This work was supported by the NINDS (grant #1R01NS079702 to A.C.L.) and the SURP Program at Thomas Jefferson University (M.M.).

Los procedimientos experimentales fueron aprobados por el comité de la Universidad Thomas Jefferson cuidado de los animales institucional y el uso y llevaron a cabo en cumplimiento de la Directiva Comunidades Europeas (2010/63 / UE, 86/609 / CEE y 87 a 848 / CEE), la Guía del NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio, y la Sociedad para las Políticas de Neurociencia en el uso de animales en Investigación de Neurociencia. 1. Potenciales de Acción Compuesto musculares (CMAPs) <ol><li> Preparación del animal: <ol><li> Anestesiar la rata utilizando un inhalante (isoflurano) a 2.1% entregado al efecto o por inyección (ketamina, xilazina, acepromacina). La dosificación de la anestesia inyectable es la siguiente: 95,0 mg / kg de ketamina, 10,0 mg / kg de xilazina, 0,075 mg / kg de acepromazina. NOTA: Nosotros usamos con éxito tanto de inhalantes y anestésico inyectable enfoques al realizar este protocolo grabación CMAP, sin preferencia. </li><li> El animal debe mantenerse a la una apropiadase inicia la profundidad nesthetic antes de la cirugía, a través de la conclusión de la cirugía, y hasta la buprenorfina postoperatorio ha surtido efecto. Confirmar anestesia adecuada por breve pizca dedo del pie para determinar que una respuesta de retirada no se provoca. Además, probar el reflejo corneal con un hisopo de algodón. A lo largo del procedimiento quirúrgico, determinan que la frecuencia cardíaca y la frecuencia respiratoria no han aumentado, lo que sugiere que la profundidad de la anestesia se ha convertido en demasiado clara. </li><li> Aplique un ungüento veterinario en los ojos del animal para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia. </li><li> El cirujano debe lavar su / sus manos con un desinfectante (matorrales clorhexidina) antes de comenzar la cirugía. El cirujano debe usar guantes estériles, mascarilla y bata o bata de laboratorio limpio. Todos los instrumentos deben lavarse y esterilizarse en autoclave antes de la cirugía. Añadir una tira de indicador de esterilización en el interior del kit de instrumento antes de la esterilización en autoclave a nivel de los instrumentos para verificar que la esterilización es completa. El cirujano debeverifique que toda la línea en la tira es negro antes de comenzar la cirugía. Pegue la parte exterior de la caja con cinta de autoclave indicando también. Si la cirugía se va a realizar en varios animales en el mismo día, la limpieza de los instrumentos entre cirugías y esterilizar en un esterilizador de perlas de vidrio. Si es necesario, esterilizar ambos extremos del instrumento en el esterilizador de perlas de vidrio mediante la colocación de la empuñadura del instrumento en el esterilizador durante el tiempo apropiado, la eliminación del instrumento con una pinza hemostática estéril, enfriándolo en un campo estéril y luego colocando el extremo funcional de el instrumento en el esterilizador de cuentas de vidrio para el período de tiempo adecuado. </li><li> Una vez que los animales se anestesiaron, lugar a bordo quirúrgica con la superficie dorsal hacia abajo y el abdomen hacia arriba de modo que la cinta puede ser usado para asegurar las extremidades anteriores de animales a bordo quirúrgico. </li><li> Afeitado caudalmente superficie ventral a partir de la base del cráneo, y asegúrese de que el área alrededor del abdomen a cada lado de la línea media es shaved dependiendo de qué se está grabando hemi-diafragma. Aplicar de povidona yodada a la superficie de afeitado de la piel. </li></ol></li><li> Preparación para las grabaciones CMAP: <ol><li> Después de la preparación de los animales, el lugar electrodo de masa por vía subcutánea en la cola (Figura 1). </li><li> Coloque el electrodo de referencia por vía subcutánea en la región abdominal inferior contralateral. </li><li> Coloque gel conductor sobre la tira superficie autoadhesiva o electrodo de grabación en disco (dimensiones de superficie de la banda de electrodos: 0,5 x 3 cm), y luego colocar electrodo de superficie transversalmente a lo largo del reborde costal unilateral. </li><li> Coloque electrodos de estimulación transcutánea 0,5 cm aparte laterales a la tráquea y superior a la clavícula. Inserte los electrodos de aproximadamente 1,0 cm de profundidad a través de la piel. Asegure los electrodos a mano por lo que su ubicación no se mueve con estimulaciones posteriores. NOTA: Ángulo electrodos de estimulación 90 ° con respecto a la piel en el sitio de insertion. </li></ol></li><li> Potenciales de acción muscular compuesto (CMAP) grabaciones: <ol><li> Obtener registros electrofisiológicos utilizando un estimulador / amplificador seguido por el análisis de datos asistido por ordenador. </li><li> Los parámetros de estímulo de la estimulación de tracción única debe ser 0,5 mseg, legumbres supramáximos 1,0 Hz. La amplitud del estímulo debe estar entre 6,0 y 8,0 V (Figura 2A). NOTA: En un experimento, utilice una intensidad del estímulo con la misma amplitud a través de los animales. El objetivo es maximizar la amplitud de la respuesta mediante el uso de la amplitud mínima de estimulación. Es importante tener en cuenta que la respuesta inicial que se produce en el momento de la estimulación es un artefacto de estimulación. Además, se debe tener cuidado para obtener una respuesta CMAP que está precedida por una línea de base estable / plana después de que el artefacto de estimulación, que es seguido por la respuesta CMAP rápida. Con el fin de obtener una respuesta tal, puede ser necesario cambiar la posición de la estimulación y / oelectrodos de registro. </li><li> Espere 30 segundos entre estímulos, y repita 10 estímulos en una fila para obtener el promedio de respuesta (Figura 2B - C). Medir la amplitud de la línea de base a pico (Figura 2A). Llevar a cabo la estimulación del nervio frénico durante la fase de ciclo respiratorio del animal cuando el nervio frénico / diafragma no está activado. El procedimiento se puede repetir en el mismo animal para el hemi-diafragma contralateral. </li><li> Después de la sesión de grabación CMAP final, perfundir los animales si se llevará a cabo la tinción de UNM. Realizar grabaciones CMAP repetidamente en el mismo animal, aproximadamente una vez cada semana (o al intervalo de elección). </li><li> Después de supervivencia grabaciones CMAP, permite animal para recuperar en un cojín caliente de calentamiento de agua circulante, y continuamente vigilar durante la recuperación hasta que despierta y recostada sternally. No devuelva un animal que ha sido sometido a cirugía para la compañía de otros animales hasta que se recupere completamente. &lt;/ Li&gt; <li> Una vez sternally reclinada, controlar al animal cada 12 h durante las primeras 48 horas (una vez al día a partir de entonces). Si el animal parece ser deshidratado (piel flácida, apatía), administrar líquidos (solución de Ringer con lactato; vía subcutánea; 1-2 ml por inyección, con los sitios de girar; 2 veces al día) hasta que el peso post-quirúrgico y la pérdida de fluido se estabiliza. Proporcionar los animales con comida blanda en platos pequeños durante el período postoperatorio agudo si es necesario para alentar a comer si no pueden alcanzar el alimentador de alambre barra de tapa. </li><li> Administrar la buprenorfina a una dosis de 0,05 mg / kg antes del final de la cirugía y luego a intervalos de 12 hr para la primera 24 hr (y dependiente de signos de dolor / estrés a partir de entonces) a través de inyección subcutánea (sitio de girar). Si los signos de dolor o angustia se notan a partir de entonces, tratar a los animales con buprenorfina. Los signos indicativos de dolor / malestar incluyen la falta de actividad, vocalizaciones, la falta de comer o beber (deshidratación), pérdida de peso excesiva, guardando, excessive roer o arañar en el sitio de la incisión. Criterios adicionales utilizados en la determinación de dolor y angustia incluyen la falta de respuesta a estímulos externos, vocalización transitoria o no provocado, respiración dificultosa o anormal, descarga naso-ocular persistente de color marrón rojizo, piloerección marcada. Monitorear también la evidencia de la falta de higiene que sugiera animales enfermos. Si los animales se observa todavía estar en peligro después de 72 h de tratamiento (de acuerdo con los criterios de dolor / estrés delinear anteriormente, y después de recibir el protocolo analgésico descrito anteriormente) sacrificar al animal. </li></ol></li></ol> 2. Diafragma unión neuromuscular (UNM) Análisis <ol><li> La disección de animales: <ol><li> Administrar el animal de una sobredosis de anestesia inyectable (3 veces dosis utilizada anteriormente: ketamina a 285,0 mg / kg, xilazina a 30,0 mg / kg, acepromazina a 0.225 mg / kg; administrado por vía intraperitoneal). A raíz de una sobredosis, todos los animales deben tener un segundo método de eutanasia (toracotomía) to asegurar la muerte. La muerte debe ser confirmado por la observación de un paro cardíaco y respiratorio y señalando pupilas fijas y dilatadas del animal. </li><li> Llevar a cabo una laparotomía con bisturí o tijeras de disección se extiende la escisión del proceso zyphoid caudalmente a lo largo de la línea media. Separe con cuidado de la piel y el tejido conectivo del músculo subyacente utilizando bisturí y pinzas. </li><li> Mientras tira para arriba en el proceso zyphoid, utilizar tijeras de disección para eliminar toda diafragma, lo que garantiza que el diafragma permanece unido al hueso circundante. Esto es importante ya que evitará daños en el músculo del diafragma, permitirá la disección éxito de todo el diafragma y ayudará en el músculo de limpieza para la tinción posterior. NOTA: En este punto, animal puede ser perfundido si es necesario. </li></ol></li><li> Limpieza y tinción de la membrana: <ol><li> Precisar toda diseccionado el diafragma, superficial superior hacia arriba, a la goma de silicona en un vaso plato de 100 mm de Petri en4% de paraformaldehído (1% hecha en solución salina tamponada con fosfato - PBS) durante 20 min usando un estereomicroscopio. Estirar el diafragma para que sea tensa, y el uso de pasadores de insectos, precisar el tejido circundante para evitar el fijar el propio músculo diafragma (Figura 3). </li><li> Limpiar con cuidado el tejido conectivo de sólo la superficie superior del músculo con # 5 pinzas y tijeras pequeñas. NOTA: Llevar a cabo todos los pasos posteriores de este protocolo de tinción meciéndose lentamente a temperatura ambiente protegido de la luz a menos que se especifique lo contrario. Asegúrese de que el músculo del diafragma siempre está completamente sumergido en el líquido para evitar la desecación. </li><li> Antes de la tinción, preparar todos los reactivos necesarios: 1x PBS, 2% de albúmina de suero bovino (BSA) / PBS, 0,1 M de glicina hecho en 2% de BSA / PBS, 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS 1x, y 0,2% TBP (0,2 % de Triton X100 en 2% BSA / PBS). Asegúrese de comprobar la validez de metanol frío a -20 ° C. </li><li> Lavar 3x durante 10 min en PBS 1x. </li><li> Incubar en 0,1 M de glicina (hecho en 2% De BSA / PBS) durante 30 min. </li><li> Incubar en RBTX solución (conjugado con rodamina α-bungarotoxina) durante 15 min. Solución para RBTX es como sigue: rodamina conjugado bungarotoxina alfa 1: 400 dilución en PBS 1x. NOTA: En este protocolo, Rodamina se utiliza, pero cualquier fluoróforo de elección se puede utilizar para la tinción. </li><li> Lavar 3x durante 10 min en PBS 1x. </li><li> En -20 ° C congelador, incubar con MeOH durante 5 min. NOTA: No agregue MeOH antes de colocar el músculo en el congelador, y retire inmediatamente la solución tras el período de incubación. </li><li> Lavar 3x durante 10 min en PBS 1x. </li><li> Bloquear en 0,2% TBP para 1 hr (0,2% Triton hizo en 2% BSA / PBS). </li><li> Incubar con solución de anticuerpo primario (en 0,2% TBP) a 4 ° C durante la noche mientras se balancea. Las diluciones de anticuerpos según se indica: SV2 (1:10) y SMI-312 (1: 1000). </li><li> Lave 3x durante 10 minutos con 0,2% PDD. </li><li> Incubar con el anticuerpo secundario usando 1: 100 dilución de FGM1 (cabra conjugado con FITC anti-ratón IgG1; hecho en un 0,2% PDD) mientras se balancea durante 1 hora. NOTA: Proteger de la luz para el resto del protocolo para la tinción. </li><li> Lavar 3x durante 10 min con PBS 1x. </li><li> Vuelva a limpiar tejido conectivo circundante en el superior (ver arriba) superficie de músculo antes del montaje y cubreobjetos. NOTA: Se recomienda limpiar y luego montar la muestra inmediatamente después de la tinción. Sin embargo, si es necesario, la muestra puede ser cubierto en 1x PBS, envuelto en Parafilm para evitar la evaporación y se almacenó a 4 ° C durante hasta 1 semana, con el cambio de PBS diariamente. </li><li> Tras el montaje en portaobjetos de vidrio, con cubreobjetos no Hardset Vectashield. Selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas transparente para evitar la desecación. Diapositivas de las tiendas situadas plana en carpetas de cartón de diapositivas en -20 ° C para el largo plazo. </li></ol></li><li> Análisis y confocal de imágenes: <ol><li> Analizar cuantitativamente la morfología del manchado y montado hemi-diafragma bajo magnificación 20X y 40X usando un epifluorescencia verticalmicroscopio. NOTA: Debido a que el diafragma se tiñe y se analiza en todo el montaje de forma, el músculo es bastante grueso. En consecuencia, la mayor parte de la tinción de fluorescencia es completamente fuera de foco cuando se toma una imagen estática mediante microscopía de fluorescencia confocal no. Por esta razón, lo mejor es llevar a cabo el análisis NMJ en tiempo real en el microscopio, ya que le permite centrarse en constante &quot;arriba&quot; y &quot;abajo&quot; a través del músculo para identificar correctamente la morfología de cada uno de los NMJs individuales. Con este enfoque, se puede seguir fácilmente la trayectoria de los axones motores individuales a medida que se mueven a través del tejido en relación espacial de los grupos de receptores post-sinápticos. </li><li> Mediante la medición de la longitud-ventral a dorsal del músculo, el músculo dividir en 3 secciones separadas para el análisis basado en los patrones de inervación topográficos de los niveles específicos de la médula espinal (Figura 4H). </li><li> Comenzando en la región ventral del músculo y moving dorsal, analizar todos en NMJs cara situadas en las fibras musculares superficie. No analizar fibras de músculos más profundos que los primeros 3-4 fibras de la superficie como interpretación puede ser difícil debido a la penetración de anticuerpo más pobre (RBTX penetra mucho más profunda en el músculo debido al pequeño tamaño de la toxina en comparación con los anticuerpos más grandes utilizados para etiquetar neuronas). </li><li> Identificar cada NMJ como intacta si el axón pre-terminal de la neurona es gruesa de diámetro y todas las regiones de la terminal nerviosa completamente superponen con los receptores de acetilcolina del músculo subyacentes (AChR). </li><li> Identifique cada NMJ parcialmente denervado si cualquier región de los AChR musculares subyacentes no está ocupado con sus correspondientes terminales nerviosas. </li><li> Identifique cada NMJ tan completamente denervado si los AChR musculares no tienen terminal nerviosa correspondiente (que también es importante contar con otros NMJs con neuronas marcadas en el mismo campo de concentración, por lo que uno puede estar seguro de la falta de terminación nerviosa no se debe simplemente a poor penetración anticuerpo en esa región del músculo). </li><li> Identificar cada UNM como se multiplican inervado si hay más de un inervan axón pre-terminal de un individuo NMJ (esto indica que ha habido un cierto grado de denervación y probables intentos de reinervación en este cruce). </li><li> Identifique cada NMJ lo más finas inervado si la UNM tiene superposición completa entre el terminal nerviosa y AChR subyacentes, pero tiene un axón pre-terminal delgada (esto también es indicativo de un cierto nivel de denervación y reinervación intentos). </li><li> Llevar a cabo análisis para cada una de las 3 regiones identificadas para todas las categorías NMJ anteriores para cada animal. La media de los datos de cada animal con los resultados de otros animales del mismo grupo experimental. Aproximadamente 200-300 uniones en ratas hemi diafragma muscular y 150-200 en el ratón hemi-diafragma deben cuantificarse en al menos 3 (preferiblemente 5-6 o más) animales por grupo experimental. </li><li> Obtener imágenes de alta resolución confocal, el usod para su publicación, con un microscopio confocal. </li><li> Obtener Z-pilas en 0,3 micras tamaño de paso para 20-40 micras profundidades, y recoger secciones ópticas adicionales por encima y por debajo de cada unión para asegurar que todo el perfil sináptica está incluido. </li><li> Utilice software de adquisición de reconstruir imágenes z-series en proyecciones de máxima intensidad. </li></ol></li></ol>

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	<li>Miller, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practice+parameter:+the+care+of+the+patient+with+amyotrophic+lateral+sclerosis+(an+evidence-based+review):+report+of+the+Quality+Standards+Subcommittee+of+the+American+Academy+of+Neurology:+ALS+Practice+Parameters+Task+Force.">Practice parameter: the care of the patient with amyotrophic lateral sclerosis (an evidence-based review): report of the Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology: ALS Practice Parameters Task Force.</a> Neurology. 52, 1311-1323 (1999).</li><li>Sandhu, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+recovery+following+high+cervical+hemisection.">Respiratory recovery following high cervical hemisection.</a> Respir Physiol Neurobiol. 169, 94-101 (2009).</li><li>Kaplan, L. M., Hollander, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+dysfunction+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Respiratory dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Clin Chest Med. 15, 675-681 (1994).</li><li>Holtz, A., Levi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spinal Cord Injury. , (2010).</li><li>Bruijn, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALS-linked+SOD1+mutant+G85R+mediates+damage+to+astrocytes+and+promotes+rapidly+progressive+disease+with+SOD1-containing+inclusions.">ALS-linked SOD1 mutant G85R mediates damage to astrocytes and promotes rapidly progressive disease with SOD1-containing inclusions.</a> Neuron. 18, 327-338 (1997).</li><li>Sharma, H., Alilain, W. J., Sahdu, A., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatments+to+restore+respiratory+function+after+spinal+cord+injury+and+their+implications+for+regeneration,+plasticity+and+adaptation.">Treatments to restore respiratory function after spinal cord injury and their implications for regeneration, plasticity and adaptation.</a> Experimental Neurology. 235, 18-25 (2012).</li><li>Gour&#233;vitch, B., Mellen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+preB&#246;tzinger+complex+as+a+hub+for+network+activity+along+the+ventral+respiratory+column+in+the+neonate+rat.">The preB&#246;tzinger complex as a hub for network activity along the ventral respiratory column in the neonate rat.</a> Neuroimage. 98, 460-474 (2014).</li><li>Strakowski, J. A., Pease, W. S., Johnson, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phrenic+nerve+stimulation+in+the+evaluation+of+ventilator-dependent+individuals+with+C4-+and+C5-level+spinal+cord+injury.">Phrenic nerve stimulation in the evaluation of ventilator-dependent individuals with C4- and C5-level spinal cord injury.</a> Am J Phys Med Rehabil. 86, 153-157 (2007).</li><li>Wright, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+muscarinic+acetylcholine+receptor+subtypes+contribute+to+stability+and+growth,+but+not+compensatory+plasticity,+of+neuromuscular+synapses.">Distinct muscarinic acetylcholine receptor subtypes contribute to stability and growth, but not compensatory plasticity, of neuromuscular synapses.</a> J Neurosci. 29, 14942-14955 (2009).</li><li>Li, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+the+astrocyte+glutamate+transporter+GLT1+exacerbates+phrenic+motor+neuron+degeneration,+diaphragm+compromise,+and+forelimb+motor+dysfunction+following+cervical+contusion+spinal+cord+injury.">Overexpression of the astrocyte glutamate transporter GLT1 exacerbates phrenic motor neuron degeneration, diaphragm compromise, and forelimb motor dysfunction following cervical contusion spinal cord injury.</a> J Neurosci. 34, 7622-7638 (2014).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+phrenic+motor+neuron+loss+and+transient+respiratory+abnormalities+after+unilateral+cervical+spinal+cord+contusion.">Early phrenic motor neuron loss and transient respiratory abnormalities after unilateral cervical spinal cord contusion.</a> Journal of neurotrauma. 30, 1092-1099 (2013).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phrenic+motor+neuron+degeneration+compromises+phrenic+axonal+circuitry+and+diaphragm+activity+in+a+unilateral+cervical+contusion+model+of+spinal+cord+injury.">Phrenic motor neuron degeneration compromises phrenic axonal circuitry and diaphragm activity in a unilateral cervical contusion model of spinal cord injury.</a> Exp Neurol. 235, 539-552 (2012).</li><li>Lepore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+hyperstimulation+alters+site+of+disease+onset+and+course+in+SOD1+rats.">Peripheral hyperstimulation alters site of disease onset and course in SOD1 rats.</a> Neurobiol Dis. 39, 252-264 (2010).</li><li>Alilain, W. J., Horn, K. P., Hu, H., Dick, T. E., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+of+respiratory+pathways+after+spinal+cord+injury.">Functional regeneration of respiratory pathways after spinal cord injury.</a> Nature. 475, 196-200 (2011).</li><li>Zhang, B. M. F., Cummings, K. J., Frappell, P. B., Wilson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+for+conscious+airway+resistance+and+ventilation+estimation+in+neonatal+rodents+using+plethysmography+and+a+mechanical+lung.">Novel method for conscious airway resistance and ventilation estimation in neonatal rodents using plethysmography and a mechanical lung.</a> Respir Physiol Neurobiol. 201, 75-83 (2014).</li><li>Ngo, S. T., Bellingham, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurophysiological+recording+of+the+compound+muscle+action+potential+for+motor+unit+number+estimation+in+mice.">Neurophysiological recording of the compound muscle action potential for motor unit number estimation in mice.</a> Neuromethods. 78, 225-235 (2013).</li><li>Nicaise, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degeneration+of+phrenic+motor+neurons+induces+long-term+diaphragm+deficits+following+mid-cervical+spinal+contusion+in+mice.">Degeneration of phrenic motor neurons induces long-term diaphragm deficits following mid-cervical spinal contusion in mice.</a> Journal of neurotrauma. 29, 2748-2760 (2012).</li><li>Lepore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+glial-restricted+progenitor+transplantation+into+cervical+spinal+cord+of+the+SOD1G93A+mouse+model+of+ALS.">Human glial-restricted progenitor transplantation into cervical spinal cord of the SOD1G93A mouse model of ALS.</a> PLoS One. 6, (2011).</li><li>Lepore, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+transplantation-based+astrocyte+replacement+is+neuroprotective+in+a+model+of+motor+neuron+disease.">Focal transplantation-based astrocyte replacement is neuroprotective in a model of motor neuron disease.</a> Nature neuroscience. 11, 1294-1301 (2008).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

Como la función respiratoria se ve comprometida en tanto SCI traumático y la ELA, el desarrollo de terapias que se dirigen a la respiración y, específicamente, la inervación del diafragma son clínicamente relevantes 5,6. Con el fin de estudiar exhaustivamente la función respiratoria, se debe utilizar un método de enfoque combinado. CMAPs miden el grado de inervación funcional de la membrana a través de la estimulación del nervio frénico externa, pero el impulso respiratorio bulboespinal no endóge...

Esclerosis Lateral Amiotrófica (ELA) es una enfermedad de la motoneurona debilitante asociada con la pérdida de las neuronas motoras superiores e inferiores y la consiguiente parálisis muscular. Tras el diagnóstico, la supervivencia del paciente es en promedio de sólo 2.5 años 1. Pérdida frénico motoneurona (PhMN) es un componente crítico de la patogénesis de la ELA. Los pacientes mueren en última instancia debido a la pérdida de PhMN inervación del diafragma, el músculo principal de inspiración 2,3. Lesión medular traumática (SCI) es también un problema serio con dificultades respiratorias asociadas. Aproximadamente 12.000 nuevos casos de SCI se producen cada año 4 debido a daño traumático de la médula espinal. A pesar de la heterogeneidad de la enfermedad con respecto a la ubicación, el tipo y la gravedad, la mayoría de los casos de SCI implica trauma en la médula espinal cervical, que a menudo resulta en compromiso respiratorio debilitante y persistente. Además de ALS y SCI, otro sistema nervioso central (SNC) enfermedades se puede asociar wdisfunción respiratoria diafragmática ITH 5,6. El nervio frénico es un nervio motor eferente que inerva el hemi-diafragma ipsilateral y que se origina en los cuerpos celulares PhMN ubicados en los niveles de C3-C5 del mismo lado de la médula espinal cervical. Salida PhMN es controlado por descender de entrada bulboespinal del tronco cerebral en un área conocida como el grupo rostral ventral respiratoria (rVRG) 7. El circuito rVRG-PhMN-diafragma es central para el control de la respiración de inspiración, así como otros comportamientos de diafragma no ventilatorios. Diversas lesiones traumáticas y enfermedades neurodegenerativas que afectan a este circuito pueden conducir a una profunda disminución de la función respiratoria y la calidad de vida del paciente. Descendente de entrada para PhMNs de la supervivencia rVRG, PhMN, la integridad del nervio frénico y la inervación adecuada en la unión neuromuscular diafragma (NMJ) son todos necesarios para la función normal del diafragma. Por tanto, es importante emplear técnicas quepuede evaluar cuantitativamente este circuito in vivo en modelos de roedores de ALS, SCI y otras enfermedades del SNC. Con este protocolo, el objetivo es describir las herramientas experimentales para evaluar PhMN inervación del diafragma, tanto a nivel electrofisiológico y morfológicos. Los potenciales de acción muscular compuesto (CMAPs) se registran mediante la estimulación de todos los axones de la neurona motora eferente de un nervio motor dado y luego analizar la respuesta de despolarización elicitada de las miofibras de destino. Esta técnica se puede utilizar in vivo en ratas y ratones anestesiados para cuantificar la inervación funcional de la hemi-diafragma por PhMNs 8. Debido al hecho de que CMAPs representan la grabación simultánea de todos (o al menos muchos / la mayoría) miofibras del todo-hemi diafragma, es útil examinar también los fenotipos de los axones motores individuales y miofibras en la UNM diafragma con el fin de realizar un seguimiento de la enfermedad - y terapia relevante cambios morfológicos como parcial y compledenervación te, surgimiento de regeneración y reinervación. Esto se puede lograr a través de todo el montaje inmunohistoquímica (IHC) de la membrana, seguido por la evaluación morfológica detallada de NMJs individuales a lo largo del músculo 9. Combinando CMAPs y análisis UNM proporciona un enfoque poderoso para estudiar cuantitativamente inervación diafragmática en modelos de roedores de enfermedad del SNC y SNP.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="902">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:273px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">T353-500</td>
			<td style="width:167px;">Make 10% solution first in de-ionized distilled water; make 4% with 1X PBS, adjust pH to 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">1X Phosphate Buffered Saline, pH 7.4</td>
			<td style="width:273px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">2% Bovine serum albumin (2% BSA)</td>
			<td style="width:273px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A3059-100g</td>
			<td>Dissolve 2g BSA into 100mL of 1X PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">0.2% Triton X100 in 2% BSA/PBS (Blocking Buffer)</td>
			<td style="width:273px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">T9284-100mL</td>
			<td>Dissolve 0.2ml/100mL 2% BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">0.1M Glycine</td>
			<td style="width:273px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">G-7126</td>
			<td>Add 0.185g to 25mL of 2% BSA/PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">&#945;-bungarotoxin</td>
			<td style="width:273px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:131px;">T1175</td>
			<td>Concentration 1:400</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">SMI-312&#160;</td>
			<td style="width:273px;">Sternberger Monoclonals</td>
			<td style="width:131px;">SMI312</td>
			<td>Concentration 1:1,000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">SV2</td>
			<td style="width:273px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:131px;">SV2-Supernatant</td>
			<td>Concentration 1:10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">FITC goat anti-mouse IgG1</td>
			<td style="width:273px;">Roche</td>
			<td style="width:131px;">3117731001</td>
			<td>Concentration 1:100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Silicone rubber</td>
			<td style="width:273px;">Sylgard, Dow Corning</td>
			<td style="width:131px;">Part # 184</td>
			<td>Follow instructions that come with kit: can use multiple sized culture dish (30mm, 60mm, 100mm) depending on needs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Vectashield fluorescent mounting medium</td>
			<td style="width:273px;">Vector laboratories</td>
			<td style="width:131px;">H-1000</td>
			<td>This is not a hard-set medium. You will need to secure the cover slip with clear nail polish.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Small Spring Scissors</td>
			<td style="width:273px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:131px;">15002-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Dissection forceps</td>
			<td style="width:273px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:131px;">11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Software for CMAP recordings</td>
			<td style="width:273px;">Scope 3.5.6; ADI</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Disk surface electrodes</td>
			<td style="width:273px;">Natus neurology</td>
			<td style="width:131px;">019-409000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Subdermal needle electrodes</td>
			<td style="width:273px;">Natus neurology</td>
			<td style="width:131px;">019-453100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Conductive gel</td>
			<td style="width:273px;">Aquasonic&#160;</td>
			<td style="width:131px;">122-73720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:332px;">Stimulator/recording system for CMAP recordings</td>
			<td style="width:273px;">ADI Powerlab 8SP stimulator&#160;</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:332px;">Amplifier for CMAP recordings</td>
			<td style="width:273px;">BioAMP</td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional and morphological assessment of diaphragm innervation by phrenic motor neurons

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and morphological levels. Compound muscle action potential (CMAP) recording following phrenic nerve stimulation can be used to quantitatively assess functional diaphragm innervation by PhMNs of the cervical spinal cord in vivo in anesthetized rats and mice. Because CMAPs represent simultaneous recording of all myofibers of the whole hemi-diaphragm, it is useful to also examine the phenotypes of individual motor axons and myofibers at the diaphragm NMJ in order to track disease- and therapy-relevant morphological changes such as partial and complete denervation, regenerative sprouting and reinnervation. This can be accomplished via whole-mount immunohistochemistry (IHC) of the diaphragm, followed by detailed morphological assessment of individual NMJs throughout the muscle. Combining CMAPs and NMJ analysis provides a powerful approach for quantitatively studying diaphragmatic innervation in rodent models of CNS and PNS disease.

Adultos ratas Sprague-Dawley recibieron o bien laminectomía solamente (control no lesionado) o unilateral hemi-contusión SCI a nivel de la médula espinal C4 10-12. A las 5 semanas después de la cirugía, el pico CMAP amplitud registrada de la hemi-diafragma ipsilateral al sitio laminectomía / lesión se redujo significativamente en ratas SCI (Figura 2C) en comparación con el control-laminectomía solamente (Figura 2B). Todos NMJs en el hemi-diafragma estaban completamen...

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Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease.

Evaluación funcional y morfológica de Diafragma Inervación por frénico neuronas motoras

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

functional-morphological-assessment-diaphragm-innervation-phrenic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.4K vistas.  Sidney Kimmel Medical College at Thomas Jefferson University. Compound muscle action potential recording quantitatively assesses functional diaphragm innervation by phrenic motor neurons. Whole-mount diaphragm immunohistochemistry assesses morphological innervation at individual neuromuscular junctions. The goal of this protocol is to demonstrate how these two powerful methodologies can be used in various rodent models of spinal cord disease. 

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Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor functions. Most investigations of sensorimotor mechanisms rely on either examination of neurons while an animal is static1,2 or record extracellular neuronal activity during a movement.3,4 While these studies have provided the fundamental background for sensorimotor function, they either do not evaluate functional information which occurs during a movement or are limited in their ability to fully characterize the anatomy, physiology and neurochemical phenotype of the neuron. A technique is shown here which allows extensive characterization of individual neurons during an in vivo movement. This technique can be used not only to study primary afferent neurons but also to characterize motoneurons and sensorimotor interneurons. Initially the response of a single neuron is recorded using electrophysiological methods during various movements of the mandible followed by determination of the receptive field for the neuron. A neuronal tracer is then intracellularly injected into the neuron and the brain is processed so that the neuron can be visualized with light, electron or confocal microscopy (Fig. 1). The detailed morphology of the characterized neuron is then reconstructed so that neuronal morphology can be correlated with the physiological response of the neuron (Figs. 2,3). In this communication important key details and tips for successful implementation of this technique are provided. Valuable additional information can be determined for the neuron under study by combining this method with other techniques. Retrograde neuronal labeling can be used to determine neurons with which the labeled neuron synapses; thus allowing detailed determination of neuronal circuitry. Immunocytochemistry can be combined with this method to examine neurotransmitters within the labeled neuron and to determine the chemical phenotypes of neurons with which the labeled neuron synapses. The labeled neuron can also be processed for electron microscopy to determine the ultrastructural features and microcircuitry of the labeled neuron. Overall this technique is a powerful method to thoroughly characterize neurons during in vivo movement thus allowing substantial insight into the role of the neuron in sensorimotor function.

A technique is described to quantify the in vivo physiological response of mammalian neurons during movement and correlate the physiology of the neuron with neuronal morphology, neurochemical phenotype and synaptic microcircuitry.

Caracterización fisiológicas, morfológicas y neuroquímicas de las neuronas modulada por el Movimiento

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

Investigación

Neurociencias

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, direction5-7, ocular dominance8,9 and binocular disparity9. Orientation selectivity is the most widely studied feature and a continuous map with a quasi-periodic layout for preferred orientation is present across the entire primary visual cortex10,11. Integrating the synaptic, cellular and network contributions that lead to stimulus selective responses in these functional maps requires the hybridization of imaging techniques that span sub-micron to millimeter spatial scales. With conventional intrinsic signal optical imaging, the overall layout of functional maps across the entire surface of the visual cortex can be determined12. The development of in vivo two-photon microscopy using calcium sensitive dyes enables one to determine the synaptic input arriving at individual dendritic spines13 or record activity simultaneously from hundreds of individual neuronal cell bodies6,14. Consequently, combining intrinsic signal imaging with the sub-micron spatial resolution of two-photon microscopy offers the possibility of determining exactly which dendritic segments and cells contribute to the micro-domain of any functional map in the neocortex. Here we demonstrate a high-yield method for rapidly obtaining a cortical orientation map and targeting a specific micro-domain in this functional map for labeling neurons with fluorescent dyes in a non-rodent mammal. With the same microscope used for two-photon imaging, we first generate an orientation map using intrinsic signal optical imaging. Then we show how to target a micro-domain of interest using a micropipette loaded with dye to either label a population of neuronal cell bodies or label a single neuron such that dendrites, spines and axons are visible in vivo. Our refinements over previous methods facilitate an examination of neuronal structure-function relationships with sub-cellular resolution in the framework of neocortical functional architectures.

A method is described for labeling neurons with fluorescent dyes in predetermined functional micro-domains of the neocortex. First, intrinsic signal optical imaging is used to obtain a functional map. Then two-photon microscopy is used to label and image neurons within a micro-domain of the map.

Etiquetado dirigida de neuronas en una versión concreta de Micro-funcional de dominio de la neocorteza por combinar la señal intrínseca e Imagen de dos fotones

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Extracelularmente Identificar las neuronas motoras de un músculo en la piscina Motor<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic nerves innervating the respiratory diaphragm. In spinal cord slices, phrenic motor neurons cannot be identified from other motor neurons on morphological or biochemical criteria. We provide the description of procedures for visualizing phrenic motor neuron cell bodies in mice, following intrapleural injections of cholera toxin subunit beta (CTB) conjugated to a fluorophore. This fluorescent neuroanatomical tracer has the ability to be caught up at the diaphragm neuromuscular junction, be carried retrogradely along the phrenic axons and reach the phrenic cell bodies. Two methodological approaches of intrapleural CTB delivery are compared: transdiaphragmatic versus transthoracic injections. Both approaches are successful and result in similar number of CTB-labeled phrenic motor neurons. In conclusion, these techniques can be applied to visualize or quantify the phrenic motor neurons in various experimental studies such as those focused on the diaphragm-phrenic circuitry.

Here, we describe a protocol for identifying phrenic motor neurons in mice after intrapleural delivery of fluorophore conjugated cholera toxin subunit beta. Two techniques are compared to inject the pleural cavity: transdiaphragmatic versus transthoracic approaches.

Seguimiento Neuroanatomical retrógrada frénico de neuronas de Motor en ratones

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have indicated that hair cell synapses may be the initial targets in sensorineural hearing loss (SNHL). Such studies have proposed the concept of cochlear &#34;synaptopathy&#34;, which refers to alterations in ribbon synapse number, structure, or function that result in abnormal synaptic transmission between IHCs and SGNs. While cochlear synaptopathy is irreversible, it does not affect the hearing threshold. In noise-induced experimental models, restricted damage to IHC synapses in select frequency regions is employed to identify the environmental factors that specifically cause synaptopathy, as well as the physiological consequences of disturbing this inner ear circuit. Here, we present a protocol for analyzing cochlear synaptic morphology and function at a specific frequency region in adult mice. In this protocol, cochlear localization of specific frequency regions is performed using place-frequency maps in conjunction with cochleogram data, following which the morphological characteristics of ribbon synapses are evaluated via synaptic immunostaining. The functional status of ribbon synapses is then determined based on the amplitudes of auditory brainstem response (ABR) wave I. The present report demonstrates that this approach can be used to deepen our understanding of the pathogenesis and mechanisms of synaptic dysfunction in the cochlea, which may aid in the development of novel therapeutic interventions.

This manuscript describes an experimental protocol for evaluating the morphological characteristics and functional status of ribbon synapses in normal mice. The present model is also suitable for noise-induced and age-related cochlear synaptopathy-restricted models. The correlative results of previous mouse studies are also discussed.

Evaluación morfológica y funcional de sinapsis de cinta en regiones de frecuencia específica de la Cóclea de Ratones

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

Conversión de células madre pluripotentes inducidas por humanos (IPSC) en neuronas motoras craneales y espinales funcionales usando vectores PiggyBac

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Análisis cinemático 3D para la evaluación funcional en el modelo de rata de lesión de aplastamiento de nervios ciáticos

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our understanding of the molecular mechanisms underlying axon degeneration remains limited. Injury-induced axon degeneration serves as a simple model to study how severed axons execute their own disassembly (axon death). Over recent years, an evolutionarily conserved axon death signaling cascade has been identified from flies to mammals, which is required for the separated axon to degenerate after injury. Conversely, attenuated axon death signaling results in morphological and functional preservation of severed axons and their synapses. Here, we present three simple and recently developed protocols that allow for the observation of axonal morphology, or axonal and synaptic function of severed axons that have been cut-off from the neuronal cell body, in the fruit fly Drosophila. Morphology can be observed in the wing, where a partial injury results in axon death side-by-side of uninjured control axons within the same nerve bundle. Alternatively, axonal morphology can also be observed in the brain, where the whole nerve bundle undergoes axon death triggered by antennal ablation. Functional preservation of severed axons and their synapses can be assessed by a simple optogenetic approach coupled with a post-synaptic grooming behavior. We present examples using a highwire loss-of-function mutation and by over-expressing dnmnat, both capable of delaying axon death for weeks to months. Importantly, these protocols can be used beyond injury; they facilitate the characterization of neuronal maintenance factors, axonal transport, and axonal mitochondria.

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

Here, we provide protocols to perform three simple injury-induced axon degeneration (axon death) assays in Drosophila melanogaster to evaluate the morphological and functional preservation of severed axons and their synapses.

Evaluación morfológica y funcional de los axónyis y sus sinapsis durante la muerte de Axon en Drosophila melanogaster

Axon degeneration is a shared feature in neurodegenerative disease and when nervous systems are challenged by mechanical or chemical forces. However, our ...

Culturing Rat Sympathetic Neurons from Embryonic Superior Cervical Ganglia for Morphological and Proteomic Analysis

Sympathetic neurons from the embryonic rat superior cervical ganglia (SCG) have been used as an in vitro model system for peripheral neurons to study axonal growth, axonal trafficking, synaptogenesis, dendritic growth, dendritic plasticity and nerve-target interactions in co-culture systems. This protocol describes the isolation and dissociation of neurons from the superior cervical ganglia of E21 rat embryos, followed by the preparation and maintenance of pure neuronal cultures in serum-free medium. Since neurons do not adhere to uncoated plastic, neurons will be cultured on either 12 mm glass coverslips or 6-well plates coated with poly-D-lysine. Following treatment with an antimitotic agent (Ara-C, cytosine &#946;-D-arabinofuranoside), this protocol generates healthy neuronal cultures with less than 5% non-neuronal cells, which can be maintained for over a month in vitro. Although embryonic rat SCG neurons are multipolar with 5-8 dendrites in vivo; under serum-free conditions, these neurons extend only a single axon in culture and continue to be unipolar for the duration of the culture. However, these neurons can be induced to extend dendrites in the presence of basement membrane extract, bone morphogenetic proteins (BMPs), or 10% fetal calf serum. These homogenous neuronal cultures can be used for immunocytochemical staining and for biochemical studies. This paper also describes optimized protocol for immunocytochemical staining for microtubule associated protein-2 (MAP-2) in these neurons and for the preparation of neuronal extracts for mass spectrometry.

This paper describes the isolation and culturing of embryonic rat sympathetic neurons from the superior cervical ganglia. It also provides detailed protocols for immunocytochemical staining and for preparing neuronal extracts for mass spectrometric analysis.

Cultivar neuronas simpáticas de ratas de Ganglia cervical superior embrionario para análisis morfológico y proteómico

Sympathetic neurons from the embryonic rat superior cervical ganglia (SCG) have been used as an in vitro model system for peripheral neurons to study ...

Functional Isolation of Single Motor Units of Rat Medial Gastrocnemius Muscle

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in hindlimb muscles (such as the medial gastrocnemius, soleus, or plantaris muscle) in experimental rats. A crucial element of the method is the application of electrical stimuli delivered to a motor axon isolated from the ventral root. The stimuli may be delivered at constant or variable inter-pulse intervals. This method is suitable for experiments on animals at varying stages of maturity (young, adult or old). Moreover, this protocol can be used in experiments studying variability and plasticity of motor units evoked by a large spectrum of interventions. The results of these experiments may both augment basic knowledge in muscle physiology and be translated into practical applications. This procedure focuses on the surgical preparation for the recording and stimulation of MUs, with an emphasis on the necessary steps to achieve preparation stability and reproducibility of results.

This method allows the recording of the force of twitch and tetanic contractions and action potentials in three types of motor units in the rat medial gastrocnemius muscle. The functional isolation of a single motor unit is induced by electrical stimulation of the axon.

Aislamiento funcional de unidades de motor único de Rat Medial Gastrocnemius Muscle

This work outlines functional isolation of motor units (MUs), a standard electrophysiological method for determining characteristics of motor units in ...