Los autores no tienen reconocimientos.

Los procedimientos experimentales y el tratamiento ético de los animales fue aprobado por la Universidad de Pittsburgh IACUC (protocolo # 1104674). 1. Preparación de G6PD tinción Mezcla NOTA: Asegúrese de que la concentración final de cada uno de los reactivos es el siguiente; 5 mM de glucosa-6-fosfato (G6P); 2 mM NADP, 5 mM de MgCl 2, NBT 0,35 mM mM 1-metoxi-5-metilfenazinio sulfato de metilo (MMPMS) y 0.8. 1,8,9 Para cada reactivo de la concentración inicial fue derivada por unos 40 ml de volumen final. Soluciones estaban recién preparados y utilizados cada día. <ol><li> Añadir 2 ml de 200 mM pH 7,4 tampón fosfato (PB) a 35 ml de medio de octubre en un tubo de 50 ml y agitar vigorosamente. Confirmar con papel de pH que la solución es ~ pH 7,4. Si no descarta la solución. </li><li> Añadir 61 mg G6P disolvió en 0,94 ml de PB 200 mM, 61 mg NADP disolvió en 0,94 ml de PB 200 mM, y 41 mg de MgCl 2 disolvió en 0,96 ml de 100 mM PB. Reconfirmar que el pH es de ~ 7.4 ingenioh papel pH. Si no ~ 7.4, deseche la solución. </li><li> Añadir 5 mg de MMPMS disueltos en 0,25 ml de PB 200 mM (pH 7,4). Agite la mezcla de reacción resultante para generar una clara homogeneizado rojo oscuro. Si la solución es turbia, la mezcla debe ser desechada. El tubo que contiene la mezcla de reacción se envuelve en papel de aluminio para minimizar la exposición a la luz. Almacenar la mezcla de reacción a RT mientras que el componente final, NBT, se prepara. </li><li> Preparar separadamente una solución 5 mM NBT mediante la adición de 0,4 ml de formamida de dimetilo anhidra (DMF) y 0,4 ml de etanol anhidro a 164 mg de NBT en un tubo de 2 ml con una tapa de junta tórica. Cierre la tapa sin apretar (no cerrado herméticamente) y llevar la solución a ebullición vigorosa en un baño de aceite hasta que el NBT está en solución. 8 </li><li> Deje que el solubilizado NBT se enfríe a temperatura ambiente y luego poner todo de la solución a la mezcla de reacción octubre y agitar enérgicamente hasta obtener una solución clara. Observe el cambio de color de la solución de color naranja-rojo inicial a un color rojo oscuro o purpde color le paso del tiempo. Esto es normal. </li><li> Coloque la mezcla final tinción G6PD en un 37 ° C cálido ambiente durante 1 hora antes de su uso. </li></ol> 2. Tratamiento de Animales y Tejidos Colección <ol><li> Tratar a 6 semanas de edad C57BL / 6 ratones machos con el agente que daña el ADN, por ejemplo, 10 mg / kg azoximetano (AOM) en un volumen de 200 l de PBS mediante inyección ip. Tratar a los ratones de control con 200 l de PBS por inyección ip. </li><li> A los 90 días, la eutanasia a los ratones por asfixia de CO 2 seguido por dislocación cervical aprobadas por protocolo de IACUC. </li><li> Abrir quirúrgicamente la cavidad abdominal desde justo por encima del ano a la base del esternón. Mueva el intestino delgado de la cavidad del cuerpo, pero no extirparlo. Extirpar el intestino inferior justo por debajo del ciego hasta el recto. 10 </li><li> Cortar cuidadosamente a lo largo de un lado del colon utilizando una tijera micro-disección y eliminar las heces en el colon abierto por lavado con PBS estéril limpio. Rodillo suizo del impuesto especiald colon con el lado luminal hacia afuera, y colocar en un molde de tejido. 10 </li><li> Sumerja completamente los dos puntos en octubre medio y lugar molde en un Dewar que contiene líquido N 2. Mantenga el molde de manera que la base de plástico es sólo en contacto con el líquido 2 N hasta que el medio PTU sólido congelado. </li><li> Guarde el bloque de tejido congelado a -80ºC hasta cortar secciones congeladas. No utilice ningún fijador, que daría lugar a la inactivación de la enzima G6PD. </li></ol> 3. Preparación de las secciones congeladas <ol><li> Los cortes de secciones de tejido congelado en un espesor de 7 micras usando un criostato a -25 ° C. Cortar 4 consecutivos 7 micras secciones y colocar dos de ellos en la misma diapositiva (Figura 1). Prepare 2 toboganes, o cuatro consecutivos 7 micras secciones para representar un nivel del colon (Figura 1). </li><li> Repita para el siguiente nivel con una distancia mínima de&gt; 50 m desde el último tramo de la prnivel evious. Esta distancia se aseguró de que las criptas evaluados para cada nivel no se duplican entre sí. </li><li> Limpie con frecuencia la cuchilla criostato con etanol 100% para eliminar el residuo OCT se acumula durante el corte. Antes de seccionamiento se reanuda, la hoja seca se limpia con una hoja de pelo antiestático para disipar la carga estática acumulada. Diapositivas de las tiendas con las secciones congeladas a -80 ° C </li></ol> 4. La tinción de cortes congelados de tejido <ol><li> Realice la reacción de la enzima histoquímica en un 37 ° C ambiente cálido, con alta humedad. NOTA: Si se intenta la reacción enzimática en un horno de incubación o en un calentador de diapositivas llevó a las manchas G6PD pobre e inconsistente. </li><li> Construir pozos para tinción de tejidos utilizando dos 1.5 cm x arandelas de acero de 0,15 cm (interior de diámetro x altura) que están unidos entre sí mediante grasa de silicona (Figura 1). Cortar la parafina para adaptarse a la base del pozo con el centro cortado y bien el lugard sobre la sección de tejido en la diapositiva. NOTA: El Parafilm en la parte inferior de la arandela crea un sello entre la corredera y la arandela que mantiene la mezcla viscosa tinción G6PD en la sección de tejido. Esta construcción da un pozo con una 0,4 - 0,5 ml de volumen de modo que cada sección de tejido en el estudio recibe el mismo volumen de la mezcla de reacción de tinción G6PD. </li><li> Incubar los portaobjetos de tejido congelado a 37 ° C en una habitación caliente durante 10 minutos. A los 37 ° C, añadir la mezcla de reacción de tinción G6PD a cada sección de tejido bien (2 secciones por diapositiva) de 45 a 50 min. Retire los portaobjetos de la habitación caliente, y levante con cuidado los pozos de acero inoxidable fuera de las diapositivas. </li><li> Diapositivas Set en su borde largo para permitir que el medio de reacción se drene. Colocar los portaobjetos en mM PB 100 (pH 7,4) durante 30-60 min para eliminar la mezcla de reacción de tinción G6PD del tejido sin perturbar la tinción de tejidos. Sumergir los portaobjetos en agua destilada durante 5 a 10 minutos para eliminar las sales PB </li><li> Sellar el tejido mediante adding fluoro-gel a partir de un cuentagotas sobre el tejido y esperando ~ 30 min para que se seque. Evite las burbujas que pueden confundir la identificación de las criptas mutados. NOTA: Si se forman burbujas, el procedimiento se puede repetir después de la eliminación de la fluoro-gel por inmersión en agua destilada. No utilice cubreobjetos ya que tienden a atrapar burbujas de aire. </li></ol> 5. Determinación de G6PD mutante Criptas y Mutación Frecuencia <ol><li> Analizar toboganes para G6PD criptas mutantes bajo un microscopio óptico. NOTA: Los criterios utilizados para identificar una cripta completamente mutante fueron: (i) toda la cripta carecía del color azul; (ii) la estructura exterior de la cripta estaba intacta, (iii) la cripta mutante fue observado en secciones adyacentes 7 micras y, (iv) dos observadores tenían que identificar la misma cripta como un mutante. Los mutantes observados en adyacentes 7 micras secciones se cuentan como un mutante. </li><li> Imagen cada cripta mutante G6PD a 40 aumentos y catalogar las imágenes mediante una cámara de 5,0 megapíxeles consoftware de imágenes. </li><li> Cuantificar el número total de criptas examinados en un ratón mediante la selección de una sección representativa para cada ratón desde el nivel con el área de superficie más pequeña y la imagen es un aumento de 10x (Figura 1C). NOTA: Un nivel representa cuatro consecutivos 7 micras secciones (Figura 1D), que debido a su proximidad a menudo muestran mutados criptas en más de una sección. Los niveles están separados por&gt; 50 micras para visualizar criptas de diferentes áreas de los dos puntos. </li><li> Abra cada archivo de imagen y contar visualmente el número de criptas en un nivel mediante el análisis de los archivos (que se muestran como cuadros en la Figura 1C). Imágenes archivos varían en el número de criptas observados desde un mínimo de 20 a&gt; 300 criptas en un solo archivo. </li><li> Multiplicar el número total de criptas desde el nivel seleccionado (Figura 1C) para cada ratón por el número de niveles seleccionados para criptas mutantes G6PD para cada colon. Por ejemplo, un recuento total de1,250 criptas por nivel seleccionado multiplicado por 8 niveles seleccionados para criptas mutantes es igual a un recuento total de 10.000 criptas. Evaluar un mínimo de 10.000 criptas por cada dos puntos para el análisis estadístico. </li><li> Combinar el número de mutantes observados en todos los animales por el número total de criptas seleccionados para calcular la MF para cada tratamiento. El nivel de MF de células madre de fondo en los ratones no tratados es &lt;0.1x10 -4 (Tabla 1), que es similar a la reportada previamente en ratones C57BL / 6. 11 </li></ol>

<ol>
	<li>Griffiths, D. F., Davies, S. J., Williams, S., Williams, G. T., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+somatic+mutation+and+colonic+crypt+clonality+by+X-linked+enzyme+histochemistry.">Demonstration of somatic mutation and colonic crypt clonality by X-linked enzyme histochemistry.</a> Nature. 333 (6172), 461-463 (1988).</li><li>Griffiths, D. F., Sacco, P., Williams, G. T., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clonal+origin+of+experimental+large+bowel+tumours.">The clonal origin of experimental large bowel tumours.</a> Br. J. Cancer. 59 (3), 385-387 (1989).</li><li>Kuraguchi, M., Thomas, G. A., Williams, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutation+of+the+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+(g6pd)+gene+in+colonic+stem+cells+and+crypt+restricted+loss+of+G6PD+activity.">Somatic mutation of the glucose-6-phosphate dehydrogenase (g6pd) gene in colonic stem cells and crypt restricted loss of G6PD activity.</a> Mutat. Res. 379 (1), (1997).</li><li>Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyvinyl+alcohol+and+other+tissue+protectants+in+enzyme+histochemistry:+a+consumer&#8217;s+guide.">Polyvinyl alcohol and other tissue protectants in enzyme histochemistry: a consumer&#8217;s guide.</a> Histochem. J. 21 (7), 373-379 (1989).</li><li>Giardina Rosenberg, D. W., C, T., Tanaka, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+the+study+of+colon+carcinogenesis.">Mouse models for the study of colon carcinogenesis.</a> Carcinogenesis. 30 (2), 183-196 (2009).</li><li>Tanaka, T., Kohno, H., Suzuki, R., Yamada, Y., Sugie, S., Mori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+inflammation-related+mouse+colon+carcinogenesis+model+induced+by+azoxymethane+and+dextran+sodium+sulfate.">A novel inflammation-related mouse colon carcinogenesis model induced by azoxymethane and dextran sodium sulfate.</a> Cancer Sci. 94 (11), 965-973 (2003).</li><li>Suzuki, R., Kohno, H., Sugie, S., Tanaka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-dependent+promoting+effect+of+dextran+sodium+sulfate+on+mouse+colon+carcinogenesis+initiated+with+azoxymethane.">Dose-dependent promoting effect of dextran sodium sulfate on mouse colon carcinogenesis initiated with azoxymethane.</a> Histol. Histopathol. 20 (2), 483-492 (2005).</li><li>Frederiks, W. M., Vreeling-Sindalarova, H., Van Noorden, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+peroxisomes+causes+oxygen+insensitivity+of+the+histochemical+assay+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+to+detect+cancer+cells.">Loss of peroxisomes causes oxygen insensitivity of the histochemical assay of glucose-6-phosphate dehydrogenase activity to detect cancer cells.</a> J. Histochem. Cytochem. 55 (2), 175-181 (2007).</li><li>Hisada, R., Yagi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1-Methoxy-5-methylphenazinium+methyl+sulfate.">1-Methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate.</a> Biochem. 82 (5), 1469-1473 (1977).</li><li>Whittem, C. G., Williams, A. D., Williams, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+Colitis+modeling+using+Dextran+Sulfate+Sodium+(DSS).">Murine Colitis modeling using Dextran Sulfate Sodium (DSS).</a> J Vis Exp. (35), (2010).</li><li>Kuraguchi, M., Cook, H., Williams, E. D., Thomas GA, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+susceptibility+to+colonic+stem+cell+somatic+mutation+in+three+strains+of+mice.">Differences in susceptibility to colonic stem cell somatic mutation in three strains of mice.</a> J. Pathol. 193 (4), 517-521 (2001).</li><li>Whetstone, R. D., Gold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cells+Enhance+Stem+Cell+Mutagenesis+in+the+Mouse+Colon.">T-Cells Enhance Stem Cell Mutagenesis in the Mouse Colon.</a> Mutat. Res. 744, 1-5 (2015).</li><li>Van Noorden, C. J., Vogel, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histochemistry+and+cytochemistry+of+glucose-6-phosphate+dehydrogenase.">Histochemistry and cytochemistry of glucose-6-phosphate dehydrogenase.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 15 (4), 1-85 (1985).</li><li>Van Noorden, C. J., Vogels, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+cytochemical+staining+method+for+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+activity+in+individual+erythrocytes.+II.+Further+improvements+of+the+staining+procedure+and+some+observations+with+glucose-6-phosphate+dehydrogenase+deficiency.">A sensitive cytochemical staining method for glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in individual erythrocytes. II. Further improvements of the staining procedure and some observations with glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency.</a> Br. J. Haematol. 60 (1), 57-63 (1985).</li><li>Cook, H. A., Williams, D., Thomas, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crypt-restricted+metallothionein+immunopositivity+in+murine+colon:+validation+of+a+model+for+studies+of+somatic+stem+cell+mutation.">Crypt-restricted metallothionein immunopositivity in murine colon: validation of a model for studies of somatic stem cell mutation.</a> J. Pathol. 191 (3), 306-312 (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

A menudo, el efecto genotóxico de un compuesto se determina por su capacidad de modificar el ADN. Esto se hace normalmente aislando el tejido y midiendo el nivel global de aductos de ADN. Para AOM, esto implicaría la cuantificación O 6 metilguanina aductos en el colon. Con esta información el enfoque sobre los daños dentro de los tipos de células específicas, como en el nicho de células madre, se pierde. Además, un aducto de ADN no es lo mismo que una mutación ya que sólo un pequeño subconjunto de...

Se cree que el cáncer de colon de involucrar a la exposición a los agentes ambientales y componentes de la dieta que pueden dañar el ADN y producir la activación de mutaciones somáticas en oncogenes (por ejemplo, ß-catenina) o inactivación de las mutaciones en los genes supresores de tumores (por ejemplo, APC). Se supone que estas mutaciones se producen críticos en las células madre del colon. Debido a la arquitectura única de la cripta epitelio del colon, es posible medir las mutaciones de células madre en el colon después de exponer a los animales a los productos químicos asociados con la carcinogénesis de colon. Varias enzimas ligadas al cromosoma X pueden servir como indicadores para las mutaciones que se producen en las células madre, ya que las mutaciones estarán presentes en todas las células dentro de una cripta. Anteriormente, un procedimiento se publicó que demuestra que los productos químicos que inducen tumores de colon en ratones también generaron mutaciones de células madre somáticas en el colon a través de análisis de mutaciones en el nivel de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa ligada al cromosoma X gen (G6PD) 1-3.El método cuantifica la incidencia de mutaciones somáticas aleatorias en las células madre del colon sin ninguna presión de selección. El procedimiento implica la producción de secciones de colon no fijadas congelados procedentes de ratones tratados y de control y la identificación de criptas desprovistas de células que producen la actividad G6PD funcional. Estas criptas mutados, que aparecen blanco, indican que la mutación se produjo en una célula madre que dio origen a la progenie también alberga un gen G6PD mutado. En el ensayo enzimático, criptas G6PD mutante deficiente no pueden oxidar la glucosa-6-fosfato, que se requiere para la reducción de nitro azul tetrazolio (NBT). Cuando la enzima G6PD es funcional, el NBT en la mezcla de tinción se reduce a formazán insoluble y precipita, acumulando en la ubicación de la enzima y células &quot;de tinción&quot; azules. Las células que son mutantes de G6PD permanecen blanquecino en contraste con azul manchadas criptas de tipo salvaje. Este método mide mutaciones que tienen un fenotipo &quot;nulo&quot;. Debido a que enenzimas, tales como G6PD, puede difundirse fuera de las células en una sección de tejido no fijado si las secciones se colocan en una solución acuosa, es necesario para estabilizar la enzima en las secciones de tejido a analizar. 4 La estabilización de la enzima en el tejido no debe interferir con la difusión de pequeñas moléculas de reactivo necesario para la reacción enzimática G6PD. Hemos hecho una serie de cambios significativos en el procedimiento original. El medio para la tinción enzimática crítica ha sido cambiado de alcohol de polivinilo a Optimal Compuesto Temperatura de corte (OCT), lo que facilita el control del pH y la solubilización de los componentes utilizados en el ensayo. La tinción se realiza usando 0,4 - 0,5 ml pozos hechos de arandelas de acero de manera que cada sección de tejido recibió el mismo volumen de la mezcla de reacción G6PD. Se desarrolló un procedimiento para estimar el número de criptas en una sección fotografiado que proporciona una gran toma de muestras del tejido del colon sin tenerpara contar manualmente&gt; 10 5 criptas para cada colon. El análisis de los adyacentes 7 micras secciones de tejido permite la visualización de una cripta mutante en más de una diapositiva, lo que reduce los posibles artefactos de tinción. Estos cambios hacen que el procedimiento sea más eficiente y reproducible. El uso de este protocolo revisado, hemos cuantificado la frecuencia de mutación en las células madre del colon después de la exposición de ratones C57BL / 6 a azoximetano, un carcinógeno bien conocido de colon en roedores 5-7.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nitroblue tetrazolium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NADP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucose-6-phosphate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dimethyl formamide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffer (pH 7.4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light microscope equipped with 5 megapixel camera</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cryostat</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>warm room&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of  colonic stem cell mutations

La capacidad de medir las mutaciones de células madre es una poderosa herramienta para cuantificar en una población celular crítico si, y en qué medida, un producto químico puede inducir mutaciones que potencialmente conducen al cáncer. El uso de un ensayo enzimático para cuantificar mutaciones de células madre en el gen de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa ligada al cromosoma X se ha informado anteriormente. 1 Este método requiere la preparación de secciones congeladas y la incubación del tejido seccionado con una mezcla de reacción que produce una el color azul si las células producen la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) enzima funcional. Si no, las células aparecen de color blanquecino. Hemos modificado la mezcla de reacción usando Compuesto de corte óptimo de temperatura (OCT) medio en lugar de alcohol de polivinilo. Esto facilita la medición del pH, aumenta la solubilización de los componentes de tinción de G6PD y restringe la difusión de la enzima G6PD. Para demostrar que se produjo una mutación en una célula madre, toda la cripta debe carecer de G6PD enzimáticaactividad. Sólo si una célula madre alberga una mutación G6PD fenotípica será toda la progenie en la cripta carecen de actividad enzimática de G6PD. Para identificar las criptas con una mutación de células madre, cuatro secciones congeladas adyacentes consecutivos (un nivel) se redujeron a 7 micras espesores. Este enfoque de hacer cortes adyacentes ofrece conformación que una cripta estaba completamente mutado ya se observó la misma cripta mutado en las secciones adyacentes. Diapositivas con muestras de tejidos que fueron más de 50 micras, aparte estaban preparados para evaluar un total de&gt; 10 4 criptas por ratón. La frecuencia de mutación es el número de mutados (blanco) ÷ criptas observados por el número de tipo salvaje (azul) criptas en un grupo de tratamiento.

La capacidad de medir las mutaciones de células madre de colon en animales ofrece una manera única de correlacionar las mutaciones a la inducción de cáncer. Normalmente, se supone que el paso crítico en la carcinogénesis implica la activación de mutaciones en oncogenes y / o inactivación de mutaciones en genes supresores de tumores. Hemos inyectado C57BL / 6 ratones con 200 l de PBS o 10 mg / kg AOM en 200 l de PBS. OMA es un carcinógeno conocido de colon. 5.7 A los 90 días se analizaron los dos pun...

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Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations

We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

La cuantificación de la madre del colon mutaciones celulares

The ability to measure stem cell mutations is a powerful tool to quantify in a critical cell population if, and to what extent, a chemical can induce ...

quantification-of-colonic-stem-cell-mutations

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.5K vistas.  University of Pittsburgh. We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

Video: Quantification of  Colonic Stem Cell Mutations

Generation of Murine Cardiac Pacemaker Cell Aggregates Based on ES-Cell-Programming in Combination with Myh6-Promoter-Selection

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, they lack hormone responsiveness and the overall procedure is cost-intensive. &#8220;Biological pacemakers&#8221; generated from PSCs may become an alternative, yet the typical content of pacemaker cells in Embryoid Bodies (EBs) is extremely low. The described protocol combines &#8220;forward programming&#8221; of murine PSCs via the sinus node inducer TBX3 with Myh6-promoter based antibiotic selection. This yields cardiomyocyte aggregates consistent of &#62;80% physiologically functional pacemaker cells. These &#8220;induced-sinoatrial-bodies&#8221; (&#8220;iSABs&#8221;) are spontaneously contracting at yet unreached frequencies (400-500 bpm) corresponding to nodal cells isolated from mouse hearts and are able to pace murine myocardium ex vivo. Using the described protocol highly pure sinus nodal single cells can be generated which e.g. can be used for in vitro drug testing. Furthermore, the iSABs generated according to this protocol may become a crucial step towards heart tissue engineering.

This protocol describes how to produce functional sinus nodal tissue from murine pluripotent stem cells (PSC). T-Box3 (TBX3) overexpression plus cardiac Myosin-heavy-chain (Myh6) promoter antibiotic selection leads to highly pure pacemaker cell aggregates. These &#8220;Induced-sinoatrial-bodies&#8221; (&#8220;iSABs&#8221;) contain over 80% pacemaker cells, show highly increased beating rates and are able to pace myocardium ex vivo.

Generación de murino cardíaca marcapasos celulares Agregados Basado en ES-Cell-Programación en combinación con MYH6-promotor-Selección

Treatment of the &#8220;sick sinus syndrome&#8221; is based on artificial pacemakers. These bear hazards such as battery failure and infections. Moreover, ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. However, the analysis and quantification of cellular localization is difficult, as in many cases it relies on manual counting, thus bearing the risk of introducing a rater-dependent bias and reducing interrater reliability. Moreover, it is often difficult to judge whether the co-localization between two cells results from random positioning, especially when cell types differ strongly in the frequency of their occurrence. Here, a method for unbiased quantification of cellular co-localization in the bone marrow is introduced. The protocol describes the sample preparation used to obtain histological sections of whole murine long bones including the bone marrow, as well as the staining protocol and the acquisition of high-resolution images. An analysis workflow spanning from the recognition of hematopoietic and non-hematopoietic cell types in 2-dimensional (2D) bone marrow images to the quantification of the direct contacts between those cells is presented. This also includes a neighborhood analysis, to obtain information about the cellular microenvironment surrounding a certain cell type. In order to evaluate whether co-localization of two cell types is the mere result of random cell positioning or reflects preferential associations between the cells, a simulation tool which is suitable for testing this hypothesis in the case of hematopoietic as well as stromal cells, is used. This approach is not limited to the bone marrow, and can be extended to other tissues to permit reproducible, quantitative analysis of histological data.

Automated Quantification of Hematopoietic Cell &amp;#8211; Stromal Cell Interactions in Histological Images of Undecalcified Bone

A strategy to quantitatively analyze histological data in the bone marrow is presented. Confocal microscopy of fluorescently labeled cells in tissue sections results in 2-dimensional images, which are automatically analyzed. Co-localization analyses of different cell types are compared to data from simulated images, giving quantitative information about cellular interactions.

Automatizado Cuantificación de células hematopoyéticas - Interacciones de células del estroma en histológicas Imágenes de descalcificados Hueso

Confocal microscopy is the method of choice for the analysis of localization of multiple cell types within complex tissues such as the bone marrow. ...

Generation of Genetically Modified Organotypic Skin Cultures Using Devitalized Human Dermis

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function and physiology of their in vivo tissue counterparts. This is exemplified by organotypic skin cultures which faithfully recapitulates the epidermal differentiation and stratification program. Primary human epidermal keratinocytes are genetically manipulable through retroviruses where genes can be easily overexpressed or knocked down. These genetically modified keratinocytes can then be used to regenerate human epidermis in organotypic skin cultures providing a powerful model to study genetic pathways impacting epidermal growth, differentiation, and disease progression. The protocols presented here describe methods to prepare devitalized human dermis as well as to genetically manipulate primary human keratinocytes in order to generate organotypic skin cultures. Regenerated human skin can be used in downstream applications such as gene expression profiling, immunostaining, and chromatin immunoprecipitations followed by high throughput sequencing. Thus, generation of these genetically modified organotypic skin cultures will allow the determination of genes that are critical for maintaining skin homeostasis.

The goal of this paper is to provide a comprehensive and detailed protocol on how to generate genetically modified human organotypic skin from epidermal keratinocytes and devitalized human dermis.

Generación de Genéticamente Modificados cultivos de piel organotípicos Uso Desvitalizada Dermis Humana

Organotypic cultures allow the reconstitution of a 3D environment critical for cell-cell contact and cell-matrix interactions which mimics the function ...

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a population of rapidly cycling intestinal stem cells (ISCs) characterized by their expression of the Lgr5 gene. These are supported by a quiescent stem cell population, marked by Bmi-1 expression, capable of replacing them in the event of injury. Investigating the interactions between these populations is crucial to understanding their roles in disease and cancer. The ISCs exist within crypts on the intestinal surface, these niches support the ISC in replenishing the epithelia. The interaction between active and quiescent ISCs likely involves other differentiated cells within the niche, as it has previously been demonstrated that the &#8216;&#8216;stemness&#8217;&#8217; of the Lgr5 ISC is closely tied to the presence of their neighboring Paneth cells. Using conditional cre-lox mouse models we tested the effect of deleting the majority of active ISCs in the presence or absence of the Paneth cells. Here we describe the techniques and analysis undertaken to characterize the intestine and demonstrate that the Paneth cells play a crucial role within the ISC niche in aiding recovery following substantial insult.

Protocols for Analyzing the Role of Paneth Cells in Regenerating the Murine Intestine using Conditional Cre-lox Mouse Models

Intestinal epithelial stem cells (ISCs) are intermingled with Paneth cells. These cells are differentiated progeny of the ISC, which support the ISCs and provide antibacterial protection. Here we demonstrate how we used transgenic conditional mouse models to establish that Paneth cells play a crucial role in maintaining the intestinal epithelia.

Los protocolos para analizar el papel de las células de Paneth en Regeneración del Murino Intestino utilizando condicional<em&gt; Cre-lox</em&gt; Ratón Modelos

The epithelial surface of the mammalian intestine is a dynamic tissue that renews every 3 - 7 days. Understanding this renewal process identified a ...

Temporal Ordering of Dynamic Expression Data from Detailed Spatial Expression Maps

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a strict species-specific periodicity. The periodicity of the process is regulated by a molecular oscillator, known as the "segmentation clock," acting in the PSM cells. This clock drives the oscillatory patterns of gene expression across the PSM in a posterior-anterior direction. These so-called clock genes are key components of three signaling pathways: Wnt, Notch, and fibroblast growth factor (FGF). In addition, Notch signaling is essential for synchronizing intracellular oscillations in neighboring cells. We recently gained insight into how this may be mechanistically regulated. Upon ligand activation, the Notch receptor is cleaved, releasing the intracellular domain (NICD), which moves to the nucleus and regulates gene expression. NICD is highly labile, and its phosphorylation-dependent turnover acts to restrict Notch signaling. The profile of NICD production (and degradation) in the PSM is known to be oscillatory and to resemble that of a clock gene. We recently reported that both the Notch receptor and the Delta ligand, which mediate intercellular coupling, themselves exhibit dynamic expression at both the mRNA and protein levels. In this article, we describe the sensitive detection methods and detailed image analysis tools that we used, in combination with the computational modeling that we designed, to extract and overlay expression data from distinct points in the expression cycle. This allowed us to construct a spatio-temporal picture of the dynamic expression profile for the receptor, the ligand, and the Notch target clock genes throughout an oscillation cycle. Here, we describe the protocols used to generate and culture the PSM explants, as well as the procedure to stain for the mRNA or protein. We also explain how the confocal images were subsequently analyzed and temporally ordered computationally to generate ordered sequences of clock expression snapshots, hereafter defined as "kymographs," for the visualization of the spatiotemporal expression of Delta-like1 (Dll1) and Notch1 throughout the PSM.

The segmentation clock drives oscillatory gene expression across the pre-somitic mesoderm (PSM). Dynamic Notch activity is key to this process. We use imaging and computational analyses to extract temporal dynamics from spatial expression data to demonstrate that Delta ligand and Notch receptor expression oscillate in the vertebrate PSM.

Ordenamiento temporal de los datos de expresión dinámica de la expresión espacial detallada Mapas

During somitogenesis, pairs of epithelial somites form in a progressive manner, budding off from the anterior end of the pre-somitic mesoderm (PSM) with a ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth factors, and extracellular matrix. The ability of HSCs to remain quiescent, self-renew or differentiate, and acquire mutations and become malignant depends upon the complex interactions they establish with different stromal components. To observe the crosstalk between human HSCs and the human BM niche in physiological and pathological conditions, we designed a protocol to ectopically model and image a humanized BM niche in immunodeficient mice. We show that the use of different cellular components allows for the formation of humanized structures and the opportunity to sustain long-term human hematopoietic engraftment. Using two-photon microscopy, we can live-image these structures in situ at the single-cell resolution, providing a powerful new tool for the functional characterization of the human BM microenvironment and its role in regulating normal and malignant hematopoiesis.

A method to create and live-image different humanized bone-marrow niches in mice is presented. Based on the supportive niche created by human mesenchymal cells, the addition of human endothelial cells induces the formation of human vessels, while the addition of rhBMP-2 induces the formation of human-mouse chimeric mature bone tissue.

Bioingeniería de los microambientes humanizados de la médula ósea en el ratón y su visualización por imágenes en directo

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and pathological processes, such as cancer and ageing. Recently, senescence has also been implicated in tissue repair and regeneration. Therefore, it has become increasingly critical to identify senescent cells in vivo. Senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) assay is the most widely used assay to detect senescent cells both in culture and in vivo. This assay is based on the increased lysosomal contents in the senescent cells, which allows the histochemical detection of lysosomal &#946;-galactosidase activity at suboptimum pH (6 or 5.5). In comparison with other assays, such as flow cytometry, this allows the identification of senescent cells in their resident environment, which offers valuable information such as the location relating to the tissue architecture, the morphology, and the possibility of coupling with other markers via immunohistochemistry&#160;(IHC). The major limitation of the SA-&#946;-Gal assay is the requirement of fresh or frozen samples.
Here, we present a detailed protocol to understand how cellular senescence promotes cellular plasticity and tissue regeneration in vivo. We use SA-&#946;-Gal to detect senescent cells in the skeletal muscle upon injury, which is a well-established system to study tissue regeneration. Moreover, we use&#160;IHC to detect Nanog, a marker of pluripotent stem cells, in a transgenic mouse model. This protocol enables us to examine and quantify cellular senescence in the context of induced cellular plasticity and in vivo reprogramming.

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Here we present a detailed protocol to detect both senescent and pluripotent stem cells in the skeletal muscle upon injury while inducing in vivo reprogramming. This method is suitable for evaluating the role of cellular senescence during tissue regeneration and reprogramming in vivo.

Evaluación de la senescencia inducida por la lesión y en Vivo de reprogramación en el músculo esquelético

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Diferenciación rápida y dirigida de las células epiteliales del pigmento retiniano de humanos embrionarios o inducidas pluripotenciales células

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

Diferenciación eficiente de células madre pluripotentes humanas en células hepáticas

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during heart development using ventricular specific fluorescent reporter knock-in mice (MLC-2v-tdTomato mice). Heart development involves a linear heart tube formation, the heart tube looping, and four chamber septation. These complex processes are highly conserved in all vertebrates. The mouse embryonic heart has been widely used for heart developmental studies. However, due to their extremely small size, dissecting mouse embryonic hearts is technically challenging. In addition, visualization of cardiac chamber formation often needs in situ hybridization, beta-galactosidase staining using LacZ reporter mice, or immunostaining of sectioned embryonic hearts. Here, we describe how to dissect mouse embryonic hearts and directly visualize ventricular chamber formation of MLC-2v-tdTomato mice using whole mount epifluorescent microscopy. With this method, it is possible to directly examine heart tube formation and looping, and four chamber formation without further experimental manipulation of mouse embryos. Although the MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mouse line is used in this protocol as an example, this protocol can be applied to other heart-specific fluorescent reporter transgenic mouse lines.

We present the protocols to examine mouse heart development using whole mount epifluorescent microscopy on mouse embryos dissected from ventricular specific MLC-2v-tdTomato reporter knock-in mice. This method allows us to directly visualize each stage of the ventricular formation during mouse heart development without labor-intensive histochemical methods.

Análisis del desarrollo de la cámara cardiaca durante la embriogénesis de ratón usando todo de Monte de epifluorescencia

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...