esta técnica permite la detección de las familias de proteínas por su impacto en la función MC como SG de monitoreo a partir tan pronto como su salida del Golgi a través de su maduración, la adquisición de competencias exocitosis ...

Mastocitos (MC) son células inmunes que son mejor conocidos por su participación en las reacciones alérgicas e inflamatorias tales como la artritis, el asma, la esofagitis eosinofílica, dermatitis crónica y shock anafiláctico 1,2, así como otras patologías como la enfermedad de las arterias coronarias y 3,5 cáncer de 3,4. Además, MCs juegan un papel importante en la inmunidad innata y adaptativa, tanto en la defensa del huésped contra las bacterias y los parásitos y por la supresión de las respuestas inmunes, por ejemplo la inducción de tolerancia aloinjerto 5,6. MCs se originan en la médula ósea, el desarrollo de CD34 + / CD117 + células progenitoras pluripotentes 7. La médula ósea comprometida progenitores MC se liberan en el torrente sanguíneo y migran hacia los tejidos periféricos de localización predominantemente dentro de los tejidos conectivos y las superficies epiteliales 8. La maduración y la diferenciación terminal se consiguen finalmente bajo la influencia of citoquinas en el 8,9 entorno circundante. MCs pueden ser activados por un alergeno (antígeno, Ag), cuyo encuentro dado lugar a la generación de inmunoglobulina E (IgE) de tipo anticuerpos. La unión de tales IgE a los receptores Fc RI de la MC, seguido de la reticulación de IgE unido a las células en la re-exposición al mismo Ag, resulta en la agregación de Fc RI y la iniciación de una cascada de señalización que culmina en la desgranulación de células [revisado en 10,11] . MCs también se activan, de forma independiente de IgE, por neuropéptidos 5,12, 13 toxinas, bacterias y antígenos virales 14,15, un número de péptidos cargados positivamente que se hace referencia colectivamente como secretagogos básicas, las células inmunes y citoquinas 5,13,12,16 , 17. MCs también se activan por muchos de sus propios mediadores liberados, que amplifican aún más la respuesta inflamatoria. MCs están llenas de gránulos de secreción (SGS) que contienen inmunomediadores reguladoras, incluyendo aminas vasoactivas, tales como la histamina y la serotonina (en roedores), proteoglicanos, proteasas, tales como la quimasa y triptasa, factor de crecimiento endotelial vascular y varias citocinas y quimiocinas 8,9. Estos mediadores son &quot;listo para funcionar&quot; y una vez MCs son activados por un estímulo apropiado, estos mediadores se liberan de las células mediante exocitosis regulada (degranulación) en cuestión de segundos a minutos 18,19. Este evento inicial es seguido por la síntesis de novo y la liberación de una gran variedad de sustancias biológicamente potentes, incluyendo metabolitos del ácido araquidónico, múltiples citocinas y quimiocinas 20,21,22. La liberación de productos de nueva síntesis se produce independientemente de la liberación de SG. Colectivamente, estos mediadores inician temprana y de fase tardía respuestas inflamatorias y alérgicas. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos de contabilidad para la activación y degranulación MC son tanto de imp teórica y clínicaortance. La dificultad para manipular genéticamente MCs primarias y cultivadas ha obstaculizado los intentos de dilucidar los mecanismos subyacentes MC degranulación, que quedó mal resueltos. Para superar este problema hemos desarrollado un ensayo basado reportero cotransfectando la línea de mastocitos de la mucosa, rata leucemia basófila (RBL) -2H3 (en adelante denominado como RBL) o derivadas de médula ósea MCs (BMMCs) 30 con un gen de interés y El neuropéptido Y (NPY) fusionado con RFP monomérica (mRFP), como reportero SG. NPY fue demostrado previamente para recapitular el comportamiento de los marcadores SG endógenos en otros sistemas. Además, debido a mRFP fluorescencia es insensible al pH, la expresión de NPY-mRFP permite la visualización de los SGs ácidas así como la evaluación cuantitativa de la exocitosis mediante el uso de placas de 96 pocillos y un lector de placas de fluorescencia. Hemos demostrado que el NPY-mRFP se entrega a las Comisiones de ácidos de las células RBL y BMMCs y se libera de las célulasde una manera regulada junto con la carga SG endógena (es decir, β-hexosaminidasa y serotonina) 30, 32. Este protocolo proporciona una metodología basada en la proyección de imagen de alta resolución que permite que los genes de detección de interés para su fenotípica y el impacto funcional de las características de la SG y la degranulación de células RBL 32. Específicamente, este protocolo permite el seguimiento en tiempo real de MC SGS y la cuantificación de su área o tamaño del volumen, su número, la cinética de montaje, su movimiento a lo largo del citoesqueleto de la célula y su fusión definitiva con la membrana plasmática en condiciones diferentes. Por ejemplo, la sensibilización de las células con DNP-específico IgE y la activación de las células con un Ag multivalente (DNP conjugado de albúmina de suero) bajo diferentes perturbaciones (es decir, desmontables de genes de interés, sobre la expresión de genes WT o mutantes, o las manipulaciones farmacológicas) y en comparación con las células control.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="844">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:156px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:421px;">DMEM</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6046-500ML</td>
			<td style="width:156px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:128px;">GE health care Life sciences</td>
			<td>SH30071.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:128px;">Life technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Cellulose acetate membrane, pore size 0.22&#160;&#956;m</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS430769-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Corning tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Trypsin/EDTA Solution (TE)</td>
			<td style="width:128px;">Life technologies</td>
			<td>R001100</td>
			<td style="width:156px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">PIPES dipotassium salt</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">108321-27-3&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Calcium acetate hydrate</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>114460-21-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Magnesium acetate tetrahydrate</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">M5661&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate)</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4 mm electroporation cuvettes</td>
			<td style="width:128px;">cell projects</td>
			<td style="width:139px;">EP-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER &#38; CAPACITANCE</td>
			<td style="width:128px;">Bio rad</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chambered coverglass</td>
			<td style="width:128px;">Thermo scientific</td>
			<td align="right" style="width:139px;">155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">24 well, flat bottom</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Corning 96 well plates</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS3367 or CLS390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well plate fluorescence reader- Infinite 200</td>
			<td style="width:128px;">Tecan</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium ionophore A23187</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">C7522</td>
			<td>Avoid from direct light exposure</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">P3766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-DNP monoclonal IgE</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8406&#160;</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNP-BSA/ DNP-HAS</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">A6661</td>
			<td>Avoid from direct light exposure</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Triton-x-100</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Confocal fluorescent microscope:</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Zeiss LSM 510</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Leica</td>
			<td style="width:128px;">SP5</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nikon A1 inverted</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Imaris software</td>
			<td style="width:128px;">BITLANE</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Microsoft exel or Prism or other analyses software</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Other reagent:</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">5833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Calcium chloride&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">2382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Glucose</td>
			<td style="width:128px;">BDH Laboratories</td>
			<td style="width:139px;">284515V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Monosodium phosphate&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">5345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Sterile water</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating mast cell secretory granules; from biosynthesis to exocytosis

Los mastocitos (MC) son células secretoras del sistema inmune que logran sus funciones fisiológicas y patológicas mediante la liberación de mediadores alérgicos, inflamatorios e inmunorreguladores preformados y recién sintetizados. Mediadores MCs &#39;afectan a múltiples tejidos y órganos que culminaron en las respuestas alérgicas e inmunológicas. La síntesis, el almacenamiento y la liberación de los mediadores MC están muy regulados. Los mediadores preformados se embalan en gránulos secretores citoplásmicos (SG) que se fusionan con la membrana plasmática y liberan su contenido por exocitosis regulada. Se presenta un protocolo, basado en la co-expresión de un gen de interés con un gen reportero que se dirige a la SGS y se libera de una manera regulada junto a los mediadores endógenos SG. El protocolo permite una alta resolución de cuatro dimensiones confocal análisis de la MC SGS y el seguimiento de su línea de tiempo de la biogénesis de exocitosis disparado. Por lo tanto, el uso de este protocolo para la detección de genes de interest por su impacto fenotípica y funcional permite descifrar los mecanismos moleculares que gobiernan la biogénesis y exocitosis de la MC SGS y la identificación de los reguladores implicados. Por ello, deben proporcionar más conocimientos sobre los mecanismos celulares que dan cuenta de la función MCs en la salud y la enfermedad.

Debido a la baja eficiencia de transfección de MCs, las manipulaciones genéticas son poco probable que deje un impacto en las lecturas de la secreción de promedio medidos por los mediadores endógenos SGs. Sin embargo, mediante el establecimiento de completa co-expresión del gen reportero NPY-mRFP y el plásmido co-transfectadas en las mismas células, el seguimiento de los resultados de NPY-mRFP exclusivamente en el seguimiento de la población de células que expresa el gen de interés. Por lo tanto, la ventaja de...

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Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

El objetivo de este protocolo era desarrollar un método que permita a los análisis de genómica funcional de la secreción de mastocitos. El protocolo se basa en la evaluación cuantitativa de la liberación de un gen indicador fluorescente cotrasfected con el gen de interés y análisis en tiempo real de la morfología de los gránulos de secreción.

Investigando mastocitos secretora gránulos; de Biosíntesis de la exocitosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

investigating-mast-cell-secretory-granules-from-biosynthesis-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.0K vistas.  Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University.  El objetivo de este protocolo era desarrollar un método que permita a los análisis de genómica funcional de la secreción de mastocitos. El protocolo se basa en la evaluación cuantitativa de la liberación de un gen indicador fluorescente cotrasfected con el gen de interés y análisis en tiempo real de la morfología de los gránulos de secreción. 

Video: Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Aplicación clínica de<em&gt; La Bella Durmiente</em&gt; Artificial y células presentadoras de antígenos para modificar genéticamente las células T de la sangre del cordón umbilical y periférica

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Investigación

Inmunología e Infección

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

Aislamiento de los precursores de células B subconjuntos de Sangre del Cordón Umbilical

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

A Microplate Assay to Assess Chemical Effects on RBL-2H3 Mast Cell Degranulation: Effects of Triclosan without Use of an Organic Solvent

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a process that results in the exocytosis of allergic mediators. Modulation of mast cell degranulation by drugs and toxicants may have positive or adverse effects on human health. Mast cell function has been dissected in detail with the use of rat basophilic leukemia mast cells (RBL-2H3), a widely accepted model of human mucosal mast cells3-5. Mast cell granule component and the allergic mediator &#946;-hexosaminidase, which is released linearly in tandem with histamine from mast cells6, can easily and reliably be measured through reaction with a fluorogenic substrate, yielding measurable fluorescence intensity in a microplate assay that is amenable to high-throughput studies1. Originally published by Naal et al.1, we have adapted this degranulation assay for the screening of drugs and toxicants and demonstrate its use here.
Triclosan is a broad-spectrum antibacterial agent that is present in many consumer products and has been found to be a therapeutic aid in human allergic skin disease7-11, although the mechanism for this effect is unknown. Here we demonstrate an assay for the effect of triclosan on mast cell degranulation. We recently showed that triclosan strongly affects mast cell function2. In an effort to avoid use of an organic solvent, triclosan is dissolved directly into aqueous buffer with heat and stirring, and resultant concentration is confirmed using UV-Vis spectrophotometry (using &#949;280 = 4,200 L/M/cm)12. This protocol has the potential to be used with a variety of chemicals to determine their effects on mast cell degranulation, and more broadly, their allergic potential.

Mast cell degranulation, the release of allergic mediators, is important in allergy, asthma, and parasite defense. Here we demonstrate techniques1 for assessing effects of drugs and toxicants on degranulation, methodology recently utilized to exhibit the powerful inhibitory effect of antibacterial agent triclosan2.

Un ensayo de microplacas para evaluar los efectos químicos sobre RBL-2H3 mástil degranulación: Efectos de Triclosan y sin uso de un disolvente orgánico

Mast cells play important roles in allergic disease and immune defense against parasites. Once activated (e.g. by an allergen), they degranulate, a ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

La visualización no lítico exocitosis de<em&gt; Cryptococcus neoformans</em&gt; De macrófagos Usando microscopía de luz digital

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using 'Mast Cell Knock-in' Mice

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such as skin, airways and gastrointestinal tract. Best known for their detrimental role in IgE-dependent allergic reactions, MCs have also emerged as important players in host defense against venom and invading bacteria and parasites. MC phenotype and function can be influenced by microenvironmental factors that may differ according to anatomic location and/or based on the type or stage of development of immune responses. For this reason, we and others have favored in vivo approaches over in vitro methods to gain insight into MC functions. Here, we describe methods for the generation of mouse bone marrow-derived cultured MCs (BMCMCs), their adoptive transfer into genetically MC-deficient mice, and the analysis of the numbers and distribution of adoptively transferred MCs at different anatomical sites. This method, named the &#8216;mast cell knock-in&#8217; approach, has been extensively used over the past 30 years to assess the functions of MCs and MC-derived products in vivo. We discuss the advantages and limitations of this method, in light of alternative approaches that have been developed in recent years.

Analyzing the Functions of Mast Cells In Vivo Using &#039;Mast Cell Knock-in&#039; Mice

We describe a method for the generation of in vitro derived mast cells, their engraftment into mast cell-deficient mice, and the analysis of the phenotype, numbers and distribution of engrafted mast cells at different anatomical sites. This protocol can be used to assess the functions of mast cells in vivo.

Análisis De Las Funciones De Los MastOcitos In Vivo Usando ' MastCell Knock-in' Ratones

Mast cells (MCs) are hematopoietic cells which reside in various tissues, and are especially abundant at sites exposed to the external environment, such ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Sobreexpresión y Purificación de Humanos<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferasa en<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic immune response. The activation of MCs via the cross-linking of surface IgE bound to high affinity IgE receptor (Fc&#949;RI), as well as through the stimulation of several other receptors, initiates the rise of the free intracellular Ca2+ level ([Ca2+]i) that promotes the release of inflammatory and allergic mediators. The identification of molecular constituents involved in these signaling pathways is crucial for understanding the regulation of MC function. In this article, we describe a protocol for the isolation of murine connective tissue type MCs by peritoneal lavage and cultivation of peritoneal MCs (PMCs). Cultures of MCs from various knockout mouse models by this methodology represent a useful approach to the identification of proteins involved in MC signaling pathways. In addition, we also describe a protocol for single cell Fura-2 imaging as an important technique for the quantification of Ca2+ signaling in MCs. Fluorescence-based monitoring of [Ca2+]i is a reliable and commonly used approach to study Ca2+ signaling events, including store-operated calcium entry, which is of utmost importance for MC activation. For the analysis of MC degranulation, we describe a &#946;-hexosaminidase release assay. The amount of &#946;-hexosaminidase released into the culture medium is considered as a degranulation marker for all three different secretory subsets described in MCs. &#946;-hexosaminidase can easily be quantified by its reaction with a colorigenic substrate in a microtiter plate colorimetric assay. This highly reproducible technique is cost-effective and requires no specialized equipment. Overall, the provided protocol demonstrates a high yield of MCs expressing typical MC surface markers, displaying typical morphological and phenotypic features of MCs, and demonstrating highly reproducible responses to secretagogues in Ca2+-imaging and degranulation assays.

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Here, we present a protocol to isolate and cultivate murine peritoneal mast cells. We also describe two protocols for their functional characterization: a fluorescent imaging of intracellular free Ca2+ concentration and a degranulation assay based on colorimetric quantification of the released &#946;-hexosaminidase.

Aislamiento de mastocitos de peritoneo derivado y su caracterización funcional con Ca2 +-proyección de imagen y pruebas de degranulación

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high mortality, despite new therapeutic options such as transcatheter aortic valve replacement (TAVR). 
The complete pathways that start with valve calcification and lead to severe aortic stenosis remain only partly understood. By providing a close representation of the aortic valve cells in vivo, the assaying of T lymphocytes from stenotic valve tissue could be an efficient way to clarify their role in the development of calcification. After surgical excision, the fresh aortic valve sample is dissected in small pieces and the T lymphocytes are cultured, cloned then analyzed using fluorescence activated cell sorting (FACS).
The staining procedure is simple and the stained tubes can also be fixed using 0.5% of paraformaldehyde and analyzed up to 15 days later. The results generated from the staining panel can be used to track changes in T cell concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific T cell subtypes of interest. In this study, we show the isolation of T cells, performed on fresh calcified aortic valve samples and the steps of analyzing T cell clones using flow cytometry to further understand the role of adaptive immunity in CAVD pathophysiology.

In this study, we describe the process of T lymphocyte isolation from fresh samples of calcified aortic valves and the analytical steps of T cell-cloning for the characterization of the adaptive leukocyte subsets by using flow cytometry analysis.

Investigación de la calcificación de la válvula aórtica a través del aislamiento y cultivo de linfocitos T utilizando células alimentadoras de la capa de Buffy irradiada

Calcific aortic valve disease (CAVD), an active disease process ranging from mild thickening of the valve to severe calcification, is associated with high ...

Double Labeling Immunofluorescence using Antibodies from the Same Species to Study Host-Pathogen Interactions

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to obtain commercial monoclonal or polyclonal antibodies that recognize specific cell structures and proteins in parasites. Besides, there are few commercial antibodies available to label trypanosomatids. Usually, polyclonal antibodies against parasites are prepared in-house and could be more challenging to use in combination with other antibodies produced in the same species. Here, the protocol demonstrates how to use polyclonal and monoclonal antibodies raised in the same species to perform double labeling immunofluorescence to study host cell and pathogen interactions. To achieve the double labeling immunofluorescence, it is crucial to incubate first the mouse polyclonal antibody and then follow the incubation with the secondary mouse IgG antibody conjugated to any fluorochrome. After that, an additional blocking step is necessary to prevent any trace of the primary antibody from being recognized by the next secondary antibody. Then, a mouse monoclonal antibody and its specific IgG subclass secondary antibody conjugated to a different fluorochrome are added to the sample at the appropriate times. Additionally, it is possible to perform triple labeling immunofluorescence using a third antibody raised in a different species. Also, structures such as nuclei and actin can be stained subsequently with their specific compounds or labels. Thus, these approaches presented here can be adjusted for any cell whose sources of primary antibodies are limited.

Here, the protocol describes how to perform double labeling immunofluorescence using primary antibodies raised in the same species to study host-pathogen interactions. Also, it can include the third antibody from a different host in this protocol. This approach can be made in any cell type and pathogens.

Doble etiquetado inmunofluorescencia utilizando anticuerpos de la misma especie para estudiar las interacciones huésped-patógeno

Nowadays, it is possible to find a wide range of molecular tools available to study parasite-host cell interactions. However, some limitations exist to ...

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

Phagocytosis is an orchestrated process that involves distinct steps: recognition, binding, and internalization. Professional phagocytes take up Leishmania parasites by phagocytosis, consisting of recognizing ligands on parasite surfaces by multiple host cell receptors. Binding of Leishmania to macrophage membranes occurs through complement receptor type 1 (CR1) and complement receptor type 3 (CR3) and Pattern Recognition Receptors. Lipophosphoglycan (LPG) and 63 kDa glycoprotein (gp63) are the main ligands involved in macrophage-Leishmania interactions. Following the initial recognition of parasite ligands by host cell receptors, parasites become internalized, survive, and multiply within parasitophorous vacuoles. The maturation process of Leishmania-induced vacuoles involves the acquisition of molecules from intracellular vesicles, including monomeric G protein Rab 5 and Rab 7, lysosomal associated membrane protein 1 (LAMP-1), lysosomal associated membrane protein 2 (LAMP-2), and microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3 (LC3).
Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells using confocal microscopy, including (i) binding (ii) internalization, and (iii) phagosome maturation. By adding to the body of knowledge surrounding these determinants of infection outcome, we hope to improve the understanding of the pathogenesis of Leishmania infection and support the eventual search for novel chemotherapeutic targets.

Investigating the Phagocytosis of Leishmania using Confocal Microscopy

The mechanism associated with phagocytosis in Leishmania infection remains poorly understood. Here, we describe methods to evaluate the early events occurring during Leishmania interaction with the host cells.