Este método puede ayudar a responder algunas preguntas en el método de campo de neoplasia maligna sobre la caracterización de una célula que inicia una neoplasia maligna. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una base para el análisis funcional de estas células madre cancerosas. Las implicaciones de esta técnica se extienden hasta donde la terapia de síndromes mielodisplásicos o SMD, ya que puede ayudar en la identificación de la enfermedad que inicia las células.
Para preparar a los receptores para la transferencia adoptiva, una semana antes del trasplante proporcione agua estéril suplementada con 100 miligramos por litro de ciprofloxacino a animales receptores génicos durante siete días en un centro animal específico y libre de patógenos. En el séptimo día, un operador de cesio 17 capacitado y certificado ha establecido el instrumento de fuente de cesio para entregar 70 centigrays de irradiación gamma corporal total por minuto. Coloque 10 ratones en un soporte diseñado a medida.
Inserte el soporte en la cámara del irradiador, entregue 9 grises de irradiación total del cuerpo en 13 minutos. Luego devuelva a los animales a sus jaulas. A la mañana siguiente, rocía 70 por ciento de etanol sobre un ratón C57 negro de seis y seis polillas y usa tijeras para quitar la piel de la pelvis hasta los tobillos.
Use fórceps con las tijeras para eliminar el fémur y las tibias. Recorta limpiamente los músculos de los huesos. Corta los extremos proximal y distal de las tibias y recoge una tibia con fórceps.
Inserte una jeringa de tres mililitros equipada con una aguja de 27 gages en la cavidad de la médula ósea y enjuague la médula ósea en un tubo inferior redondo de 14 mililitros que contenga 2,5 mililitroS de solución salina amortiguada de Hanks complementada con un 2% de suero bovino fetal o HF2. Cuando se haya recogido toda la médula, aspirar el tejido varias veces a través de la punta de la aguja de 20 gage para dispersar la masa de la médula en una sola suspensión para el recuento. Para etiquetar las células nucleadas de médula ósea, o BMNC, para la clasificación del flujo, recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender el pellet en un uno por diez hasta el séptimo BMNC por cada 90 microlitros de concentración de HF2.
A continuación, agregue diez microlitros de un cóctel de anticuerpos biotinilados y antilílago a la suspensión celular para una incubación de 20 minutos a 4 grados centígrados. Seguido de un lavado de centrífuga en tres mililitros de PBS. Re suspenda el pellet en 100 microlitros de HF2 por una por diez hasta las séptimas células.
Etiquetar en segundo lugar las células con dos microlitros de anticuerpo antibiotina conjugado APC. Después de 20 minutos a cuatro grados Celsius, protegido de la luz, lavar las células en tres mililitros de PBS fresco. Re suspendir el pellet en HF2 complementado con 0,2 microgramos por mililitro de yoduro de propidio en hielo.
Ahora calibre el clasificador de células de citometría de flujo utilizando celdas no manchadas para optimizar todos los parámetros de fotomultiplicador, dispersión y fluorescencia dentro del rango lineal de cada detector. Adquiera tres muestras de 10.000 celdas para las celdas etiquetadas APC sin etiquetar, con etiqueta DE PI y anti linaje. Al final de la ordenación, analice 1.000 células de cada muestra para confirmar la pureza y viabilidad de las células ordenadas.
Gire las muestras en la centrífuga. Luego vuelva a suspender los pellets en 0,5 mililitros de HF2 para el conteo. Para la transferencia adoptiva de las células ordenadas, mezcle 100 microlitros de dos veces el quinto BMNC de tipo salvaje de un animal receptor con génico en HF2 estéril.
Con 100 microlitros de dos a cinco veces diez a la cuarta el donante clasificado BMNC de interés en HF2 estéril en un tubo de micro centrífuga por animal receptor. Cargue una jeringa de un mililitro, equipada con un medidor de 28 por recipiente con 200 microlitros de células. A continuación, coloque los ratones receptores debajo de una lámpara de calor para inducir la dilatación de la vena de cola.
Entregar las mezclas celulares a cada animal receptor irradiado lecionalmente a través de la vena de la cola. Como la auto-renovación de células madre se limita al linaje negativo de tipo silvestre BMNC, el linaje negativo, bajo linaje positivo, y el alto linaje positivo células se clasifican y trasplantan a receptores de tipo salvaje para determinar la capacidad de auto-renovación de cada población celular. Adoptivamente trasplantado donante trans genético BMNC de MDS modelo animales pueden ser distinguidos ex vivo por su expresión de marcador de superficie celular CD45.2.
A las 16 semanas después del trasplante de BNMC negativo de linaje, o BMNC no clasificado de animales transgénicos donantes MDS, las células transgénicas compiten contra las células de tipo salvaje como lo demuestra un porcentaje creciente de células donantes positivas CD45.2, observadas en la sangre periférica de los animales receptores lecionalmente irradiados. Aquí se muestran las células de una transformación leucémica de un ratón trasplantado con células MDS transgénicas. Tenga en cuenta la presencia de numerosas explosiones y formas inmaduras.
Al intentar el procedimiento, es importante recordar limitar el tiempo de manipulación ex vivo, ya que puede poner tensión indebida en las células, lo que resulta en la muerte celular o pérdida funcional. Después de su desarrollo, esta técnica allana el camino para los investigadores en el programa de campo, para poner en neoplasia maligna para explorar la fuente de la enfermedad en ratones genéticamente diseñados.
