Damos las gracias a Andreas Radbruch valiosa para los debates. Estamos muy agradecidos a Sabine Gruczek, Patrick Thiemann y Manuela Ohde para obtener ayuda con el cuidado de animales y Robert Günther por su excelente asistencia técnica. Agradecemos a nuestros evaluadores entrenados Laura Oehme, Jannike Bayat-Sarmadi, Karolin Pollok, Katrin Roth, Florencia Pache y Katharina Cuerno para la evaluación de las muestras histológicas y Randy Lindquist para la corrección del manuscrito. Agradecemos a J. y N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, Arizona, EE.UU. para anticuerpos MBP-específicos. Este trabajo fue apoyado por DFG HA5354 / 4-1, por JIMI-una subvención red instalación central DFG para microscopía intravital y por TRR130 / TP17, y DFG PARA 2165 (HA5354 / 6-1) para AEHSZ fue apoyada por el Max Planck Internacional Escuela de Enfermedades Infecciosas e Inmunología (IMPRS-IDI), Berlín.

Los experimentos con animales fueron aprobadas por los comités estatales apropiadas para el bienestar animal (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlín) y se realizaron de acuerdo con las directrices y la normativa vigente (licencia experimento con animales G0194 / 11). 1. Generación de ratones quiméricos fluorescente de Médula Ósea NOTA: La generación de la médula ósea fluorescente ratones quiméricos para visualizar las células estromales de médula ósea se realizó como se describió antes 9. <ol><li> Comience el tratamiento Del-Cre x ratones ROSA-tdRFP (ratones que expresaban la proteína tándem rojo fluorescente (tdRFP) ubicua 11-13) a fin de prepararlos para la irradiación. Como alternativa, utilice cualquier otra cepa con expresión ubicua de la proteína fluorescente. Administrar 1 mg / ml de neomicina y 1 mg / ml de vitaminas (A, D3, E, C) a través del agua potable de dos días antes de la irradiación. </li><li> Irradiar ratones dos veces con 3,8 gris con un irradiador gamma-wi Cesio-137delgada de un intervalo de 3 horas. Para ello, colocar los ratones en una jaula de tarta de la irradiación adecuada para el respectivo irradiador. NOTA: Para la irradiación de los ratones, nuestro Instituto no requiere anestesia. Siga las políticas institucionales locales con respecto a la anestesia para la irradiación. Tratar a los animales con 5 mg / kg por vía subcutánea de carprofeno (sc) por día después de la irradiación si hay signos de dolor. </li><li> El día siguiente, reconstituir ratones mediante una inyección intravenosa de 3 x 10 6 células de médula ósea preparadas a partir de huesos largos de ratones C57BL / 6 ratones donantes en tampón de transferencia 9. Mantenga los ratones en neomicina y vitaminas para un máximo de 2 semanas y un seguimiento de su bienestar y de peso durante este tiempo. Espere al menos 4 semanas para permitir la reconstitución del sistema inmunológico antes de iniciar los tratamientos experimentales específicas (por ejemplo, la inmunización) 9. </li><li> Sacrificar los ratones y colocarlos en una tabla de disección, esterilizar las piernas con etanol al 70%. Euthanize ratones en conformidad con las políticas institucionales locales. Nuestro Instituto realiza dislocación cervical. </li><li> Utilice pinzas y tijeras para quitar la piel de los muslos. Quitar el tejido muscular para exponer el hueso femoral. Luxate el hueso femoral de la articulación de la cadera y la rodilla utilizando pinzas y tijeras. Tenga cuidado de no romper o cortar el hueso. </li><li> Para sacar el resto de grandes piezas de tejido muscular y el cartílago del hueso con unas tijeras. Quitar el tejido muscular restante por el roce de los huesos con papel de seda de laboratorio. Recoger los huesos limpios en una placa de Petri con tampón fosfato salino (PBS). </li><li> Fijar los huesos femorales enteros en 4% de paraformaldehído (PFA, electrón grado microscopía) de 4 - 6 horas. </li><li> Deseche PFA e incubar huesos en 10% de sacarosa en PBS O / N. El día siguiente, se incuban los huesos en 20% de sacarosa O / N. El día después, incubar los huesos en el 30% de sacarosa O / N. </li></ol> 2. cryosectioning de los Huesos NOTA: Después de 16 - 24 h en 30% de sacarosa, congelar los huesos y cryosection de acuerdo con el método de cinta de Kawamoto 14,15. <ol><li> Preparar un vaso de precipitados grande (2000 ml de volumen) con hielo seco y acetona (aproximadamente 2: 1 relación de volumen, por ejemplo, 400 ml de hielo seco y 200 ml de acetona) bajo una campana de humos. Coloque un vaso pequeño (150 a 250 ml de volumen) con hexano en el interior (30 a 50 ml aproximadamente). Esperar a que la mezcla se enfríe (aproximadamente 10 min, hasta que aparezca escarcha en el exterior del vaso de precipitados grande). </li><li> Llenar ¾ partes de la criomolde etiquetado con Súper Cryoembedding Medio (SCEM); coloque cuidadosamente los huesos en el interior hasta que estén totalmente sumergidos, teniendo cuidado de que no se toquen los bordes del molde. Con grandes fórceps sostener el criomolde en el vaso de precipitados con la parte inferior del molde simplemente tocando la superficie del hexano. <ol><li> Deje que los bordes exteriores de la congelación SCEM (indicado por la opacidad, esto toma aproximadamente 15 segundos). A continuación, colocar totalmente el molde en el hexano y se deja freeze para 1 - 2 min. Saque la muestra congelada y envolver en papel celofán y luego papel de aluminio (para proteger la muestra se seque y para evitar la exposición a la luz). Conservar a -80 ° C hasta cryosectioning. </li></ol></li><li> Para cryosectioning de huesos femorales utilizar un estándar de cuchillas de microtomo y micrótomo para tejidos duros. </li><li> Establecer la muestra y la cuchilla temperatura del micrótomo a -24 ° C. Deje que la muestra se sientan dentro del microtomo durante aproximadamente 15 minutos antes de cortar. <ol><li> Fijar el bloque de muestras para el soporte de la muestra de metal con SCEM o la temperatura óptima de corte (OCT) medio. Ajustar la orientación del bloque si es necesario. Recorte la muestra hasta que está totalmente abierta el hueso y la médula ósea es visible. Ajustar el espesor de corte de 7 mm (deseche la primera sección). </li><li> Fije un trozo de cinta Kawamoto con el lado adhesivo en la parte superior del bloque de muestras usando una espátula de madera cubiertas de piel de ciervo. Posteriormente, cortar la muestra y gire la cinta de modo que la sección essituado en el lado superior. Transferir la cinta a un portaobjetos de vidrio utilizando fórceps. Fijar la cinta al portaobjetos de vidrio con cinta adhesiva. </li></ol></li><li> Deje secciones se sequen durante al menos 30 minutos y se almacenan a -80 ° C hasta su uso. Guarde diapositivas sin teñir y sin montar en cajas de diapositivas de plástico con separadores entre diapositivas individuales con el fin de evitar que se peguen. Manchado y montados diapositivas se pueden almacenar durante un máximo de una semana en cartón carpetas de diapositivas a 4 ° C. </li></ol> 3. Imagen de la colección <ol><li> Descongele y cryosections mancha de acuerdo con los protocolos de inmunofluorescencia comunes 9. Incluir un tinte nuclear, por ejemplo, 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol dihidrocloruro (DAPI) para visualizar la integridad del tejido. NOTA: Mancha, por ejemplo, para RFP para visualizar las células del estroma (anti-RFP-biotina de anticuerpos y estreptavidina-Alexa Fluor 555), la mancha con eosinófilos de rata anti-proteína básica mayor (MBP) y anticuerpo anti-rata-Alexa Fluor 647 anticuerpo , células Bcon la rata anti-B220-Alexa Fluor 594 anticuerpos y PCs con luz anti-κ cadena fluoresceína iso-tiocianato (FITC) y anticuerpos anti-λ1 cadena-FITC luz (detalles del procedimiento de tinción se describen en 9). </li><li> Montar las secciones teñidas: poner una gota de Fluoromount en la sección y luego cubra con una cubierta de vidrio antideslizante # 1, al tiempo que evita cuidadosamente la formación de burbujas de aire. Posteriormente, realice láser confocal de microscopía de barrido con un instrumento equipado con líneas de láser adecuados para la tinción. </li><li> Para grabar imágenes para el análisis de co-localización automatizada de las células hematopoyéticas de la médula ósea con células del estroma con la función Wimasis, aplicar los siguientes ajustes: <ol><li> Utilice una lente objetivo de 20X y un campo de visión de 708,15 x 708,15 m. Para el análisis automatizado, mantener el tamaño de todas las imágenes consistentes en 2048 x 2048 píxeles (px) con el fin de mantener los resultados comparables. </li><li> Grabar un canal para las estructuras del estroma (por ejemplo, </em&gt; 561 nm línea de láser), un canal para núcleos (por ejemplo, DAPI, 405 nm) y los canales adicionales para las células hematopoyéticas de interés (por ejemplo, 3 canales, 488/594/633 nm para eosinófilos, células B y PCs). </li><li> Grabar imágenes mediante línea con un promedio de 4 16. Lo ideal sería que cubren toda la sección femoral tomando imágenes adyacentes individuales. Otra opción es tomar imágenes no adyacentes de varias regiones de la médula ósea (diáfisis y epífisis). NOTA: Tenga cuidado de no producir solapamientos entre las imágenes adyacentes (para evitar el análisis repetido de las células en las áreas de solapamiento). </li></ol></li><li> Guarde las imágenes en un formato de archivo de imagen de microscopía. Compruebe y, si es necesario, ajustar el contraste para todos los canales en el software Visor de imágenes / análisis. </li><li> Exportación 3 archivos .jpg por archivo imagen: un archivo .jpg para el canal DAPI (formato de color rojo / verde / azul (RGB), falso color codificado en amarillo), un archivo .jpg para el canal de estroma (escala de grises) y una .jpg archivo que contienelos canales de células hematopoyéticas (3 canales máximo, en formato RGB, por ejemplo, FITC (PCs, falso color: verde) / (células Alexa Fluor 594 B, falso color: azul) / Alexa Fluor 647 (eosinófilos, falso color: rojo)) . </li></ol> 4. Automatizado de Análisis de Imágenes <ol><li> Utilice una herramienta de análisis de imagen para realizar la segmentación de imágenes, la cuantificación de co-localización y análisis de vecindad (ver Discusión). </li><li> Si el uso de las herramientas Wimasis, haga lo siguiente: <ol><li> Sube las series de 3 archivos .jpg por imagen con el mismo nombre de archivo seguido de un subrayado y un número que indica el tipo de la imagen. </li><li> Utilice _1 para el archivo .jpg con células hematopoyéticas, _2 para el archivo .jpg para el canal DAPI, _3 para el archivo .jpg para el canal de estroma. Por ejemplo: Image1_1.jpg (células hematopoyéticas), Image1_2.jpg (canal DAPI), y Image1_3.jpg (canal estroma). Sube las imágenes a través de la cuenta del cliente. </li><li> Para contacto celular cuantificaciónelegir la herramienta de contacto celular haciendo clic en el campo respectivo. Para la cuantificación proximidades celular, elija la herramienta proximidades celular y entrar en el radio de proximidad preferido en micras (que se mide a partir de los bordes de las células). </li><li> Descargue los resultados. NOTA: Los resultados se proporcionan como archivos .jpg que muestran las células hematopoyéticas y el canal de estroma con los límites de los objetos detectados resaltado, así como archivos .csv individuales que contienen las mediciones para cada imagen, además de un resumen .csv que contiene los datos de todas las imágenes subidas. </li></ol></li><li> Desde el contacto mediciones determinan la frecuencia de células hematopoyéticas (rojo, verde o azul células) en contacto con las células del estroma, o las frecuencias de las células rojas, verdes o azules en contacto los otros tipos de células hematopoyéticas (un ejemplo se muestra en resultados representativos , la Figura 4). Con el fin de determinar las frecuencias, dividir los recuentos de contacto dados por imagen porla cuenta total de células por imagen. <ol><li> Para los experimentos con ratones individuales, resumir los recuentos de contacto totales de todas las imágenes para los ratones individuales y dividirlos por la suma de los recuentos de células totales de todas las imágenes. </li></ol></li><li> De las mediciones alrededores, determinar la frecuencia de las células rojas, verdes o azules dentro de la distancia seleccionada a partir de células estromales y / o las frecuencias de las células rojas, verdes o azules en la proximidad preferido a los otros tipos de células hematopoyéticas tal como se describe en el paso 4.3 ( véase también resultados representativos, Figura 4). </li></ol> 5. Simulación de Random Médula Ósea Posicionamiento <ol><li> Antes de ejecutar las simulaciones de posicionamiento celular al azar en la médula ósea imágenes histológicas analizadas, preparar los siguientes archivos de antemano: los archivos .csv individuales proporcionados por la herramienta de contacto celular, los archivos .jpg originales para el canal DAPI y los archivos .jpg originales para el canal de estroma. </li><li> Para llevar a cabosimulaciones por lotes en una serie de imágenes (por ejemplo, todas las imágenes de una sección femoral), recogen todos los archivos .jpg originales (_1, _2 y _3) y los archivos .csv individuales correspondientes en una carpeta. NOTA: La herramienta de simulación para el posicionamiento de células de médula ósea al azar está disponible bajo petición. </li><li> Inicie la herramienta de simulación, marque la casilla &quot;Auto-carga de datos de imagen&quot;. NOTA: El programa leerá los recuentos de células y el tamaño medio de celda del archivo .csv automáticamente. Estos valores se muestran en las casillas de &quot;número de teléfono&quot; y &quot;AVG tamaño Cell&quot; (Figura 5). </li><li> Introduzca la etiqueta común para los archivos .csv, es decir, el factor común en sus nombres. Introduce el número de conjuntos de imágenes que se deben utilizar para la simulación en modo batch. </li><li> Cargue el archivo .jpg generada a partir del canal estroma (con el nombre de archivo que termina _3). </li><li> Introduzca los ajustes para la generación de la máscara del canal DAPI: <ol><li> Marque la casilla &quot;? Aplicar máscara &quot;Establecer el umbral para la conversión de la imagen DAPI en una máscara binaria de 10 (rango de 0 - 255). </li><li> Marque la casilla &quot;8 bits?&quot; Marque la casilla &quot;Dilatar?&quot; Y establecer el grado de dilatación de 5 px. Marque la casilla &quot;w / erosión?&quot;. </li><li> Introduzca el valor deseado para el radio de proximidad (radio de vecindad) utilizado para el análisis de las imágenes simuladas. Para una imagen de 708,15 x 708,15 m con un tamaño de 2048 x 2048 px (píxel de escala xy: 0,346 micras), 29 px corresponden a 10 micras. </li></ol></li><li> Marque la casilla &quot;Use Otsu?&quot;, Para usar el algoritmo de Otsu 17 para la detección automática de las estructuras del estroma. NOTA: Este es el mismo algoritmo que se utiliza por la herramienta de contacto y alrededores. Utilizando el mismo algoritmo de segmentación de imágenes en el análisis automatizado de la imagen grabada y la imagen simulada es crucial con el fin de mantener los datos comparable. </li><li> Introduzca los ajustes para las células hematopoyéticas, que are simula como formas circulares. NOTA: Los números de células de glóbulos rojos, verdes, y azules se cargan directamente desde el archivo .csv (véase también el paso 5.6). <ol><li> Utilice la herramienta de simulación para calcular el diámetro medio en px de glóbulos rojos, verdes y azules. Determinar el área promedio de una sola célula como el área total de cada tipo de célula en la imagen en px dividido por el recuento total de células por imagen. Utilice el área de promedio para calcular el radio de un disco utilizando la fórmula. El doble de la radio para determinar el diámetro promedio. </li></ol></li><li> Medir la distribución de tamaño de las células de los tipos celulares analizados con cualquier software de análisis de imágenes que incluye funciones de segmentación de objetos. Determinar σ para todos los tipos de células hematopoyéticas (18 y Figura 5B). NOTA: Puesto que las distribuciones de tamaño celular de las células grabadas no son determinados por el análisis de imágenes automatizado, utilizar una distribución gaussiana como una aproximación de las distribuciones reales. La anchura de tél curva de distribución es descrito por σ y puede ser muy diferente para diversos tipos de células. (Para más detalles, véase la figura 5B). <ol><li> A partir de estas mediciones, determinar el &quot;corte de tamaño de celda&quot;: el diámetro en px que describe el objeto más pequeño todavía reconocida como una célula completa por la herramienta de análisis de imagen. </li></ol></li><li> Introduzca los parámetros en los cuadros de la interfaz gráfica de usuario (Figura 5). <ol><li> Introduzca el tamaño de la celda de corte, es decir, el tamaño de celda mínimo permitido en la simulación, como un diámetro en px. </li><li> Introduzca σ en px para la simulación de la distribución de tamaño de celda para los glóbulos rojos, verdes, y azules (del paso 5.9). </li><li> Marque la casilla &quot;Eliminar&quot; en la subsección &quot;Las células en la máscara&quot;. Con esta configuración, el programa se eligió una nueva posición para una célula si se solapa con al menos un píxel con una zona prohibida de la máscara. Marque la casilla &quot;Evitar solapamiento celular? ̶1; en la &quot;exclusión de la célula&quot; subsección. </li><li> Introduzca la distancia mínima permitida entre los centros de dos células en px. NOTA: La distancia mínima debe ser determinado a partir de las imágenes grabadas. Erróneamente distancias mínimas medidas conducirán a resultados sesgados / artificiales para la comparación de las imágenes grabadas y simulados. </li><li> Ajuste el área máxima de superposición a 100% si el solapamiento se define por la distancia mínima de centro a centro. </li><li> Ajuste la herramienta de simulación para 1000 repeticiones. </li><li> Marque la casilla &quot;células de guardado automático?&quot; Para guardar las coordenadas de los objetos simulados para todas las repeticiones de cada imagen de la hornada como archivos .rect (formato de texto). Marque la casilla &quot;imágenes de guardado automático?&quot; Para guardar un archivo .tiff para cada imagen simulada. Introduzca una etiqueta común para los archivos guardados. NOTA: El &quot;? Células de guardado automático&quot; opción reduce el tiempo de funcionamiento de simulación y el tamaño total de datos, en comparación con al guardar el real ima simuladages. Los archivos .rect guardar las coordenadas de las células simuladas como rectángulos y por lo tanto se pueden convertir en imágenes simuladas si es necesario. </li></ol></li><li> Inicie la simulación haciendo clic en &quot;simulación Ejecutar&quot;. NOTA: La herramienta de simulación genera automáticamente un archivo .csv para los 1.000 simulaciones de cada imagen, incluidos los recuentos de contacto medias y recuentos alrededores de glóbulos rojos, verdes y azules con los glóbulos rojos, verdes, azules, y del estroma para cada conjunto de simulaciones repetidas . Además, para todos estos valores, se proporcionan los promedios de las 1.000 simulaciones con desviación estándar (STD) y el error estándar de la media (SEM). </li><li> Determine el promedio de frecuencias de contacto y frecuencias alrededores de un conjunto de 1.000 imágenes simuladas. Para ello, se divide el contacto media y cuenta alrededores por el recuento de células grabado por imagen. Comparar las frecuencias de los resultados del análisis de co-localización automatizada de la imagen grabada. </li><li> Aplicar Stati adecuadasmétodos stical en función del análisis de 19 (para la figura 7, se utilizó un Wilcoxon de dos colas firmado rank test). </li></ol>

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	<li>Kunisaki, Y., Frenette, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+secrets+of+the+bone+marrow+niche:+Enigmatic+niche+brings+challenge+for+HSC+expansion.">The secrets of the bone marrow niche: Enigmatic niche brings challenge for HSC expansion.</a> Nat Med. 18, 864-865 (2012).</li><li>Morrison, S. J., Scadden, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+marrow+niche+for+haematopoietic+stem+cells.">The bone marrow niche for haematopoietic stem cells.</a> Nature. 505, 327-334 (2014).</li><li>Tokoyoda, K., Egawa, T., Sugiyama, T., Choi, B. I., Nagasawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+niches+controlling+B+lymphocyte+behavior+within+bone+marrow+during+development.">Cellular niches controlling B lymphocyte behavior within bone marrow during development.</a> Immunity. 20, 707-718 (2004).</li><li>Cariappa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perisinusoidal+B+cells+in+the+bone+marrow+participate+in+T-independent+responses+to+blood-borne+microbes.">Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes.</a> Immunity. 23, 397-407 (2005).</li><li>Sapoznikov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+clusters+of+dendritic+cells+provide+critical+survival+signals+to+B+cells+in+bone+marrow+niches.">Perivascular clusters of dendritic cells provide critical survival signals to B cells in bone marrow niches.</a> Nat Immunol. 9, 388-395 (2008).</li><li>Tokoyoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Professional+memory+CD4++T+lymphocytes+preferentially+reside+and+rest+in+the+bone+marrow.">Professional memory CD4+ T lymphocytes preferentially reside and rest in the bone marrow.</a> Immunity. 30, 721-730 (2009).</li><li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+is+a+major+reservoir+and+site+of+recruitment+for+central+memory+CD8++T+cells.">Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells.</a> Immunity. 22, 259-270 (2005).</li><li>Lin, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+4-1BBL+on+radioresistant+cells+in+providing+survival+signals+through+4-1BB+expressed+on+CD8(+)+memory+T+cells+in+the+bone+marrow.">Contribution of 4-1BBL on radioresistant cells in providing survival signals through 4-1BB expressed on CD8(+) memory T cells in the bone marrow.</a> Eur J Immunol. 42, 2861-2874 (2012).</li><li>Zehentmeier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Static+and+dynamic+components+synergize+to+form+a+stable+survival+niche+for+bone+marrow+plasma+cells.">Static and dynamic components synergize to form a stable survival niche for bone marrow plasma cells.</a> Eur J Immunol. 44, 2306-2317 (2014).</li><li>Nagasawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+niches+in+the+bone+marrow+required+for+B-cell+development.">Microenvironmental niches in the bone marrow required for B-cell development.</a> Nat Rev Immunol. 6, 107-116 (2006).</li><li>Luche, H., Weber, O., Nageswara Rao, T., Blum, C., Fehling, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faithful+activation+of+an+extra-bright+red+fluorescent+protein+in+'knock-in'+Cre-reporter+mice+ideally+suited+for+lineage+tracing+studies.">Faithful activation of an extra-bright red fluorescent protein in 'knock-in' Cre-reporter mice ideally suited for lineage tracing studies.</a> Eur J Immunol. 37, 43-53 (2007).</li><li>Schwenk, F., Baron, U., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cre-transgenic+mouse+strain+for+the+ubiquitous+deletion+of+loxP-flanked+gene+segments+including+deletion+in+germ+cells.">A cre-transgenic mouse strain for the ubiquitous deletion of loxP-flanked gene segments including deletion in germ cells.</a> Nucleic Acids Res. 23, 5080-5081 (1995).</li><li>Kawamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+new+adhesive+film+for+the+preparation+of+multi-purpose+fresh-frozen+sections+from+hard+tissues,+whole-animals,+insects+and+plants.">Use of a new adhesive film for the preparation of multi-purpose fresh-frozen sections from hard tissues, whole-animals, insects and plants.</a> Arch Histol Cytol. 66, 123-143 (2003).</li><li>Kawamoto, T., Kawamoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+thin+frozen+sections+from+nonfixed+and+undecalcified+hard+tissues+using+Kawamot's+film+method.">Preparation of thin frozen sections from nonfixed and undecalcified hard tissues using Kawamot's film method.</a> Arch Histol Cytol. 1130 (2012), 149-164 (2012).</li><li>Smith, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+confocal+microscopy.">Basic confocal microscopy.</a> Current protocols in neuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley ... [et al.]. 2 (Unit 2.2), (2001).</li><li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+threshold+selection+method+from+gray-level+histograms.">A threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Trans. Sys., Man., Cyber. 9, 62-66 (1979).</li><li>Hughes, I., Hase, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Measurements and Their Uncertainties: A Practical Guide To Modern Error Analysis. , (2010).</li><li>Quinn, G. P., Keough, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Experimental Design and Data Analysis for Biologists. , (2002).</li><li>Kiel, M. J., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uncertainty+in+the+niches+that+maintain+haematopoietic+stem+cells.">Uncertainty in the niches that maintain haematopoietic stem cells.</a> Nat Rev Immunol. 8, 290-301 (2008).</li><li>MacQueen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+Methods+for+classification+and+Analysis+of+Multivariate+Observations.">Some Methods for classification and Analysis of Multivariate Observations.</a> Proceedings of 5th Berkeley Symposium on Mathematical Statistics and Probability Vol. 1. , 666 (1967).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li><li>Jarjour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+reveals+origin+and+dynamics+of+lymph+node+follicular+dendritic+cells.">Fate mapping reveals origin and dynamics of lymph node follicular dendritic cells.</a> J Exp Med. 211, 1109-1122 (2014).</li><li>Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histo-cytometry:+a+method+for+highly+multiplex+quantitative+tissue+imaging+analysis+applied+to+dendritic+cell+subset+microanatomy+in+lymph+nodes.">Histo-cytometry: a method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes.</a> Immunity. 37, 364-376 (2012).</li><li>Moreau, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+in+situ+cytometry+uncovers+T+cell+receptor+signaling+during+immunological+synapses+and+kinapses+in+vivo.">Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo.</a> Immunity. 37, 351-363 (2012).</li><li>Siffrin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+partially+reversible+th17+cell-induced+neuronal+dysfunction+in+the+course+of+encephalomyelitis.">In vivo imaging of partially reversible th17 cell-induced neuronal dysfunction in the course of encephalomyelitis.</a> Immunity. 33, 424-436 (2010).</li><li>Shen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+SVZ+stem+cells+lie+in+a+vascular+niche:+a+quantitative+analysis+of+niche+cell-cell+interactions.">Adult SVZ stem cells lie in a vascular niche: a quantitative analysis of niche cell-cell interactions.</a> Cell Stem Cell. 3, 289-300 (2008).</li><li>Danielsson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Euclidian+distance+mapping.">Euclidian distance mapping.</a> Computer Graphics and Image Processing. 14, 21 (1980).</li><li>Tellier, J., Kallies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Finding+a+home+for+plasma+cells+-+a+niche+to+survive.">Finding a home for plasma cells - a niche to survive.</a> Eur J Immunol. , (2014).</li><li>Winter, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megakaryocytes+constitute+a+functional+component+of+a+plasma+cell+niche+in+the+bone+marrow.">Megakaryocytes constitute a functional component of a plasma cell niche in the bone marrow.</a> Blood. 116, 1867-1875 (2010).</li><li>Rozanski, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+antibody+responses+depend+on+CD28+function+in+bone+marrow-resident+plasma+cells.">Sustained antibody responses depend on CD28 function in bone marrow-resident plasma cells.</a> J Exp Med. 208, 1435-1446 (2011).</li><li>Rodriguez Gomez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basophils+support+the+survival+of+plasma+cells+in+mice.">Basophils support the survival of plasma cells in mice.</a> J Immunol. 185, 7180-7185 (2010).</li><li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homing+and+adhesion+patterns+determine+the+cellular+composition+of+the+bone+marrow+plasma+cell+niche.">Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche.</a> J Immunol. 188, 1283-1291 (2012).</li><li>Kohler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G-CSF-mediated+thrombopoietin+release+triggers+neutrophil+motility+and+mobilization+from+bone+marrow+via+induction+of+Cxcr2+ligands.">G-CSF-mediated thrombopoietin release triggers neutrophil motility and mobilization from bone marrow via induction of Cxcr2 ligands.</a> Blood. 117, 4349-4357 (2011).</li></ol>

Juan Escribano Navarro is affiliated with Wimasis GmbH, Munich, Germany. The other authors have no conflicts of interest to declare.

A pesar de los avances en los métodos modernos de imagen óptica, el análisis de los datos histológicos se sigue a menudo obstaculizada por la falta de herramientas de cuantificación y métodos adecuados, o por los análisis parciales que se centran en una pequeña área de interés. El enfoque sinérgico se presenta aquí combina análisis de imagen que cubre la región entera de la médula ósea, la segmentación automática y reconocimiento de objetos de diversos tipos de células hematopoyéticas y del estroma, ...

Debido a los rápidos avances tecnológicos recientes en microscopía, incluyendo imágenes ópticas, el análisis de las células dentro del contexto de todo el tejido se ha convertido cada vez más accesible para los inmunólogos. La caracterización de las células individuales en suspensión representa un método valioso e indispensable para entender la función celular y molecular. Sin embargo, el análisis de las células dentro de su (micro) -anatomical medio ambiente es esencial para la comprensión de las interacciones entre los diversos tipos de células que colaboran en procesos complejos, tales como el desarrollo de respuestas inmunes. Si bien es relativamente fácil para los microscopistas para obtener información cualitativa de las imágenes, sigue siendo un desafío para cuantificar estos datos, en parte debido al hecho de que los métodos de análisis en este campo se están quedando atrás en comparación con lo que es posible en la adquisición de imágenes. Muchos investigadores todavía dependen de tiempo de conteo manual de células en sus imágenes de histología,introduciendo así un sesgo entre los diferentes evaluadores y dificultando la replicación por otros grupos. A menudo, se elige una imagen representativa para subrayar una declaración sobre la posición celular o co-localización en una publicación, por lo que es difícil para el lector a juzgar la relevancia estadística de tal evento. Junto con el hecho de que el contenido de la información completa de los datos de la imagen raramente explotado, esto pone de relieve la necesidad de un enfoque más imparcial, rápido y completo para analizar imágenes histológicas. La médula ósea es un tejido complejo, que lleva en funciones vitales importantes como el órgano de la hematopoyesis en los vertebrados adultos. Además de ser el lugar de nacimiento de las células hematopoyéticas 1,2 y jugar un papel importante en el desarrollo de linfocitos B 3, que también actúa como un sitio donde se inician 4 reacciones inmunes y apoya, células B maduras recirculación 5. Además, su papel en el mantenimiento imemoria mmunological cada vez más valorada en la última década, ya que se han encontrado varios tipos de células que constituyen la memoria inmune a residir allí 6-9. La relación entre el complejo de la arquitectura del tejido de la médula ósea y sus funciones siguen siendo difícil de alcanzar. A diferencia de los órganos linfoides secundarios, que se organizan en la macro-departamentos, tales como zonas de células T y B, la médula ósea carece de una clara macro-compartimentación. Hasta ahora distintos compartimentos en la médula ósea se definen por su proximidad a la corteza del hueso o de la vasculatura. La importancia de las distintas poblaciones de células del estroma residentes en la médula ósea por una serie de procesos tales como las células madre de apoyo, el desarrollo de las células B o el mantenimiento de las poblaciones de células de memoria inmunes (tales como células de plasma de larga vida (PCs), CD4 + y CD8 + células T de memoria) indica claramente que existe un cierto grado de micro-compartimentación en la médula ósea. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Estas observaciones han llevado al concepto de nichos microanatómicos distintas, que se especializan en ciertas funcionalidades (células madre de mantenimiento, desarrollo de las células B en varias etapas, y el mantenimiento de la memoria inmunológica) en la médula ósea. Aunque parece que hay un cierto grado de heterogeneidad entre los nichos que sirven para diferentes funciones, algunos de los factores producidos por las células del estroma, como-CXC quimiocinas ligando 12 (CXCL12) o interleucina 7 (IL-7), son componentes cruciales para varios de estos nichos 10. La visualización y caracterización de células estromales en la médula ósea es difícil debido a sus características morfológicas con largos, las extensiones dendríticas delgada que forma una red a lo largo de la médula ósea, y la falta de marcadores apropiados para discriminar subpoblaciones estromales. Aún no está claro hasta qué punto estos nichos tienen características comunes con respecto a su compositio celular y molecularn, y qué elementos hacen que un determinado nicho único. Además de las células del estroma, se ha demostrado tipos de células hematopoyéticas a desempeñar un papel crucial al proporcionar ciertas señales al menos para algunos de los nichos. Claramente, la complejidad de la composición nicho requiere su análisis in situ, y se ha convertido cada vez más importante para los inmunólogos y hematólogos para hacer un zoom en la microarquitectura ósea de hueso, por ejemplo, mediante el análisis de las relaciones espaciales entre sus componentes celulares. Aquí, una estrategia para cuantificar las relaciones co-localización y vecinales celulares en la médula ósea de una forma automática e imparcial se presenta. Un flujo de trabajo detallada, incluyendo la generación de ratones quiméricos, que alberga las células fluorescentes del estroma y células hematopoyéticas no fluorescentes, la preparación de las secciones histológicas de los huesos sin descalcificar, adquisición de imágenes confocales que cubren todo el hueso, así como el análisis de imágenes automatizado de c celularo-localización y su validación / discriminación de colocación al azar por una herramienta de simulación se proporciona (Figura 8).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1864">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:155px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:1200px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Neomycin</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">N6386 SIGMA</td>
			<td>Neomycin trisulfate salt hydrate, EU hazard code: GHS08; www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:365px;">Ursovit AD3EC</td>
			<td style="width:145px;">Serumwerke Bernburg</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>1 ml contains: 50.000 I.E retinyl palmitate,&#160; 5.000 I.E. cholecalciferol, 30 mg tocopheryl acetate, 100 mg ascorbic acid, 1 mg sorbic acid, 200 mg polyoxyl 35 castor oil, 0,5 mg propyl gallate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:365px;">Transfer buffer (100ml PBS, 1ml 1M HEPES, 50U/ml Penicillin/Streptomycin)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">P4333&#160;&#160; Sigma&#160;&#160;&#160;&#160; H3375&#160;&#160; Sigma&#160;&#160;</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:365px;">4-Hydroxy-3-nitrophenylacetyl hapten conjugated to chicken gamma globulin)</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Chicken gamma globulin (CGG) 100 mg</td>
			<td style="width:145px;">Rockland</td>
			<td style="width:155px;">D602-0100</td>
			<td>www.rockland-inc.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">20 % Paraformaldehyde solution (EM-grade)</td>
			<td style="width:145px;">Science Services</td>
			<td style="width:155px;">15713</td>
			<td>EU hazard codes: GHS02, GHS05, GHS07, GHS08</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">D(+)-Sucrose</td>
			<td style="width:145px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:155px;">4621.1</td>
			<td>www.carlroth.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Dry ice</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:365px;">Acetone</td>
			<td style="width:145px;">Sigma.Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">179124 SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>EU hazard codes: GHS02, GHS07; www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:365px;">Hexane</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:155px;">208752 SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>EU hazard codes: GHS02, GHS07, GHS08, GHS09; www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Tissue-Tek cryomolds (standard)</td>
			<td style="width:145px;">Sakura&#160;</td>
			<td style="width:155px;">4557</td>
			<td>25 x 20 x 5 mm; www.sakuraus.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Tissue-Tek O.C.T.</td>
			<td style="width:145px;">Sakura&#160;</td>
			<td style="width:155px;">4583</td>
			<td>&#160;www.sakuraus.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Kawamoto&#39;s SCEM embedding medium</td>
			<td style="width:145px;">Section-Lab, JP</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>http://section-lab.jp/index.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Kawamoto&#39;s cryosection preparation kit&#160;</td>
			<td style="width:145px;">Section-Lab, JP</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>http://section-lab.jp/index.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Kawamoto&#39;s cryofilm type 2C(9)</td>
			<td style="width:145px;">Section-Lab, JP</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>http://section-lab.jp/index.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Microtome blade MX35 Premier Plus, Low Profile</td>
			<td style="width:145px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:155px;">3052835</td>
			<td>L X W: 80 x 8 mm (31.5 x 3.13&#34;), thickness: 0.25 mm (0.01&#34;);www.thermoscientific.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">polyclonal rabbit anti-RFP antibody, biotinylated</td>
			<td style="width:145px;">Rockland</td>
			<td style="width:155px;">600-406-379</td>
			<td>www.rockland-inc.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Alexa Fluor 555 streptavidin</td>
			<td style="width:145px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:155px;">S-32355</td>
			<td>www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">rat anti-MBP</td>
			<td style="width:145px;">J. and N. Lee</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>available from: J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ , U.S.A., clone MT-14.7</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">goat anti-rat-Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:145px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:155px;">A-21247</td>
			<td>www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">rat anti-B220 - Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>produced and coupled in-house (DRFZ), clone RA3.6B2, Alexa Fluor 594 from Life Technologies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">mouse anti-l1 light chain -FITC</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>produced and coupled in-house (DRFZ), clone LS136</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">rat anti-k light chain - FITC</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>produced and coupled in-house (DRFZ), clone 187.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">DAPI (4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma</td>
			<td style="width:155px;">D9542 SIGMA</td>
			<td>www.sigmaaldrich.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Fluorescent mounting medium</td>
			<td style="width:145px;">DAKO</td>
			<td style="width:155px;">S3023</td>
			<td>www.dako.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Cover slips (24mm x 24mm x 0.13-0.16 mm)</td>
			<td style="width:145px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:155px;">H875.2</td>
			<td>www.carlroth.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Superfrost slides glasses (75 mm x 25 mm)</td>
			<td style="width:145px;">VWR</td>
			<td style="width:155px;">48311-703</td>
			<td>www.vwr.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Laser scanning confocal microscope&#160;</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>equipped with laser lines of 405, 488, 561, 594, 633 nm and a 20x/0.8 NA air objective lens; We used a Zeiss LSM710 and Zen 2010 Version 6.0 software.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Automated image analysis tools for bone marrow</td>
			<td style="width:145px;">Wimasis, Munich</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>The cell contact tool and cell vicinity tool will be made available by Wimasis upon request: www.wimasis.de</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VC2012 Runtime</td>
			<td style="width:145px;">Microsoft</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>free download: http://www.microsoft.com/en-us/download/details.aspx?id=30679</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Simulation tool for random cell positioning</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>available from us, upon request</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:365px;">Image analysis software with image segmentation functions</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>We used Volocity (Perkin Elmer) for measuring cell size distributions of hematopoietic cell types in bone marrow (Figure 5). Alternatives are Definiens Image Analysis (Definiens) or Cell Profiler (free download: http://www.cellprofiler.org)&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Fiji image analysis software&#160;</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td>free download: http://fiji.sc/Fiji. Fiji was used by trained raters for manual cell count (Figure 3).</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated quantification of hematopoietic cell &#8211; stromal cell interactions in histological images of undecalcified bone

La microscopía confocal es el método de elección para el análisis de la localización de múltiples tipos de células dentro de los tejidos complejos, tales como la médula ósea. Sin embargo, el análisis y la cuantificación de la localización celular es difícil, ya que en muchos casos se basa en el recuento manual, teniendo así el riesgo de introducir un sesgo rater-dependiente y la reducción de la fiabilidad entre. Por otra parte, a menudo es difícil juzgar si la co-localización entre dos células resultados de posicionamiento aleatorio, especialmente cuando los tipos de células se diferencian fuertemente en la frecuencia de su ocurrencia. Aquí, se introduce un método para la cuantificación insesgada de co-localización celular en la médula ósea. El protocolo describe la preparación de la muestra utilizado para obtener secciones histológicas de los huesos largos murinos enteros incluyendo la médula ósea, así como el protocolo de tinción y la adquisición de imágenes de alta resolución. Un flujo de trabajo de análisis que abarca desde el reconocimiento de hematopoyéticas y no hemattipos de células opoietic en imágenes de la médula ósea de 2 dimensiones (2D) a la cuantificación de los contactos directos entre esas células se presenta. Esto también incluye un análisis de vecindad, para obtener información sobre el microambiente celular que rodea a un determinado tipo de célula. Con el fin de evaluar si co-localización de dos tipos de células es el mero resultado de posicionamiento celular aleatoria o refleja asociaciones preferenciales entre las células, una herramienta de simulación que es adecuado para probar esta hipótesis en el caso de hematopoyéticas, así como las células del estroma, es se utiliza. Este enfoque no se limita a la médula ósea, y se puede ampliar a otros tejidos para permitir reproducible análisis, cuantitativa de los datos histológicos.

Cortar cryosections de hueso sin descalcificar con el método de la cinta Kawamoto permite todo el hueso a cortar como una sección intacta, con la médula ósea de la región endóstica todavía unido al hueso mineralizado, tanto en la diáfisis, así como en las áreas epifisarias con su alta densidad del hueso trabecular (Figura 1). Tinción nuclear de las secciones revela que aunque pequeñas grietas en la preparación no se pueden evitar totalmente, la estructura de los sinusoides y arterias, así ...

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Automated Quantification of Hematopoietic Cell &amp;#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

Automatizado Cuantificación de células hematopoyéticas - Interacciones de células del estroma en histológicas Imágenes de descalcificados Hueso

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

automated-quantification-hematopoietic-cell-stromal-cell-interactions

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

11.5K vistas.  German Rheumatism Research Center, a Leibniz Institute. A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

Video: Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations

The ability to measure stem cell mutations is a powerful tool to quantify in a critical cell population if, and to what extent, a chemical can induce mutations that potentially lead to cancer. The use of an enzymatic assay to quantify stem cell mutations in the X-linked glucose-6-phosphate dehydrogenase gene has been previously reported.1 This method requires the preparation of frozen sections and incubation of the sectioned tissue with a reaction mixture that yields a blue color if the cells produce functional glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) enzyme. If not, the cells appear whitish. We have modified the reaction mixture using Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) medium in place of polyvinyl alcohol. This facilitates pH measurement, increases solubilization of the G6PD staining components and restricts diffusion of the G6PD enzyme. To demonstrate that a mutation occurred in a stem cell, the entire crypt must lack G6PD enzymatic activity. Only if a stem cell harbors a phenotypic G6PD mutation will all of the progeny in the crypt lack G6PD enzymatic activity. To identify crypts with a stem cell mutation, four consecutive adjacent frozen sections (a level) were cut at 7 &#181;m thicknesses. This approach of making adjacent cuts provides conformation that a crypt was fully mutated since the same mutated crypt will be observed in adjacent sections. Slides with tissue samples that were more than 50 &#181;m apart were prepared to assess a total of &#62;104 crypts per mouse. The mutation frequency is the number of observed mutated (white) crypts &#247; by the number of wild type (blue) crypts in a treatment group.

We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

La cuantificación de la madre del colon mutaciones celulares

The ability to measure stem cell mutations is a powerful tool to quantify in a critical cell population if, and to what extent, a chemical can induce ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to reestablish blood cell production for the lifespan of the recipient. This protocol explains how to set up a functional assay to compare the HSC capacities of two different populations of cells, such as bone marrow from mice of two different genotypes, and how to analyze the recipient mice by flow cytometry. The protocol uses HSC equivalents rather than cell sorting for standardization and discusses the advantages and disadvantages of both approaches. We further discuss different variations to the basic protocol, including serial transplants, limiting dilution assays, homing assays and non-competitive transplants, including the advantages and preferred uses of these varied approaches. These assays are central for the study of HSC function and could be used not only for the investigation of fundamental HSC intrinsic aspects of biology but also for the development of preclinical assays for bone marrow transplant and HSC expansion in culture.

This protocol provides step-by-step guidelines for setting up competitive mouse bone marrow transplant experiments to study hematopoietic stem/progenitor cell function without prior purification of stem cells by cell sorting.

Los trasplantes competitivos para Evaluar la aptitud de Células Madre Hematopoyéticas

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the "segmentation clock," acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as "kymographs," for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.

The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

Ordenamiento temporal de los datos de expresión dinámica de la expresión espacial detallada Mapas

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

Una nueva técnica de trasplante de grasa mamaria para visualizar la generación de vasos de células madre endoteliales vasculares

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Bioingeniería de los microambientes humanizados de la médula ósea en el ratón y su visualización por imágenes en directo

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide suffering from corneal vision loss1. To address the demand for viable human corneas, significant progress in three-dimensional (3D) tissue engineering has been made2,3,4. These cornea models range from simple monolayer systems to multilayered models, leading to 3D full-thickness corneal equivalents2.
However, the use of a 3D tissue-engineered cornea in the context of in vitro disease models studied to date lacks resemblance to the multilayered 3D corneal tissue structure, function, and the networking of different cell types (i.e., nerve, epithelium, stroma, and endothelium)2,3. In addition, the demand for in vitro cornea tissue models has increased in an attempt to reduce animal testing for pharmaceutical products. Thus, more sophisticated models are required to better match systems to human physiological requirements, and the development of a model that is more relevant to the patient population is absolutely necessary. Given that multiple cell types in the cornea are affected by diseases and dystrophies, such as Keratoconus, Diabetic Keratopathy, and Fuchs, this model includes a 3D co-culture model of primary human corneal fibroblasts (HCFs) from healthy donors and neurons from the SH-SY5Y cell line. This allows us for the first time to investigate the interactions between the two cell types within the human corneal tissue. We believe that this model could potentially dissect the underlying mechanisms associated with the stromal-nerve interactions of corneal diseases that exhibit nerve damages. This 3D model mirrors the basic anatomical and physiological nature of the corneal tissue in vivo and can be used in the future as a tool for investigating corneal defects as well as screening the efficacy of various agents before animal testing.

Corneal Tissue Engineering: An In Vitro Model of the Stromal-nerve Interactions of the Human Cornea

This protocol describes a novel three-dimensional in vitro model, where corneal stromal cells and differentiated neuronal cells are cultured together to assist in the examination and understanding of the interactions of the two cell types.

Ingeniería del tejido fino córneo: Un In Vitro modelo de las interacciones estroma-nervio de la córnea humana

Tissue engineering has gained substantial recognition due to the high demand for human cornea replacements with an estimated 10 million people worldwide ...

A RANKL-based Osteoclast Culture Assay of Mouse Bone Marrow to Investigate the Role of mTORC1 in Osteoclast Formation

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result in a series of bone metabolic diseases, including osteoporosis. To develop pharmaceutical targets for the prevention of pathological bone mass loss, the mechanisms by which osteoclasts differentiate from precursors must be understood. The ability to isolate and culture a large number of osteoclasts in vitro is critical in order to determine the role of specific genes in osteoclast differentiation. Inactivation of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 (TORC1) in osteoclasts can decrease osteoclast number and increase bone mass; however, the underlying mechanisms require further study. In the present study, a RANKL-based protocol to isolate and culture osteoclasts from mouse bone marrow and to study the influence of mTORC1 inactivation on osteoclast formation is described. This protocol successfully resulted in a large number of giant osteoclasts, typically within one week. Deletion of Raptor impaired osteoclast formation and decreased the activity of secretory tartrate-resistant acid phosphatase, indicating that mTORC1 is critical for osteoclast formation.

This manuscript describes a protocol to isolate and culture osteoclasts in vitro from mouse bone marrow, and to study the role of the mammalian/mechanistic target of rapamycin complex 1 in osteoclast formation.

Una base de RANKL osteoclasto cultura ensayo de médula ósea de ratón para investigar el papel de mTORC1 en la formación de osteoclastos

Osteoclasts are unique bone-resorbing cells that differentiate from the monocyte/macrophage lineage of bone marrow. Dysfunction of osteoclasts may result ...

Single-Cell Quantification of Protein Degradation Rates by Time-Lapse Fluorescence Microscopy in Adherent Cell Culture

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used approaches to determine protein half-life are either limited to population averages from lysed cells or require the use of protein synthesis inhibitors. This protocol describes a method to measure protein half-lives in single living adherent cells, using SNAP-tag fusion proteins in combination with fluorescence time-lapse microscopy. Any protein of interest fused to a SNAP-tag can be covalently bound by a fluorescent, cell permeable dye that is coupled to a benzylguanine derivative, and the decay of the labeled protein population can be monitored after washout of the residual dye. Subsequent cell tracking and quantification of the integrated fluorescence intensity over time results in an exponential decay curve for each tracked cell, allowing for determining protein degradation rates in single cells by curve fitting. This method provides an estimate for the heterogeneity of half-lives in a population of cultured cells, which cannot easily be assessed by other methods. The approach presented here is applicable to any type of cultured adherent cells expressing a protein of interest fused to a SNAP-tag. Here we use mouse embryonic stem (ES) cells grown on E-cadherin-coated cell culture plates to illustrate how single cell degradation rates of proteins with a broad range of half-lives can be determined.

This protocol describes a method to determine protein half-lives in single living adherent cells, using pulse labeling and fluorescence time-lapse imaging of SNAP-tag fusion proteins.

Sola célula cuantificación de las tasas de degradación de proteína por microscopia de fluorescencia Time-lapse en cultivo de células adherentes

Proteins are in a dynamic state of synthesis and degradation and their half-lives can be adjusted under various circumstances. However, most commonly used ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

Análisis clonal de precursores de células madre hematopoyéticas embrionarias usando índice célula clasificación combinada con células endoteliales nicho cultura Co

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood cytopenias, dysplasia, and a propensity for transformation to acute leukemia. NUP98-HOXD13 (NHD13) transgenic mice recapitulate human MDS in terms of peripheral blood cytopenias, dysplasia, and transformation to acute leukemia. We previously demonstrated that MDS could be transferred from a genetically engineered mouse with MDS to wild-type recipients by transplanting MDS bone marrow nucleated cells (BMNC). To more clearly understand the MDS cell of origin, we have developed approaches to transplant specific, immunophenotypically defined hematopoietic subsets. In this article, we describe the process of isolating and transplanting specific populations of hematopoietic stem and progenitor cells. Following transplantation, we describe approaches to assess the efficiency of transplantation and persistence of the donor MDS cells.

We describe the use of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) to assess the malignant potential of genetically engineered hematopoietic cells. HSCT is useful for evaluating various malignant hematopoietic cells in vivo as well as generating a large cohort of mice with myelodysplastic syndromes (MDS) or leukemia to evaluate novel therapies.

Uso de trasplante de células madre hematopoyéticas para evaluar el origen del síndrome mielodisplásico

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...