En este video, estaremos demostrando el cultivo de ganglios cervicales superiores a ratas embrionarias para el análisis morfológico y proteómico. Antes de comenzar la disección, prepare los medios de control y disección. Medio de control contiene F-12 y baja glucosa DMEM complementado con una mezcla de insulina-selenio-transferrina, glutamina, factor de crecimiento nervioso, y BSA.
El medio de disección contiene L-15 complementado con estreptococo y BSA. Consulte el manuscrito para obtener protocolos detallados para la preparación de los medios. Preparación de placas para el cultivo de neuronas.
Diluir un stock de un miligramo por mililitro de poli-D-lisina a 100 microgramos por mililitro con agua destilada estéril. Para el análisis proteómico o genómico, uno a dos días antes de la disección, recubrir placas de seis pocillos con aproximadamente dos mililitros de 100 gramos estériles por mililitro de poli-D-lisina. Esto es necesario para asegurar la adhesión celular al pozo.
Envuelva los platos con película de aferramiento y guarde los platos durante la noche a cuatro grados centígrados. El día de la disección, antes del inicio de la disección, retire la solución de poli-D-lisina de los pozos y enjuague los pozos cinco veces con agua destilada estéril, seguida de una vez con DMEM de baja glucosa. Durante la digestión enzimática de los ganglios, aproximadamente una hora antes de encoar las células, aspirar el DMEM de las placas y reemplazarlo con 0,3 mililitros de medio de control.
Almacene las placas a 35 grados centígrados bajo 5% CO2 en una cámara humidificada. En el capó, configure los siguientes elementos para la disección. Cuatro tubos cónicos estériles de 50 mililitros con unos 20 mililitros de medios de disección en cada tubo.
Cuatro platos estériles de 35 milímetros con 1,5 mililitros de medios de disección. Un tubo cónico estéril de 50 mililitros con 20 mililitros de medios de disección para centrifugación. Un tubo cónico estéril de 15 mililitros para centrifugar los ganglios, un tubo estéril de 10 mililitros para recoger las células disociadas.
Utilice un esterilizador de perlas secas para esterilizar un par de fórceps finos durante al menos un minuto. Todos los procedimientos realizados en estudios con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Saint Mary's College de California. Las pautas de cuidado y uso de animales en el Saint Mary's College of California se desarrollaron sobre la base de las directrices proporcionadas por la Oficina de Bienestar Animal de Laboratorio en los Institutos Nacionales de Salud.
Extirpación de embriones E21 de la rata embarazada. Tenga en cuenta que la eliminación de la bocina uterina se puede realizar fuera de la campana si el área circundante está completamente esterilizada. Eutanasiar una rata embarazada con inhalación de CO2.
Corta el pelaje de la región abdominal y limpia la piel de la zona con 70% de alcohol para esterilizarlo. Usando un nuevo conjunto de tijeras estériles y fórceps, cortar a través de la piel y luego el músculo para exponer los cuernos uterinos que contienen los embriones. Retire el cuerno uterino con los embriones, utilizando un nuevo conjunto de tijeras y fórceps, teniendo cuidado de no dañar los intestinos en el proceso.
Transfiera el cuerno uterino con los embriones en una placa Petri estéril de 150 milímetros y transfiéralas a la capucha. Usando un nuevo conjunto de fórceps y tijeras, retire los embriones del cuerno uterino y separe los embriones de las membranas amnióticas y la placenta. Para eutanasiar los embriones, corte la médula espinal de los embriones a lo largo de la línea media bajo el brazo derecho.
Esto reducirá el sangrado de la arteria carótida durante la extracción del SCG. Transfiera estos embriones a los tubos cónicos de 50 mililitros preparados que contienen medios de disección. Asegúrese de que los embriones estén sumergidos en los medios.
Cada tubo puede contener hasta tres embriones. Aislamiento del ganglio cervical superior del embrión. Transfiera un cachorro del medio de disección a un plato estéril de 150 milímetros de Petri medio lleno de sustrato sólido con su superficie dorsal en el sustrato.
Usando tres agujas estériles de calibre 23, coloque el pub en el plato con una aguja debajo de cada brazo y una tercera aguja a través de la boca para hiperextender cuidadosamente el cuello. Corte a través de la piel en la región del cuello usando fórceps finos estériles para exponer las glándulas salivales debajo. Retire estas glándulas usando fórceps finos.
Localice los músculos esternocleidomastoide y omohyoid cerca de la clavícula y la tráquea respectivamente. Primero, corta los músculos esternocleidomastoideos transversales. Y luego cortar cuidadosamente el músculo omohyoid delgado usando fórceps finos.
Una vez que se retiran estos músculos, la bifurcación en la arteria carótida en el extremo anterior, será visible a ambos lados de la tráquea con el SCG situado debajo de esta horquilla en la arteria carótida. Con fórceps cerrados, levante suavemente la arteria carótida para visualizar el SCG. Usando un fórceps a cada lado del SCG, extraiga la carótida y transfiérala a los platos estériles preparados de 35 milímetros.
Lo más probable es que este tejido contenga el SCG con la arteria carótida, el nervio vago con los ganglios nodosos, así como otros segmentos de músculo o grasa en la zona. Repita el proceso de disección en el otro lado. Retire los SG de todos los embriones antes de continuar con los pasos de disección restantes descritos.
Distribuir los tejidos aislados entre dos de los platos de 35 milímetros para facilitar el procesamiento de las muestras de tejido. Post-procesamiento del SCG. Para separar el SCG del tejido diseccionado, primero use fórceps finos para extraer cualquier tejido extraño, como músculo o grasa, teniendo cuidado de evitar el área cerca de la bifurcación carótida.
Una vez que estos tejidos han sido retirados, dos ganglios son visibles. El ganglio nodoso es más pequeño y circular, mientras que el SCG tiene forma de almendra. Tire suavemente del nervio vago para separar el nervio vago y los ganglios nodosos de la carótida y luego separe el SCG de la arteria carótida.
Utilice fórceps finos para extraer la cápsula que rodea el SCG. Transfiera el SCG a un nuevo plato de cultivo de 35 milímetros. Repita este proceso con todas las muestras de tejido diseccionado.
Recubrir una pipeta de vidrio esterilizada, enchufada con algodón, con medios de disección para evitar que el tejido se adhire a las paredes de la pipeta. Utilice la pipeta para reemplazar el medio de disección por dos mililitros estériles de colágeno tipo II, dispase tipo II en HBSS libre de calcio y magnesio e incubar durante 50 minutos a 37 grados Celsius para ayudar a descomponer los tejidos. Tenga en cuenta que los tiempos de incubación pueden necesitar ser optimizados con diferentes lotes de colagenasa / dispase y por lo general oscila entre 40 minutos a una hora.
Después de la incubación, transfiera los SG y la colagenasa/disase a un tubo cónico estéril de 15 mililitros. Utilice el soporte de disección para enjuagar las placas y transferir la solución al tubo. Agregue suficientes medios de disección para llevar el volumen a aproximadamente 10 mililitros.
Centrifugar a 200 x g, 1.000 a 1.200 rpm durante cinco minutos a temperatura ambiente para peletizar la muestra. Aspirar el sobrenadante, teniendo cuidado de no desalojar el pellet. Resuspender el pellet con 10 mililitros de medios de disección, repetir la centrifugación y desechar el sobrenadante.
Reemplace con uno o dos mililitros de medio de cultivo. Usando una pipeta Pasteur estéril de punta estrecha y doblada, precubre con un medio de cultivo, disocia mecánicamente los grumos triturando suavemente de cinco a seis veces. Deje que los grumos más grandes se conformen durante aproximadamente un minuto y transfieran la suspensión de la célula sobrenadante a un nuevo tubo de 10 mililitros.
Repita este proceso tres veces más con una fuerza creciente de trituración cada vez para asegurar la disociación casi completa de los SCG. Transfiera el sobrenadante después de cada ronda de trituración al tubo de 10 mililitros con el sobrenadante de la primera trituración. Agregue suficientes medios de cultivo para llevar el volumen a ocho a 10 mililitros.
Mezclar suavemente una suspensión celular y cuantificar la densidad celular con un hemocitoómetro. Distribuya la suspensión celular en los pozos con la densidad celular adecuada para los experimentos. Mezclar la suspensión celular continuamente durante el proceso de chapado para asegurar una distribución uniforme de las células en los pozos.
Para el análisis morfológico, placar las células alrededor de 8.000 células por pozo en una placa de 24 pozos. Y para los protocolos genómicos y proteómicos, placa las células tan altas como 30.000 células por pozo. Transfiera las placas a un desecador de vidrio con agua estéril en la parte inferior para crear una cámara humidificada.
Inyectar suficiente CO2, alrededor de 120 mililitros, para obtener un entorno de 5% CO2 en el desecador, antes del sellado. Mantenga las placas a 35,5 grados centígrados. Esto se conoce como día cero en el protocolo.
Estas placas también se pueden mantener en una incubadora regular de 5% de CO2. El método descrito anteriormente minimiza los cambios de temperatura y pH y también ayuda a prevenir la contaminación cruzada. Mantenimiento de las neuronas y tratamientos SCG cultivados.
Estas imágenes muestran las células de ganglios cervicales superiores disociadas en el día cero, el primer día y el día cinco. La imagen del día cero muestra las celdas al enchapar. Las células chapadas en el día cero contienen una mezcla de células neuronales y no neuronales.
En el primer día, 24 horas después del enchapado, retire cuidadosamente la mitad de los medios de cultivo y reemplazar con dos micromolar Ara-C, citosina D-arabinofuranoside, un agente antimitético. Deje el tratamiento en las celdas durante 48 horas. Por lo general, esta duración del tratamiento es suficiente para eliminar las células no neuronales en el cultivo.
En el tercer día, aspira suavemente la mitad del medio y sustituirlo por medio de control. En el cuarto día, las células están listas para tratamientos experimentales. Alimentar cultivos cada dos días con el medio adecuado.
Sustitución suave de la mitad del medio en el pozo por un medio fresco. El cuadro del quinto día muestra un crecimiento axonal extenso sin crecimiento dendrítico observado. Para inducir el crecimiento dendrítico, las neuronas pueden cultivarse en Matrigel o tratarse con 10%suero o 50 nanogramos por mililitro de proteína morfogenética ósea-7.
La figura dos muestra cambios en la morfología neuronal de las neuronas DE SCG de rata E21 después del tratamiento con BMP-7. Micrografías de contraste de fase representativas a 10 X de aumento muestran el cuerpo celular neuronal circular con axones en las neuronas de control en el panel A, y las neuronas con múltiples procesos cortos similares a la dendrita cuando se tratan con BMP-7 mostrados por las flechas en el panel B.Las neuronas SCG cultivadas siguiendo los tratamientos apropiados se pueden utilizar para el análisis morfológico utilizando la tinción inmunocitatoquímica para el análisis genómico y para estudios bioquímicos , por ejemplo, para análisis proteómicos. Consulte el manuscrito para conocer los protocolos detallados para la inmunosumanidad y la preparación de muestras para el análisis proteómico.
La figura tres muestra la inmunosumanción de la proteína MAP-2 en ratas embrionarias cultivadas con neuronas simpáticas. Los paneles A a D muestran neuronas SCG cultivadas tratadas con medios de control y paneles E a H muestran neuronas tratadas con BMP-7 a 50 nanogramos por mililitro durante cinco días. Micrografías representativas que muestran la tinción inmunocitoquímica de las neuronas con proteína asociada a microtúbulos-2 en C y G, una mancha nuclear en D y H con micrografías de contraste de fase en B y F, y emergen de los tres canales en A y D.La tinción inmunocitoquímica de microtúbulo proteína asociada-2 está presente en el cuerpo celular y axones proximales de neuronas de control en el panel C.Y la tinción de la proteína MAP-2 en el cuerpo celular , y las dendritas en las neuronas tratadas con BMP-7 se encuentra en el panel G.Aquí hay una muestra de ganglios cervicales superiores tratados con medios de control, que detectaron 1.100 proteínas.
La ontología genética utilizando la base de datos Panther encontró que la mayoría de las proteínas eran citoplasmáticos. Sin embargo, había proteínas y proteínas unidas a la membrana en las uniones celulares de la muestra. Este análisis también reveló que las proteínas que están involucradas en una amplia gama de vías de señalización neuronal se detectaron en la muestra.
En conclusión, después de ver este video, usted debe ser capaz de aislar y cultivar las neuronas ganglionares cervicales superiores embrionarias de rata para el análisis morfológico y proteómico. Este trabajo fue financiado por el fondo de desarrollo de la facultad y el programa de investigación de verano en saint Mary's College of California.
