Agradecemos ao Dr. U. Ashery pelo dom da NPY-MRFP cDNA. Agradecemos Drs. MJ Kofron, L. Mittleman, M. Shaharbani, e Y. Zilberstein para ajuda inestimável com microscopia e análise de imagem. Agradecemos também o Dr. Joseph Orly para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado por uma doação da Fundação Israel Ciência, fundada pela Academia de Ciências de Israel (1139/12 a RS-e.).

1. Preparação de células RBL Meios de Cultura <ol><li> Misturar 500 ml de meio de Eagle modificado de baixo teor de glucose de Dulbecco (DMEM) com 56 ml de soro fetal bovino (esta faz com que 10% de FBS), e, em seguida, adicionar 5,5 ml de penicilina estreptomicina (isto faz ~ 1% PEST). </li><li> Filtrar a mídia usando 500-1.000 ml Bottle-Top Filtros de vácuo com 0,22 tamanho dos poros e armazenar a 4 ° C. </li></ol> 2. Cultura de Células RBL <ol><li> Cultivar células RBL em uma atmosfera humidificada de 5% de CO2 a 37 ° C quer em placas ou frascos. Células RBL que estão crescendo em placas de 10 cm deve ser suplementado com 10 ml de meio e formar monocamada confluente de ~ 10 7 células / placa. </li><li> Quando a camada celular se aproxima confluência, replate a cultura a uma densidade inferior. <ol><li> Remover o meio de cultura a partir da placa / frasco, utilizando uma pipeta pasteur estéril ligada a vácuo. </li><li> Lavar a monocamada de células com pré-aquecido (37° C) de 0,25% de tripsina / EDTA, que cobre toda a monocamada (o volume depende do tamanho da placa de cultura / frasco; 2 ml para placa de 10 cm). Isto vai separar as células. </li><li> Alternativamente, lavar a monocamada de células com tampão de fosfato salino (PBS), remover o PBS e adicionar pré-aquecido (37 ° C) de tripsina / EDTA. Este passo separa as células mais rapidamente. </li><li> Colocar a placa / balão numa incubadora a 37 ° C (não mais do que 10 min). </li><li> Inspecione as células ao microscópio óptico para verificar se eles têm destacado. Se as células não se separar após 10 min, bater suavemente na placa / balão. </li><li> Adicionar suporte para a placa de cultura / frasco para suspender as células (o volume do meio deveria ser de pelo menos 2 vezes maior do que o volume da solução de tripsina). </li><li> Agregar as células por centrifugação durante 3 minutos a 200 g a 25 ° C. </li><li> Ressuspender as células em meio. Dilui-se as células por 1:10 e sementes de uma nova placa de cultura. Incubar as células durante 48-72 horas, até que eles REACh aproximadamente 90% de confluência. </li><li> Repita o mesmo procedimento (seção 2.2.1-2.2.8) para até 3 meses (30 passagens). </li></ol></li></ol> 3. Preparação de Transfection Mídia. <ol><li> Prepara-se uma solução 100 mM de K-Tubos de pH 7, de solução de 1 mM de Ca2 + de etilo e solução 100 mM de acetato de Mg 2+. </li><li> Dilui-se a solução 100 mM de K-pipes pH 7 em 20 mM utilizando meio DMEM, adicionar a solução de 1 mM de Ca2 + de etilo até uma concentração final de 10 uM e solução 100 mM de acetato de Mg 2+ para uma concentração final de 2 mM. </li><li> Pesar glutamato de potássio e adiciona-se à solução a uma concentração final de 128 mM, misturar bem e manter a 4 ° C até à sua utilização. Manter as soluções restantes (isto é., K-Tubos, Ca 2+ acetato, Mg 2+ de etilo) a -20 ° C. </li></ol> 4. transfecção de células RBL <ol><li> Remover o meio de cultura a partir da placa / balão usando umpipeta pasteur estéril ligada a vácuo. </li><li> Lavar a monocamada de células com pré-aquecido (37 ° C) tripsina / EDTA que devem cobrir todo o monocamada. Colocar a placa / balão numa incubadora a 37 ° C (não mais do que 10 min). Verificar se as células terem separado utilizando o microscópio óptico. </li><li> Adicionar suporte para a placa de cultura / frasco para suspender as células (o volume dos meios de comunicação deve ser, pelo menos, 2-maior mais do que o volume da solução de tripsina). </li><li> Contar o número de células usando hemocitômetro. </li><li> Agregar 1,5 × 10 7 células por centrifugação durante 3 minutos a 200 xg a 25 ° C. Descartar o sobrenadante e adicionar 280 uL de meio de transfecção. Transferir a mistura reaccional para dentro de 4 milímetros cuvete. </li><li> Adiciona-se 20 ug de plasmídeo MRFP NPY-e ou 30 ug de plasmídeo de controlo vazio ou um plasmídeo testado. O volume final da mistura de reacção deve ser de 300 uL. </li><li> Colocar imediatamente em gelo durante 10 min. Limpe a tina de água residual e proceed a electroporação a 300 V durante 9 ms. </li><li> Para as medições de exocitose, replate as células imediatamente em placas de 24 poços de cultura de tecidos contendo meio de 300 ul. Adicionar 8 ul da mistura reaccional (4 x 10 5 células) para cada poço. Adicionar células 4 × 10 5 não transfectadas para poços adicionais para o controle. Prepare poços suficientes para ter, pelo menos, poços duplicados para cada tratamento para cada transfecção. </li><li> Para a microscopia de lapso de tempo, replate as células imediatamente num sistema de câmara de lamela de borossilicato de 8 poços contendo 80 ul médio. Adicionar 1,5 mL da mistura de reacção (7,5 x 10 4 células) para cada câmara. (Tentar evitar o uso das câmaras na borda da lamela, as câmaras no centro da lamela são mais fáceis de imagem). NOTA: É importante ressaltar que nem todas as células envolvidas na resposta a um gatilho e, ocasionalmente, a microscopia de lapso de tempo é revogada devido à perda de foco e deriva do borosi câmara de 8 poçossistema lamela licate. Assim, preparam-se pelo menos oito câmaras de cada tratamento para cada transfecção. </li><li> Para sensibilizar as células para a activação mediada FceRI, adicionar 1 ug / ml de DNP de rato monoclonal IgE específica para os meios de comunicação (incubar as células com níveis de IgE durante pelo menos 2 horas). </li><li> Após 18-24 h usar um microscópio de fluorescência para confirmar que as células expressam os plasmídeos. Os comprimentos de onda de excitação e emissão de fluorescência são MRFP: λEx 584, λEm 607 nm. NPY-MRFP deve aparecer em estruturas vesiculares que correspondem aos GV. Se o segundo gene de interesse é fundido com um marcador fluorescente usar um microscópio de fluorescência para confirmar a co-expressão de ambos os plasmídeos nas mesmas células. Por exemplo, se o gene testado é fundido a GFP, Os comprimentos de onda de excitação e emissão de fluorescência da GFP são: λEx 488, λEm 507 nm. A proteína GFP tag deve aparecer nas mesmas células que expressam NPY-MRFP. </li><li> Para as medições de exocitose proceder to passo 5 e para a microscopia de lapso de tempo, vá para a etapa 6. </li></ol> 5. Medição NPY-MRFP Exocytosis <ol><li> Preparação de tampão de Tyrode: <ol><li> Prepara-se uma solução de KCl 54 mM, 20 mM de MgCl2, 2,74 M de NaCl e 8 mM de NaH 2 PO 4 em DDW. Misturar bem e armazenar a 4 ° C. Este passo é para a preparação de 20x tampão de Tyrode. </li><li> Prepara-se uma solução de tampão Hepes 20 mM, pH 7, CaCl 2 1,8 mM, 1 mg / ml de BSA, 5,6 mM de glucose e 1 a 20 de Tyrode diluição 20x em DDW e misturar bem. Este passo é para a preparação de 1x tampão de Tyrode. </li><li> Alíquota da 1x tampão Tyrode e armazenar a -20 ° C. Evite congelamento e descongelamento repetido. </li></ol></li><li> Remover o meio de cultura da placa de 24 poços e lava-se 3 vezes com tampão de Tyrode. Preparar as células não estimuladas por adição de tampão de Tyrode 200 ul a poços de controlo. </li><li> Preparar 10 ul / poço de reagente de activação concentrada 20X [(por exemplo, 1.000 ng / mL DNP-BSA ou DNP-HSA (Ag), 200 uM de ionóforo de Ca 2+ (por exemplo, A23187), e uma combinação de 20 uM de ionóforo de Ca 2+ e 1000 nM de 12-O- tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA)]. Se os reagentes são armazenados em DMSO, dilui-se os reagentes em 20x concentração em tampão de Tyrode contendo 1% de DMSO. Incubar a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Remove-se os sobrenadantes de cada poço cuidadosamente para uma placa de 96 poços, colocar em gelo e evitar de luz. (Os sobrenadantes contêm o péptido quimérico NPY-MRFP que foi libertado a partir das células). </li><li> Adicionar 200 ul de tampão de Tyrode contendo 0,5% de Triton X-100 a cada poço e incubar a 37 ° C durante 10 min. (Este passo é importante para a preparação de lisados ​​de células que contêm o restante do NPY-MRFP que não foi libertado das células). Recolher os lisados ​​de células e transferir para uma placa de 96 poços, colocar em gelo e evitar de luz. </li><li> Medir a fluorescência das células sobrenadantes e os lisados ​​de células utilizando um fluoresleitor de placas cia, utilizando um 590-, 20 nm de largura de banda de excitação do filtro e 635-, 35 nm, filtro de emissão de largura de banda. </li><li> Calcular a percentagem de NPY-MRFP lançado: NOTA: A medida leitor fluorescência unidades de fluorescência arbitrárias (AFU). AFU valores dependem da máquina e a sua sensibilidade e a eficácia de transfecção. <ol><li> Defina a autofluorescência de células RBL não transfec- em branco. Divida a AFU de cada sobrenadante para a fluorescência total (AFU do sobrenadante + AFU do ligado correspondente) e multiplicar por 100. </li></ol></li></ol> 6. Time-lapse Microscopia de Exocytosis <ol><li> Semente de 7,5 x 10 4 a de células / câmara num sistema transfectadas lamela de borosilicato câmara de 8 poços. Após 18-24 h, remover o meio de cultura a partir das câmaras e lavar 3 vezes com tampão de Tyrode </li><li> Adicionar 72 ul de tampão de Tyrode para cada câmara. Dilui-se os reagentes de activação em tampão de Tyrode a 10X a concentração. </li> &lt;li&gt; Use um microscópio confocal de fluorescência equipado com uma câmara aquecida (37 ° C) e CO 2 controlador (4,8%) e uma objectiva de 40X ou 63X. Ligue os sistemas de microscopia: lâmpada de mercúrio, computador e lasers. Certifique-se de que a câmara aquecida está na temperatura certa antes do início do experimento. </li><li> Coloque a câmara na câmara aquecida e certificar-se de que a câmara está instalada corretamente e estável. </li><li> Ligar a luz de fluorescência de acordo com o fluoróforo em causa e visualizar as células transfectadas. Desligue fluorescência uma vez por célula de interesse está no campo, a fim de minimizar o branqueamento e citotoxicidade. É importante que este campo irá conter cerca de 2-3 células transfectadas. As células transf deve ser bem espalhado, mas não tocar o outro. </li><li> Ajustar a potência do laser (dependendo do microscópio) para minimizar o ruído e supersaturação, bem como a toxicidade, e definir o ganho e deslocamento para modificar a relação sinal-ruído. Digitalização rápida ouder a minimizar a duração de exposição a laser (média de 2). </li><li> Ajustar o tamanho do furo de pino para um máximo, isto capaz de reduzir a potência do laser e para manter as imagens focadas por um longo período de tempo. Se desejar, defina os parâmetros para a pilha Z para reconstruir a imagem em três dimensões, ajustar o tamanho pinhole a 1 unidade arejado (UA), que dá a melhor relação sinal-ruído e adquirir digitalização sucessiva de fatias ópticos confocal bidimensionais no -axes z com fatias ópticos ≤0.7 mm. </li><li> Defina o tempo de intervalo entre cada aquisição de 15-30 seg e a duração de aquisição total para 15 min e começar a aquisição de imagens. Após 5 min de aquisição pausa da série histórica. Adicionar 8 mL da trigger 10x e continuar imediatamente a aquisição. </li><li> Salve as imagens, execute deconvolution usando um software deconvolution e reconstruir as pilhas de imagens tridimensionais e um filme usando software Imaris. </li></ol><ol><li> Importar os dados a partir das imagens da série deconvoluídos vez que foram obtidos pela microscopia de fluorescência confocal para software Imaris. Este software lê mais de 40 arquivos de microscopia. Se o software não consegue ler os arquivos; converter os arquivos para arquivos tif e importação. </li><li> Para adicionar pontos de tempo para o fim de um conjunto de dados aberto pressione editar -&gt; Adicionar pontos no tempo e importar o novo conjunto de dados. </li><li> Criar superfície do canal MRFP usando opção de assistente de superfície. Escolha o algoritmo padrão. Escolha o canal de NPY-MRFP. Marque a opção de suavização para reduzir o ruído. Para evitar a perda de pequenos detalhes reduzir o nível de detalhe área de 0,05 um. </li><li> Defina o limite de intensidade. New superfície cinzenta será exibida. Vá em &quot;Configurações&quot; e mude o estilo do &quot;ponto Center&quot; para &quot;Surface&quot;. </li><li> Vá até a aba estatística nas propriedades do objeto selecionado, selecione a guia detalhado e o suc valor específicoh como intensidade de fluorescência, volume, etc. </li><li> Analisar os dados e confirmar que os valores são compatíveis com as imagens. Por exemplo, dois ou mais grânulos adjacentes pode ser medido como um grânulo maior. Para quantificar o tamanho médio de grânulo de dividir o tamanho dos grânulos fundidos para o número real de grânulos. </li><li> Exportar os conjuntos de dados desejados para arquivos do Excel e analisar os dados. </li></ol> f

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The authors have no financial conflicts of interest.

Descrevemos uma estratégia inovadora que combina quantificação de MCs exocitose e quatro (x, y, z, t) quantificações de dimensão por imagiologia tridimensional tempo decorrido dos SGs em células vivas, utilizando um gene repórter para a exocitose. Esta técnica permite a triagem das famílias de proteínas para o seu impacto sobre a função MC como SGs de monitoramento a partir tão cedo quanto a sua saída do Golgi através de sua maturação, a aquisição de competências exocitose e degranulação. A combin...

Mastócitos (MC) são células imunes que são melhor conhecidas pelo seu envolvimento em reacções alérgicas e inflamatórias tais como artrite, asma, esofagite eosinofílica, dermatite crónica e choque anafilático 1,2 bem como outras patologias, incluindo doença da artéria coronária e 3,5 cancro 3,4. Além disso, MCs desempenham importantes papéis na imunidade inata e adaptativa, tanto na defesa do hospedeiro contra as bactérias e os parasitas e por supressão de respostas imunológicas, por exemplo, induzir tolerância do enxerto 5,6. MCs originam a partir da medula óssea, o desenvolvimento de células CD34 + / CD117 + células progenitoras pluripotentes 7. Medula óssea Committed progenitores MC são liberados na corrente sanguínea e migram para os tecidos periféricos que localizam predominantemente no interior de tecidos conjuntivos e superfícies epiteliais 8. Maturação e diferenciação terminal, eventualmente, são alcançados sob a influência of citocinas no meio circundante 8,9. MCs pode ser activado por um alergénio (antigénio, Ag), cujo encontro resultou na geração de imunoglobulina E (IgE) digite anticorpos. A ligação de IgE a receptores de tais FceRI do MC, seguido por ligação cruzada de IgE ligada à célula após re-exposição ao mesmo Ag, resulta em agregação FceRI e iniciação de uma cascata de sinalização que culmina na desgranulação celular [revisto em 10,11] . MCs também são ativadas, independentemente de IgE, por neuropeptídeos 5,12, toxinas 13, bacteriana e antígenos virais 14,15, uma série de peptídeos carregados positivamente colectivamente referidos como secretagogues básicos, células do sistema imunológico e citocinas 5,13,12,16 , 17. MCs também são activadas por muitos dos seus próprios mediadores libertados, que desenvolvem ainda mais a resposta inflamatória. MCs são embalados com grânulos de secreção (SGs) que contêm imunomediadores reguladoras, incluindo aminas vasoactivas, tais como histamina e serotonina (em roedores), proteoglicanos, proteases, tais como triptase e quimase, factor de crescimento endotelial vascular e várias citocinas e quimiocinas 8,9. Estes mediadores são &quot;pronto para ir&quot; e uma vez MCs são ativados por um estímulo adequado, esses mediadores são liberados das células por exocitose regulada (desgranulação) em questão de segundos a minutos 18,19. Este evento inicial é seguido pela síntese de novo e libertação de uma grande variedade de substâncias biologicamente potentes, incluindo metabolitos de ácido araquidónico, várias citocinas e quimiocinas 20,21,22. Lançamento de produtos recém-sintetizados ocorre independentemente da liberação SG. Coletivamente, esses mediadores iniciar precoces e fase tardia respostas inflamatórias e alérgicas. Portanto, a compreensão dos mecanismos responsáveis ​​por ativação MC e degranulação são ambos de imp teórico e clínicoortance. A dificuldade de manipular geneticamente MCs primárias e cultivadas tem dificultado as tentativas para elucidar os mecanismos subjacentes MC degranulação, que continuou mal resolvidos. Para superar este problema foi desenvolvido um ensaio baseado repórter por co-transfecção da linha de células da mucosa do mastro, leucemia basofílica de rato (RBL) -2H3 (aqui referidos como RBL) ou da medula óssea derivadas MCs (BMMCs) 30 com um gene de interesse e O neuropeptídeo Y (NPY) fundido a RFP monomérica (MRFP), como um repórter SG. NPY foi anteriormente mostrado para recapitular o comportamento dos marcadores SG endógenos em outros sistemas. Além disso, porque MRFP fluorescência é insensível pH, a expressão do NPY-MRFP permite a visualização dos GV de ácidos, bem como a avaliação quantitativa de exocitose, utilizando placas de 96 poços e um leitor de placas de fluorescência. Mostrámos que o NPY-MRFP é entregue aos SGs ácidas de células RBL e BMMCs e é libertado a partir das célulasde uma forma regulada juntamente com a carga SG endógenos (isto é, β-hexosaminidase e serotonina) 30, 32. Este protocolo prevê uma metodologia baseada em imagens de alta resolução que permite que genes de triagem de interesse para a sua fenotípica e funcional impacto sobre as características de SG e desgranulação em células RBL 32. Especificamente, este protocolo permite o acompanhamento em tempo real do MC SG e quantificação da sua área ou tamanho do volume, o seu número, a cinética de montagem, o seu movimento ao longo do citoesqueleto da célula e a sua fusão definitiva com a membrana do plasma sob diferentes condições. Por exemplo, sensibilizar as células com DNP-IgE específica e desencadear as células com um Ag multivalente (DNP conjugado a albumina do soro) sob diferentes perturbações (isto é, o knockdown de genes de interesse, sobre a expressão de genes wt ou mutantes, ou manipulações farmacológicas) e comparação com células de controlo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="844">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:128px;">Company</td>
			<td style="width:139px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:156px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:421px;">DMEM</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6046-500ML</td>
			<td style="width:156px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:128px;">GE health care Life sciences</td>
			<td>SH30071.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:128px;">Life technologies</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Cellulose acetate membrane, pore size 0.22&#160;&#956;m</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS430769-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Corning tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">Trypsin/EDTA Solution (TE)</td>
			<td style="width:128px;">Life technologies</td>
			<td>R001100</td>
			<td style="width:156px;">Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">PIPES dipotassium salt</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">108321-27-3&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Calcium acetate hydrate</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>114460-21-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Magnesium acetate tetrahydrate</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">M5661&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate)</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">G1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4 mm electroporation cuvettes</td>
			<td style="width:128px;">cell projects</td>
			<td style="width:139px;">EP-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER &#38; CAPACITANCE</td>
			<td style="width:128px;">Bio rad</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chambered coverglass</td>
			<td style="width:128px;">Thermo scientific</td>
			<td align="right" style="width:139px;">155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">24 well, flat bottom</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Corning 96 well plates</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">CLS3367 or CLS390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well plate fluorescence reader- Infinite 200</td>
			<td style="width:128px;">Tecan</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium ionophore A23187</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">C7522</td>
			<td>Avoid from direct light exposure</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA)</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:139px;">P3766</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-DNP monoclonal IgE</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8406&#160;</td>
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNP-BSA/ DNP-HAS</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">A6661</td>
			<td>Avoid from direct light exposure</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Triton-x-100</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Confocal fluorescent microscope:</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Zeiss LSM 510</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Leica</td>
			<td style="width:128px;">SP5</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nikon A1 inverted</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Imaris software</td>
			<td style="width:128px;">BITLANE</td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Microsoft exel or Prism or other analyses software</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Other reagent:</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">5833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Calcium chloride&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">2382</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td style="width:128px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:139px;">A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Glucose</td>
			<td style="width:128px;">BDH Laboratories</td>
			<td style="width:139px;">284515V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Monosodium phosphate&#160;</td>
			<td style="width:128px;">MERK</td>
			<td style="width:139px;">5345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:421px;">Sterile water</td>
			<td style="width:128px;"></td>
			<td style="width:139px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating mast cell secretory granules; from biosynthesis to exocytosis

Mastócitos (MC) são células secretoras do sistema imunitário que realizam as suas funções fisiológicas e patológicas através da libertação de mediadores alérgicos, inflamatórios e imuno pré-formada e recém-sintetizadas. Mediadores MCs &#39;afetar vários tecidos e órgãos, culminando em respostas alérgicas e imunológicas. A síntese, armazenamento e liberação dos mediadores MC são altamente regulamentados. Os mediadores pré-formados são embalados em grânulos secretores citoplasmáticos (SG) que se fundem com a membrana plasmática e libertam o seu conteúdo por exocitose regulada. Apresenta-se um protocolo, com base na co-expressão de um gene de interesse com um gene repórter que está voltado para as SG e é libertada de um modo regulado com os mediadores de SG endógenos. O protocolo permite alta resolução quatro confocal dimensional análises do MC GV e monitorização da sua linha do tempo a partir de biogênese a exocitose disparada. Assim, usando esse protocolo para a triagem de genes entreest por sua fenotípica e funcional impacto permite decifrar os mecanismos moleculares que governam a biogênese e exocitose do MC GV e identificar os reguladores envolvidos. Assim, devem ser fornecidos mais insights sobre os mecanismos celulares que respondem por função MCs na saúde e na doença.

Devido à baixa eficiência de transfecção de MCs, as manipulações genéticas são susceptíveis de deixar um impacto sobre as leituras de secreção média medidos por mediadores endógenos SGs. No entanto, mediante o estabelecimento de co-expressão completa do gene repórter NPY-MRFP e o plasmídeo de co-transfectados nas mesmas células, a monitorização dos resultados NPY-MRFP exclusivamente no controlo da população de células que expressa o gene de interesse. Portanto, a vantagem deste ensaio em comparaç?...

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Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

O objectivo do presente protocolo foi o de desenvolver um método que permita análises genómicas funcionais da secreção de mastócitos. O protocolo baseia-se na avaliação quantitativa da libertação de um gene repórter fluorescente cotrasfected com o gene de interesse e análises em tempo real da morfologia do grânulo secretor.

Investigando Mastócito Secretory grânulos; de Biossíntese de Exocytosis

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

investigating-mast-cell-secretory-granules-from-biosynthesis-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.0K visualizações.  Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University.  O objectivo do presente protocolo foi o de desenvolver um método que permita análises genómicas funcionais da secreção de mastócitos. O protocolo baseia-se na avaliação quantitativa da libertação de um gene repórter fluorescente cotrasfected com o gene de interesse e análises em tempo real da morfologia do grânulo secretor. 