Este trabajo fue apoyado por becas de la National Eye Institute R01EY017925 y R21EY020985 y financiamiento de las Fundaciones de Dana y Whitehall a PK Agradecemos también a Mateo Petrella para obtener ayuda con los procedimientos quirúrgicos; Grace Dion para rastrear las dendritas se muestra en la Figura 5A, y Pratik Chhatbar para comentarios sobre el manuscrito.

1. Preparación quirúrgica <ol><li> Inducir la anestesia y vigilar continuamente la frecuencia cardíaca, terminar tidal CO 2, EEG, y la temperatura. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión de la Universidad Médica de Carolina del Sur y se basaron en los que previamente publicada 9,15. </li><li> Exponer la superficie dorsal del cráneo por el corte de la piel con una cuchilla de escalpelo. Separe los tejidos conectivos que recubren el hueso utilizando una cureta Brudon. Limpie el hueso utilizando aplicadores con punta de algodón y gasa de algodón. Aplique la cera ósea (según sea necesario) con el cráneo, para detener el sangrado ocasional a través de pequeñas venas emisarias. </li><li> Adjuntar una placa de titanio o de acero inoxidable al cráneo (más de la región de interés en el que se realiza la craneotomía) mediante el uso de cemento dental mezclado con pintura de color negro (ver Materiales). Una abertura rectangular en el centro de la placa de cabeza proporciona el acceso para la craneotomía y formación de imágenes ópticas. Adjuntar una cámara de metal en la parte superior de la placa de cabeza. Esta cámara servirá como un depósito de fluido para la formación de imágenes con la lente de objetivo de inmersión en agua. </li><li> Fije la placa de cabeza a una etapa xy usando postes de metal. </li><li> Thin una gran área del hueso dentro de la abertura rectangular de la placa superior mediante el uso de un taladro dental. El área a ser adelgazada debe extenderse más allá de los límites de la craneotomía planificada. El cráneo grueso de los mamíferos no roedores, se debe diluir si imágenes de alta resolución de ser adquiridos a partir de la neocorteza porque en el sitio de la craneotomía, el espesor del hueso determinará el espesor de la agarosa entre el cubreobjetos y la superficie neocortical (ver más abajo) . </li><li> Haga un esquema de 2 x 2 mm cuadrados en el hueso de la craneotomía. Enjuague la cámara periódicamente con fluido nuevo cerebroespinal artificial (ACSF) para eliminar los fragmentos de hueso y minimizar la disipación de calor a la corteza subyacente. Aplicar cera de hueso, según sea necesario, para detener el sangrado ocasional. </li><li> Lift el colgajo óseo con un fórceps # 3. </li><li> Deje únicamente la capa inferior de la duramadre con una multa fórceps (# 5CO) y tijeras Vannas primavera. La duramadre en mamíferos no roedores es gruesa y opaca, pero se puede quitar en capas distintas. El sangrado es raro pero puede ser detenida con Gelfoam y cualquier residuo de sangre se debe extraer con cuidado la capa restante de duración utilizando fórceps y aclarado con ACSF. La última capa de la duramadre es transparente y los vasos piales debe ser claramente visible a través de ella. De salir de esta última capa de la duramadre intacta durante la formación de imágenes de la señal intrínseca aumentará la tasa de éxito de la carga a granel de indicadores de calcio fluorescente para la fase de formación de imágenes posterior de dos fotones del experimento (véase la discusión). </li><li> Aplicar una gota de tibia agarosa al 2% (disuelta en ACSF) e inmediatamente colocar un cubreobjetos sobre la craneotomía. Ver la craneotomía para asegurar que las pulsaciones respiratorias y cardiovasculares son mínimos mediante el uso de un microscopio de disección quirúrgica o los oculares de la de dosmicroscopio de fotones en el campo brillante modo. </li></ol> 2. Intrínseco señal óptica de imagen <ol><li> Añadir gel-espuma empapado con ACSF alrededor del exterior del cubreobjetos para evitar que la agarosa de secado durante la formación de imágenes de la señal intrínseca. </li><li> Fije la señal intrínseca imagen de la cámara CCD para el estándar de montaje C puerto en la parte superior del microscopio de dos fotones (Figura 1). Coloque la fuente de iluminación de luz en la mesa de aire cerca de la etapa de XY (fig. 1A). Coloque y asegure las guías de luz de más de la craneotomía y placa superior / cámara (fig. 1B). Retraer el dicroico primario y el espejo debajo del orificio de montaje C, de modo que la luz reflejada rojo necesaria para señales intrínsecas pasará directamente de la craneotomía a la cámara CCD (Figura 1C-D). Uso del objetivo 4x aire (0,13 NA, 17 mm WD), un 2 x 2 mm campo de vista está disponible para la imagen de la señal intrínseca. </li><li> Insertar un filtro de calor en el light camino para prevenir la corteza de calefacción. El uso de un filtro que deja pasar la luz verde (546 nm centro λ) y grabar una imagen digital de referencia de los vasos sanguíneos superficiales corticales. </li><li> Mover el foco z a 500 micras debajo de la superficie cortical. Utilice un filtro rojo (630 nm centro λ) para iluminar la corteza para la medición de señales intrínsecas. Coloque las guías de luz de manera que la superficie cortical está uniformemente iluminado. Proteger la craneotomía de la luz producida por la pantalla estímulo visual. Presentar una secuencia de estímulos visuales y grabar imágenes de reflectancia de datos. Para generar un mapa de orientación dentro de 10 min, recoger datos correspondientes a 4 repeticiones de una secuencia de estímulos 8 (4 orientaciones y direcciones dos para cada orientación). </li><li> Analizar los datos de las señales intrínsecas para generar un mapa de color orientación falsa. Selección de regiones objetivo potenciales para dos fotones etiquetado de las neuronas, por ejemplo, la orientación singularidades pinwheel - puntos en el mapa dondetodas las orientaciones preferidas convergen (Figura 2A). Superponer el mapa de orientación y la imagen de la vasculatura superficie cortical (Figura 2B-C). Use la organización de los dominios funcionales y la ubicación de los buques de gran superficie para seleccionar un objetivo, evitando lugares con vasos sanguíneos grandes y arteriolas 15. </li></ol> 3. Bulk Loading Indicadores de calcio fluorescente <ol><li> Preparar una solución de 20% de Pluronic / DMSO mediante la adición de 1 g de Pluronic en 5 l de DMSO. Calentar la mezcla a 60 º C durante 10 min para disolver completamente el Pluronic. Dejar que la mezcla se enfríe a temperatura ambiente. Añadir 4 l de la mezcla de Pluronic / DMSO a un vial de 50 mg de indicador de calcio fluorescente Oregon Green 488 Bapta-1 AM (OGB-1 AM). A continuación, añadir 1 l de un colorante rojo (Alexa Fluor 594, 2 mM de solución madre) y 35 l de solución de la pipeta (véase Materiales) para una concentración final de 1 mM OGB-1 AM. Sonicar la solución durante media hora enun baño de agua helada y luego se centrifuga con un filtro de 0,45 micras para eliminar las impurezas. </li><li> Tire una pipeta cónica de longitud con un diámetro de la punta exterior de 2.0-2.5 m. Cargar 5 l de la mezcla de colorantes en la pipeta. </li><li> Retire la capa final de duración para facilitar la inserción pipeta y obtener la más alta calidad de dos fotones de imágenes. </li><li> Determinar la ubicación exacta en la superficie cortical que la pipeta debe ser colocado con el fin de alcanzar su objetivo en la capa cortical 2/3. Nuestro objetivo predeterminado cortical es una singularidad pinwheel en el mapa de orientación (Figura 2). La pipeta debe ser conducido en la corteza en un ángulo de 30 º para pasar entre la pared de la cámara y el objetivo. Por lo tanto, para etiquetar la región diana 200 micras por debajo de la superficie cortical, la posición de entrada de la pipeta en la superficie cortical será de aproximadamente 350 micras laterales a la posición de destino (Figura 3 AB). </li><li> Mover la fase XY (en el que el animal y el pmicromanipulador ipette se colocan) para centrar la posición de la superficie cortical entrada en el objetivo (Figura 3C). Utilice un objetivo de 20x o 40x con una distancia de trabajo (WD) de al menos 3 mm (véase Materiales) para asegurarse de que la pipeta entrará fácilmente en la corteza sin tocar el objetivo o el hueso a lo largo de la pared de la craneotomía. Una vez que la posición de entrada se centra en el objetivo, elevar la posición Z del objetivo por 2 mm (Figura 3D). Con la epi-fluorescencia verde semáforo se puso en rojo para visualizar el colorante Alexa en la pipeta, utilizar el eje diagonal de la micromanipulador para mover la pipeta hasta que su punta esté centrada (y centrado) con el objetivo directamente por encima de la posición de la superficie cortical entrada ( Figura 3E). </li><li> Bajar la pipeta verticalmente (a lo largo del eje z), hasta que la pipeta llegue a la superficie cortical (Figura 3F), mientras que continua viendo la punta de la pipeta a través de la OCUlars del microscopio. Uso de iluminación de campo brillante, los vasos sanguíneos y la superficie cortical restantes membranas meníngeas (piamadre y aracnoides) son fácilmente visibles como la pipeta se aproxima a la superficie cortical. Si la pipeta no llega a la posición de entrada deseada, elevar la pipeta y recalibrar de focalización basado en los puntos de referencia vasculares en la superficie cortical. </li><li> Retire el objetivo, absorbe y expulsa el exceso de líquido cefalorraquídeo de la craneotomía y secar el hueso adyacente usando sin pelusa lanzas de absorción. Aplicar una gota de tibia 3% de agarosa (disuelta en ACSF) para estabilizar la corteza que es visible a través de la craneotomía (Figura 3G). En no roedores, 3% de agarosa es necesario para amortiguar pulsaciones para una utilización eficaz de colorantes fluorescentes por las neuronas. Para las imágenes de la señal óptica intrínseca sólo 2% de agarosa es necesaria porque la combinación de 2% de agarosa y el cubreobjetos proporciona la estabilidad necesaria. Aquí, no cubreobjetos se utiliza para el paso de tinte de carga de modo 3% de agarosa senecesario. Después de que la agarosa se ha solidificado, insertar un objetivo de 40x (0,8 NA, 3,3 mm WD) y volver a llenar la cámara con ACSF. </li><li> Cambie de campo claro a dos fotones de visión y busque la punta de la pipeta. Usando el eje diagonal de la micromanipulador, mover la pipeta hasta que su punta alcanza la profundidad deseada en la corteza (Figura 3H). Ocasionales ráfagas de expulsión de presión de la mezcla de colorantes (un psi pocos, cada pulso de 0,1 s) le ayudará a evitar que la punta de la pipeta se obstruya. Debido OGB-1 AM sólo se hace visible al entrar en las células, el rojo colorante Alexa es crítica para la visualización de la punta de la pipeta en el interior de la corteza. </li><li> Antes de intentar cargar las neuronas en la capa cortical 2/3 con la dosis completa de tinte, re-enfocar el objetivo en la superficie cortical para confirmar la profundidad de la punta de la pipeta y asegurarse de que la punta está en la ubicación de destino basado en la disposición de vasos sanguíneos superficiales. Si la pipeta está en la capa 2/3, pequeñas bocanadas de la mezcla de colorantes debe iluminar laespacio extracelular y revelan un conjunto denso de los cuerpos celulares circulares como sombras oscuras. </li><li> Para cargar los cuerpos celulares neuronales en una esfera de diámetro corteza 300-600 micras, inyectar la mezcla de tintes en el espacio extracelular utilizando 30-90 pulsos, cada pulso de 1,0 seg, 2-10 psi. Los pulsos de presión no debe ser tan fuerte que el tejido se mueve. Después de la inyección se ha completado, espere unos pocos minutos, luego retire la pipeta y objetiva. Espere 1 hora para permitir la OGB-1 AM a estar plenamente en marcha por las neuronas. </li><li> Eliminar la agarosa utilizado para la carga de colorante y enjuagar la cámara de registro. Ponga una pequeña gota de 2-3% de agarosa en la superficie y poner rápidamente un cubreobjetos sobre la craneotomía. Debido a que los tintes fluorescentes son sensibles a la luz, evitar la sobre-exposición de la corteza de campo brillante o luz epi-fluorescente. Insertar un alto NA (1,0) 20x objetivo en el soporte objetivo y volver a centrar la región cortical etiquetado con arreglo al objetivo con la etapa xy. Proteja la craneotomía de exfuentes traneous luz, por ejemplo, visualización de estímulo visual, utilizando múltiples capas de material apagón. </li></ol> 4. De celda única Electroporación de colorantes fluorescentes <ol><li> Para el estudio de la morfología dendrítica, preparar una solución de 100 mM de Alexa Fluor 594 (dilución 1:20 en ACSF de 2 mM Alexa Fluor 594 stock). Para obtener imágenes funcionales de las dendritas de una sal OGB puede utilizarse 16,17. </li><li> Tire una pipeta cónica larga con un tamaño de punta de 1 micras y con carga de 5 l de medio de contraste en la pipeta. Todos los demás pasos de la focalización de un dominio funcional son idénticos al método de carga a granel (Figuras 1-3). Para posicionar la punta de la pipeta adyacente a una membrana celular neuronal cuerpo, controlar el aumento de la impedancia de los electrodos y aplicar presión bocanadas de tinte para iluminar el espacio extracelular y ver los cuerpos celulares como sombras durante dos fotones de imágenes. </li><li> Cuando la punta de la pipeta es adyacente a una membrana celular neuronal cuerpo, utiliza el 800A Axoporator para aplicarPulsos de 1-3 (-8 a -10 V, 10 ms de pulso). El relleno inmediato de la neurona con colorante se visualiza fácilmente con dos fotones microscopía. Retire la pipeta y recoger imágenes de alta resolución de las dendritas y los axones in vivo. </li></ol>

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	<li>Blasdel, G. G., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-sensitive+dyes+reveal+a+modular+organization+in+monkey+striate+cortex.">Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex.</a> Nature. 321, 579-585 (1986).</li><li>Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. 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Neurosci. 16, 6945-6964 (1996).</li><li>Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+with+cellular+resolution+reveals+precise+micro-architecture+in+visual+cortex.">Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex.</a> Nature. 433, 597-603 (2005).</li><li>Li, Y., Van Hooser, S. D., Mazurek, M., White, L. E., Fitzpatrick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience+with+moving+visual+stimuli+drives+the+early+development+of+cortical+direction+selectivity.">Experience with moving visual stimuli drives the early development of cortical direction selectivity.</a> Nature. 456, 952-956 (2008).</li><li>Bonhoeffer, T., Kim, D. S., Malonek, D., Shoham, D., Grinvald, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+the+layout+of+functional+domains+in+area+17+and+across+the+area+17/18+border+in+cat+visual+cortex.">Optical imaging of the layout of functional domains in area 17 and across the area 17/18 border in cat visual cortex.</a> Eur. J. Neurosci. 7, 1973-1988 (1995).</li><li>Kara, P., Boyd, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+micro-architecture+for+binocular+disparity+and+ocular+dominance+in+visual+cortex.">A micro-architecture for binocular disparity and ocular dominance in visual cortex.</a> Nature. 458, 627-631 (2009).</li><li>da Costa, N. M., Martin, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whose+Cortical+Column+Would+that+Be.">Whose Cortical Column Would that Be.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 4, 16 (2010).</li><li>Kaschube, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universality+in+the+evolution+of+orientation+columns+in+the+visual+cortex.">Universality in the evolution of orientation columns in the visual cortex.</a> Science. 330, 1113-1116 (2010).</li><li>Villeneuve, M. Y., Vanni, M. P., Casanova, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+organization+in+area+21a+of+the+cat+revealed+by+optical+imaging:+comparison+with+the+primary+visual+cortex.">Modular organization in area 21a of the cat revealed by optical imaging: comparison with the primary visual cortex.</a> Neuroscience. 164, 1320-1333 (2009).</li><li>Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+mapping+of+single+spines+in+cortical+neurons+in+vivo.">Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo.</a> Nature. 475, 501-505 (2011).</li><li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).</li><li>Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+artery-specific+fluorescent+dye+for+studying+neurovascular+coupling.">An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling.</a> Nat. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+valproic+acid+exposure+alters+functional+organization+in+the+primary+visual+cortex.">Early valproic acid exposure alters functional organization in the primary visual cortex.</a> Exp. Neurol. 228, 138-148 (2011).</li><li>Bock, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+anatomy+and+in+vivo+physiology+of+visual+cortical+neurons.">Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons.</a> Nature. 471, 177-182 (2011).</li><li>Rochefort, N. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+connectivity+and+response+dynamics+of+excitatory+and+inhibitory+neurons+in+visual+cortex.">Differential connectivity and response dynamics of excitatory and inhibitory neurons in visual cortex.</a> Nat. Neurosci. 14, 1045-1052 (2011).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Se presenta un método para dirigir el etiquetado de los cuerpos celulares neuronales (o dendritas y axones) en pre-determinados micro-dominios funcionales de la corteza cerebral. La fusión de imágenes de la señal óptica intrínseca con dos fotones microscopía ofrece la posibilidad de determinar que sinapsis y células contribuyen a la micro-dominio de cualquiera de los mapas funcionales, si correlatos neuronales selectividad con la ubicación de la neurona en un mapa funcional, y el circuito neuronal componentes q...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo / material </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 1. El soporte de vida / experimento de preparación </td></tr><tr><td> El isoflurano </td><td> Webster Vet </td><td> NDC 57319-474-05 </td><td></td></tr><tr><td> Vaporizador de isoflurano </td><td> Midmark </td><td> VIP 3000 </td><td></td></tr><tr><td> Comentarios manta eléctrica regulada </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 50-7079F </td><td></td></tr><tr><td> Del monitor de ECG </td><td> Digicare Biomédica </td><td> LifeWindow Lite </td><td></td></tr><tr><td> Amplificador de EEG </td><td> Sistemas AM </td><td> 1800 </td><td></td></tr><tr><td> Monitor de pantalla de EEG </td&gt; <td> Hewlett Packard </td><td> 78304A </td><td></td></tr><tr><td> Fin de marea de CO 2 monitor </td><td> Respironics </td><td> Novametrix Capnoguard 1265 </td><td> Optimizar la ventilación </td></tr><tr><td> Rebabas de metal duro de perforación para la perforación del hueso </td><td> Henry Schein </td><td> fino (0,5 mm punta) y gruesa (1,25 mm punta) </td><td></td></tr><tr><td> Cemento para placa cabezal / cámara </td><td> Dentsply </td><td> 675571, 675572 </td><td></td></tr><tr><td> Polvo negro Tempera Paint </td><td> Sargent Art Inc. </td><td> 22-7185 </td><td> Añadir al cemento para mejorar el blindaje de luz y reducir los reflejos </td></tr><tr><td> Agarosa - Tipo III-A </td><td> Sigma </td><td> A9793 </td><td> Para minimizar las pulsaciones durante la señal intrínseca y la imagen de dos fotones </td></tr><tr><td> Cubreobjetos: 5 o 8 mm de diámetro, 0,17 mm de espesor </td><td> En World Precisioninstrumentos </td><td> 502040, 502041 </td><td> Para minimizar las pulsaciones durante la exploración, el cubreobjetos se puede cortar según sea necesario </td></tr><tr><td> Brudon curetas </td><td> George Tiemann </td><td> 105-715-0, 105-715-3 </td><td> Limpieza de superficie del cráneo </td></tr><tr><td> Bone cera </td><td> Ethicon </td><td> W31G </td><td> Rápidamente deja de sangrar </td></tr><tr><td> Aplicador con punta de algodón </td><td> Microscopía Electrónica de Ciencias </td><td> 72308-05 </td><td> Hueso Limpie y seque la superficie </td></tr><tr><td> Dumont # 5CO Pinzas </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 11295-20 </td><td> Agarra capas individuales de duración o pia </td></tr><tr><td> Tijeras Vannas Primavera </td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 15000-03 </td><td> Cut dura </td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> Pfizer </td><td> 09-0396-05 </td><td> Para detener la hemorragia en la duramadre </td></tr><tr><td> Lanzas de absorción</td><td> Herramientas Artes Ciencias </td><td> 18105-01 </td><td> Absorción ultra rápida y libre de pelusa de CSF </td></tr><tr><td> Blackout materiales </td><td> Thorlabs </td><td> BK5 </td><td> Escudo craneotomía </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 2. Teñir preparación / inyección </td></tr><tr><td> Dimetil sulfóxido (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic </td><td> Sigma </td><td> P2443 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green 488 Bapta-1 AM </td><td> Invitrogen </td><td> O6807 </td><td> Calcio indicador </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A10438 </td><td></td></tr><tr><td> Filtro centrífugo (0,45 micras de tamaño de poro) </td><td> Millipore </td><td> UFC30HV00 </td><td> Para eliminar las impurezas antes de la inyección </td></tr><tr><td> Vidrio pipeta extractor </td><td> Sutter Instruments </td><td> P97 </td><td></td></tr><tr><td> Vidrio borosilicato filamented capilar (1,5 mm de diámetro exterior) </td><td> World Precision Instruments </td><td> 1B150F-4 </td><td> Pipeta de expulsión Dye </td></tr><tr><td> Microloader </td><td> Eppendorf </td><td> 5242 956 003 </td><td> Para cargar un tinte en una pipeta </td></tr><tr><td> Micromanipulador </td><td> Sutter Instruments </td><td> MP-285 </td><td> Para posicionar pipeta </td></tr><tr><td> Regulador de presión de pulso </td><td> Parker Hannifin </td><td> PicoSpritzer III </td><td> Para la inyección de la presión del colorante </td></tr><tr><td> De celda única electroporador </td><td> Molecular Devices </td><td> Axoporator 800A </td><td> Para la electroporación del colorante </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 3. Intrínseca imaging </td></tr><tr><td> Objetivo 4x (0,13 NA, 17 mm WD) </td><td> Olimpo </td><td> UPLFLN4X </td><td></td></tr><tr><td> Intrínseca hardware / software </td><td> Optical Imaging Inc. </td><td> Imager 3001 / VDAQ </td><td> VDAQ software se utiliza para la formación de imágenes episódica </td></tr><tr><td> Cámara CCD </td><td> Adimec </td><td> Adimec-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Fuente de luz Fuente de alimentación </td><td> KEPCO </td><td> ATE-15M 15 </td><td></td></tr><tr><td> Fuente de luz </td><td> Optical Imaging Inc. </td><td> HAL 100 </td><td> La intensidad de luz en la superficie cortical es de 3-5 mW </td></tr><tr><td> Filtro verde (para una imagen vascular) </td><td> Optical Imaging Inc. </td><td> λ = 546 nm (paso de banda de 30 nm) </td><td> Para la imagen de referencia de la superficie de la vasculatura </td></tr><tr><td> Filtro rojo (para la señal intrínseca) </td><td> Optical Imaging Inc. </td><td> λ = 630 nm (paso de banda de 30 nm) </td><td> Para recoger señales intrínsecas </td></tr><tr><td> Heat filtro </td><td> Optical Imaging Inc. </td><td> KG-1 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 4. Dos fotones de plataforma / imagen </td></tr><tr><td> Dos fotones de microscopio y software </td><td> Tecnologías de la Prairie </td><td></td><td> Ver Shen et al. 2012 para paso de luz, filtros y potencia del láser </td></tr><tr><td> Ti: Sapphire láser </td><td> Spectra-Physics </td><td> Mai Tai XF </td><td></td></tr><tr><td> 20x (0,5 NA, 3,5 mm WD) </td><td> Olimpo </td><td> UMPLFLN20X </td><td> 0,5 NA objetivo sólo se utiliza para la alineación de pipeta sobre la craneotomía (no para dos imágenes de fotón) </td></tr><tr><td> 20x (1,0 NA; 2,0 mm WD) </td><td> Olimpo </td><td> XLUMPLFLN20X </td><td></td></tr><tr><td> 40x (0,8 NA; 3,3 mm WD) </td><td> Olimpo </td><td> LUMPLFLN40X/IR </td><td></td></tr><tr><td> Air tabla </td><td> Newport </td><td> ST-200 </td><td> Aísla preparación de las vibraciones externas </td></tr><tr><td> xy etapa </td><td> Mike Machine Co. (Attleboro, MA) </td><td></td><td> Sujeto experimental y micromanipulador Sutter colocado en el escenario xy </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Recetas </td></tr><tr><td> Artificial líquido cefalorraquídeo </td><td> NaCl (135 mM), KCl (5,4 mM), MgCl 2 (1,0 mM), CaCl 2 (1,8 mM), HEPES (5 mM), pH 7,4 </td></tr><tr><td> Adición de la solución 14 </td><td> NaCl (150 mM), KCl (2,5 mM), HEPES (10 mM), pH 7,4 </td></tr></tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted labeling of neurons in a specific functional micro-domain of the neocortex by combining intrinsic signal and two-photon imaging

En la corteza visual primaria de los mamíferos no roedores, las neuronas se agrupan de acuerdo a su preferencia por las características del estímulo como la orientación 1-4, 5-7 dirección dominación, ocular 8,9 y disparidad binocular 9. Selectividad de orientación es la característica más ampliamente estudiado y un mapa continuo con un diseño cuasi-periódico de orientación preferida está presente en toda la corteza visual primaria 10,11. La integración de los aportes sinápticas, celular y de red que conducen a las respuestas de estímulos selectivos en estos mapas funcionales requiere de la hibridación de técnicas de imágenes que abarcan sub-micrón milímetros a escalas espaciales. Con los métodos convencionales de la señal óptica intrínseca, la disposición general de los mapas funcionales a lo largo de toda la superficie de la corteza visual se puede determinar 12. El desarrollo in vivo de dos fotones microscopía utilizando colorantes sensibles al calcio permite a uno determinar la SYNAPTentrada ic llegar a las espinas dendríticas individuales 13 o registro de actividad simultánea de cientos de los distintos órganos de células neuronales 6,14. Por consiguiente, la combinación de imágenes de señal intrínseca con la resolución submicrónica espacial de dos fotones microscopía ofrece la posibilidad de determinar exactamente qué segmentos dendríticas y células contribuyen a la micro-dominio de cualquier mapa funcional en el neocórtex. Aquí se demuestra un método de alto rendimiento para la rápida obtención de un mapa cortical y orientación dirigida a un microorganismo específico de dominio en este mapa funcional para el etiquetado de las neuronas con colorantes fluorescentes en un mamífero no roedora. Con el mismo microscopio usado para dos fotones de formación de imágenes, en primer lugar generar un mapa de orientación utilizando imágenes de señal óptica intrínseca. A continuación, le mostramos cómo dirigir una micro-dominio de interés utilizando una micropipeta cargada de tinte a cualquiera de etiqueta con una población de cuerpos de células neuronales o la etiqueta de una sola neurona de tal manera que las dendritas y los axones, las espinas son visibles envivo. Nuestros criterios de búsqueda sobre los métodos anteriores facilitar el examen de neuronales relaciones estructura-función con la sub-celular resolución en el marco de neocorticales arquitecturas funcionales.

Para ilustrar la precisión de los métodos de etiquetado de tinte, nos centramos en las más pequeñas micro-dominio de cualquier mapa que sepa que funciona en el neocórtex no roedor. Escasamente salpicado por todo el mapa de orientación en la corteza visual primaria son singularidades. Esto ocurre en los puntos donde convergen todas las orientaciones preferentes de tal manera que en los mapas de falso color de la orientación preferida, las regiones de todo el aspecto singularidad como &quot;molinillos&quot; <strong...

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Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

Se describe un método para el etiquetado de las neuronas con colorantes fluorescentes en funcional predeterminada micro-dominios del neocórtex. En primer lugar, la imagen de la señal óptica intrínseca se utiliza para obtener un mapa funcional. Luego de dos fotones microscopía se utiliza para etiquetar y neuronas imagen dentro de un dominio de micro del mapa.

Etiquetado dirigida de neuronas en una versión concreta de Micro-funcional de dominio de la neocorteza por combinar la señal intrínseca e Imagen de dos fotones

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

targeted-labeling-neurons-specific-functional-micro-domain-neocortex

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K vistas.  Medical University of South Carolina. Se describe un método para el etiquetado de las neuronas con colorantes fluorescentes en funcional predeterminada micro-dominios del neocórtex. En primer lugar, la imagen de la señal óptica intrínseca se utiliza para obtener un mapa funcional. Luego de dos fotones microscopía se utiliza para etiquetar y neuronas imagen dentro de un dominio de micro del mapa.

Video: Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Imágenes in vivo de la médula espinal de ratón Utilizando microscopía de dos fotones

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Investigación

Neurociencias

Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. Here we present a visualized experimental and methodological protocol to directly visualize microregional tissue hypoxia and to infer perivascular oxygen gradients in the mouse cortex. It is based on the non-linear relationship between nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) endogenous fluorescence intensity and oxygen partial pressure in the tissue, where observed tissue NADH fluorescence abruptly increases at tissue oxygen levels below 10 mmHg1. We use two-photon excitation at 740 nm which allows for concurrent excitation of intrinsic NADH tissue fluorescence and blood plasma contrasted with Texas-Red dextran. The advantages of this method over existing approaches include the following: it takes advantage of an intrinsic tissue signal and can be performed using standard two-photon in vivo imaging equipment; it permits continuous monitoring in the whole field of view with a depth resolution of ~50 &mu;m. We demonstrate that brain tissue areas furthest from cerebral blood vessels correspond to vulnerable watershed areas which are the first to become functionally hypoxic following a decline in vascular oxygen supply. This method allows one to image microregional cortical oxygenation and is therefore useful for examining the role of inadequate or restricted tissue oxygen supply in neurovascular diseases and stroke.

Here we describe a method to directly visualize microregional tissue hypoxia in the mouse cortex in vivo. It is based on concurrent two-photon imaging of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and the cortical microcirculation. This method is useful for high resolution analysis of tissue oxygen supply.

La detección de la hipoxia Microrregional en corteza cerebral de ratón por la imagen de dos fotones de fluorescencia endógena NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Marcaje fluorescente retrógrada Permite dirigida extracelular sola unidad de grabación de neuronas identificadas<em&gt; En vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In vivo de dos fotones de imágenes de dependientes Experience-Los cambios moleculares en las neuronas corticales

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

De dos fotones<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de las espinas dendríticas en la corteza del ratón Usando un Diluido-cráneo Preparación

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

De dos fotones de imágenes de Dinámica Celular en la médula espinal de ratón

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Proyección de imagen de calcio de dos fotones en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

Ablación de una población Neuronal utilizando un láser de dos fotones y su evaluación mediante grabación comportamiento y proyección de imagen de calcio en las larvas de pez cebra

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

En Vivo Proyección de imagen de dos fotones de neuronas corticales en ratones neonatales

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Advanced Diffusion Imaging in The Hippocampus of Rats with Mild Traumatic Brain Injury

Mild traumatic brain injury (mTBI) is the most common type of acquired brain injury. Since patients with traumatic brain injury show a tremendous variability and heterogeneity (age, gender, type of trauma, other possible pathologies, etc.), animal models play a key role in unraveling factors that are limitations in clinical research. They provide a standardized and controlled setting to investigate the biological mechanisms of injury and repair following TBI. However, not all animal models mimic the diffuse and subtle nature of mTBI effectively. For example, the commonly used controlled cortical impact (CCI) and lateral fluid percussion injury (LFPI) models make use of a craniotomy to expose the brain and induce widespread focal trauma, which are not commonly seen in mTBI. Therefore, these experimental models are not valid to mimic mTBI. Thus, an appropriate model should be used to investigate mTBI. The Marmarou weight drop model for rats induces similar microstructural alterations and cognitive impairments as seen in patients who sustain mild trauma; therefore, this model was selected for this protocol. Conventional computed tomography and magnetic resonance imaging (MRI) scans commonly show no damage following a mild injury, because mTBI induces often only subtle and diffuse injuries. With diffusion weighted MRI, it is possible to investigate microstructural properties of brain tissue, which can provide more insight into the microscopic alterations following mild trauma. Therefore, the goal of this study is to obtain quantitative information of a selected region-of-interest (i.e., hippocampus) to follow up disease progression after obtaining a mild and diffuse brain injury.

The overall goal of this procedure is to obtain quantitative microstructural information of the hippocampus in a rat with mild traumatic brain injury. This is done using an advanced diffusion-weighted magnetic resonance imaging protocol and region-of-interest based analysis of parametric diffusion maps.