Name: an assay for measuring the effects of ethanol on the locomotion speed of caenorhabditis elegans
Uploaded: 2015-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
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Estos estudios fueron apoyados por becas de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional de Alcoholismo y Abuso de Alcohol: R01AA016837 (JCB) y P20AA017828 (AGD y JCB).

1. Pasos para realizar en el día antes del ensayo <ol><li> Recogida L4 etapa gusanos a medio de crecimiento fresco nematodo placas (NGM) sembradas con un césped de OP50 E. coli, y la cultura de ellos a 20 CO / N. Cada condición de ensayo requiere 10 gusanos; recoger un exceso de gusanos para permitir la O / N pérdida de gusanos. <ol><li> Sólo los animales de ensayo que son los adultos de primer día; muchos mutantes crecen a una velocidad más lenta que la de tipo salvaje. Ajuste el tiempo de la cosecha para las cepas que tienen retrasos en el desarrollo a fin de que todos los animales analizados adultos de primer día. </li></ol></li></ol> 2. Los pasos para realizar en el día del ensayo <ol><li> Preparación para el ensayo: <ol><li> Realizar ensayos de 60 x 15 mm placas no cabezas de serie estándar NGM. Seque todas las planchas que se utilizarán a 37 ° C durante 2 horas, con tapas de descanso. Para cada ensayo experimental, utilizar cuatro NGM placas secas; Estos serán los 0 mM y mM placas de ensayo de etanol 400 y sus placas de aclimatación de acompañamiento. NOTA:El uso de placas de NGM es importante en este caso; las diferencias en la composición de las placas, en particular, su osmolaridad, pueden afectar fuertemente la respuesta a la dosis de etanol en el comportamiento, esto es debido, al menos en parte, a los cambios en la cantidad de etanol acumulado por los animales 20. Agar NGM es de 160 mOsm. </li><li> Después del secado, pesa cada una de las placas de NGM cabezas de serie para ser utilizado en el ensayo y anotar el peso. Determinar el volumen de los medios en las placas basadas en el peso de una placa de vacío. Para aproximar la conversión de peso del agar al volumen, se supone que los medios de comunicación pesa lo mismo que un volumen igual de agua. NOTA: Nuestros resultados más consistentes se han encontrado con los medios NGM que ha deshidratado suficientemente que un volumen original ml 10 tiene un volumen de post-secado entre 8.3 a 8.9 ml. Una alternativa para el tiempo de secado 2 hr es secar hasta que las placas llegan a este rango de volumen para tener en cuenta las diferencias en las incubadoras. </li><li> Derrita 4 anillos de cobre (diámetro interior de 1.6 cm) en la superficie de cada una de las placas para actuar como corrales para los diferentes genotipos o grupos de tratamiento de worms.Grasp cada anillo con fórceps, y el calor en una llama (una fuerte llama de un mechero Bunsen funciona bien) durante aproximadamente 3 seg. Inmediatamente coloque el anillo en un plato, mientras que mantiene el anillo con las pinzas para evitar que se &#39;salta&#39;. <ol><li> Asegúrese de que el anillo descansa plana contra la superficie del agar presionando hacia abajo suavemente con las pinzas en varios puntos en el anillo. Al colocar el anillo, tenga cuidado de dejar espacio para un período adicional de tres anillos. </li><li> Fundir los tres anillos adicionales de cobre en la superficie de la placa, teniendo cuidado de colocarlos lo más cerca posible, de manera que los cuatro estarán en el campo de visión de la cámara. NOTA: Hacer un buen sello con el agar es esencial para mantener los gusanos en los anillos durante el ensayo. Los anillos que se saltan alrededor en la placa son poco probable que el sello correcto con el agar ypuede dejar cicatrices en el agar, que permite a los gusanos de madriguera e interfiere con la visualización de los gusanos. </li><li> Para cada placa de ensayo preparar un plato de acompañamiento &quot;aclimatación&quot;, que debe ser seca y no cabeza de serie y no recibirán etanol. Coloque cuatro anillos de cobre en estas placas. </li></ol></li><li> Etiquetar el fondo de las placas junto a cada anillo con la cepa de gusano para ser utilizado en el anillo, teniendo cuidado de no escribir en el campo de visión del propio anillo. Coinciden con las etiquetas de la placa de ensayo con su placa de aclimatación acompaña. </li><li> Calcular la cantidad de etanol 100% a añadir a cada placa de ensayo de manera que la concentración final es de 0 mM o 400 mM de etanol (peso a volumen). Para cada experimento (n = 1), habrá un 0 mM y una placa de etanol 400 mM; placas de aclimatación no reciben etanol. Añadir el etanol, el pipeteado de que alrededor de la superficie de la placa. Utilice película de laboratorio para sellar la placa y deje que se equilibre en la mesa de laboratorio durante 2 horas. </li><li> Cuando ha transcurrido 1,5 horas, comenzar la etapa de aclimatación de ensayo, paso 2.2. </li></ol></li><li> Realizar el ensayo de locomoción: Las placas de ensayo <ol><li> Transferir cuidadosamente 10 gusanos de cada grupo experimental al centro de un anillo de cobre en la placa de aclimatación. Retire cualquier alimento que es visible en el agar en este punto, raspando suavemente con la selección gusano. Variar el orden en que los grupos experimentales se ponen en los platos entre los ensayos experimentales de modo que las mismas cepas no se ponen en los platos en el mismo orden entre los ensayos. NOTA: El objetivo es transferir los animales a la placa con cantidades mínimas de alimentos, porque si comida en el plato de aclimatación se transfiere a la placa de ensayo de los gusanos se agregarán alrededor de la comida y el efecto de la droga sobre la locomoción será oscurecido. </li><li> Tenga cuidado de no romper la superficie del agar con la selección, ya que esto permitirá que los gusanos madriguera y interrumpirá el ensayo. Incubar los gusanos a ta durante 30 min. </li><li> Asegúrese de que hay un intervalo adecuado entre las iniciaciones de cada placa. Un experimentador experimentado puede mover 40 animales, 10 / anillo de 4 anillos en &lt;1,5 min, pero cualquier intervalo de hasta 2 minutos es aceptable. El ensayo estándar tiene la grabación de películas en 10-12 minutos y 30-32 minutos de exposición para ambos 0 mM y etanol 400 mM. </li><li> Iniciar la placa de aclimatación para la exposición 0 mM y la placa de aclimatación para la exposición 400 mM aproximadamente 2 minutos y 30 segundos de separación para permitir el ahorro del primer archivo de la película antes de que debe comenzar la segunda película. </li><li> Después de que el período de aclimatación de 30 min, la transferencia de los gusanos de las placas de aclimatación a las placas de ensayo. La transferencia de los gusanos a las placas de ensayo (0 mm o etanol 400 mM) en el mismo orden en que se añadieron a la placa de aclimatación, el seguimiento de la sincronización entre las terminaciones de cada placa. Sellar la placa con película de laboratorio para minimizar la pérdida de etanol a la vaporización. </li><li> Use un movimiento de pala con un pico gusano delgado filo aplanado para recoger gusanos en la parte superior del pico aplanado. Realizar la transferencia de los gusanos de la placa de la aclimatación no cabeza de serie a la placa de ensayo y sin el uso de bacterias, que se utiliza comúnmente en la transferencia de los gusanos, ya que ayuda a pegar el gusano a la selección. NOTA: La velocidad a la que los animales se transfieren en este paso es muy importante porque los primeros gusanos en la placa estarán expuestos a etanol más largo que los últimos gusanos añadieron a la placa, y los puntos de tiempo anteriores puede mostrar algunos efectos dependientes del tiempo. Esta es la principal razón para hacer girar las cepas se colocan en un plato de primera a través de repeticiones experimentales. </li></ol></li><li> Realizar Locomotion Ensayo: El rodaje <ol><li> Use una combinación microscopio / cámara que permite la formación de imágenes simultánea de los cuatro anillos en el campo de visión (42x42 cuadrados aproximadamente 2 mm), tal como un objetivo de microscopio 0,5x, 0,8x de aumento y una cámara con un 7,4 2048x204881; m CCD pixel. </li><li> Utilice iluminación uniforme en todo el campo de visión, que ayuda en el reconocimiento de objetos en la etapa umbral de intensidad (véase más adelante). Una luz de fondo 3 &quot;x3&quot; funciona bien. </li><li> Imagen de los gusanos en una placa colocada de lado los medios de comunicación hacia arriba (de la tapa hacia abajo), lo que genera el contraste que se pierde cuando se utiliza la luz de fondo en comparación con un microscopio tradicional fuente de luz. </li><li> Preparar el software de análisis de imagen para capturar películas a intervalos de los gusanos en movimiento. Configure el software para capturar imágenes de 12 bits en escala de grises cada 1 seg, como a 2 min (120 marco) película. Para reducir el tamaño del archivo de salida, mientras que todavía conserva suficiente resolución de la imagen, usar un modo de binning 2x2 para capturar imágenes 1024x1024 píxeles. </li><li> Grabe las películas. Comienza la grabación de una película 120-marco de la primera placa (etanol 0 mM) 10 min después de los últimos gusanos se colocaron en ese plato. Guarde el archivo de película. </li><li> Registre la segunda placa (etanol 400 mM). Repita este proceso paraambas placas comenzando 30 minutos después de los últimos gusanos fueron colocados en la primera placa (etanol 0 mM) para capturar los puntos de tiempo de 30-32 min para cada exposición. NOTA: Deje tiempo suficiente para guardar los archivos de imagen después de cada sesión de captura antes de iniciar la grabación de la próxima placa para ser analizados. </li><li> Para prueba de futuro de las películas archivados y permitir que estas películas sean abiertos y analizados por otros programas de software de imágenes de código abierto de dominio público, como ImageJ 28, convertir una copia de cada película a 8 bits 256 archivos TIFF de escala de grises. NOTA: El software de análisis de imágenes se describe aquí utiliza un formato de archivo propietario. </li></ol></li><li> Análisis de películas usando software ImagePro. <ol><li> Una vez capturados, analizar las películas usando Plus software Image-Pro o su equivalente. NOTA: una variedad de otros software de seguimiento de objeto está disponible que ha sido utilizado con éxito para rastrear múltiples C. elegans de una sola vez 29 y talessoftware razonablemente podría sustituir a la descrita aquí como los pasos de identificación de objetos se basan en principios similares. El método descrito se refiere a las versiones de Image-Pro Plus software 6,0-6,3 y 7.0, las versiones más recientes del software de Image-Pro Plus puede tener pequeñas diferencias. </li><li> Analizar películas en segmentos de 2 min (120 marco). En primer lugar, aplicar un filtro a las imágenes para aplanar el fondo y mejorar el contraste de los objetos de gusano. Seleccione el filtro de la siguiente manera: Menú&gt; Proceso&gt; Filtros&gt; Accesorio&gt; Acoplar: Parámetros: Antecedentes = oscuro; Característica Ancho = 20 Pix. </li><li> Vuelva a guardar las películas después de la etapa de filtración, pero siempre conservará la película original en su forma sin filtrar. <ol><li> Analizar la locomoción de los animales en cada anillo por separado con una región circular de interés (ROI) que se coloca y dimensiona para solaparse con el anillo de cobre. Identificar y seguir a los gusanos con el Menú&gt; Medida&gt; Pista Objetos ... comando; esto nos lleva a la Tracking Dventana Tabla ata. El botón Opciones de seguimiento permite pistas específicas que deben excluirse y limitar los artefactos experimentales. </li></ol></li><li> En la ficha de seguimiento automático, utilice los siguientes parámetros: Parámetros de pista: límite de velocidad (el radio de búsqueda) = 400 m / marco, límite de aceleración = Auto, longitud total de pistas mínima = 400 m, tipo de movimiento predominante = caótica; Los objetos en parámetros pistas: Permitir pistas parciales = yes, longitud Min = 21 marcos, Seguimiento profundidad predicción = 1 marco. </li><li> Para iniciar el proceso de seguimiento, haga clic en el Buscar sus temas de forma automática botón de función para abrir el / cuadro de diálogo Opciones en medidas Conde y el cuadro de diálogo de seguimiento. Seleccione la opción Manual para la Selección de rango de intensidad en el cuadro de diálogo Contador / tamaño, que proporciona el paso del umbral importante que utiliza la intensidad en escala de grises de los píxeles de gusano para resaltar un objeto gusano para el análisis y hacer caso omiso de los antecedentes más claros píxeles. <ol><li> Ajuste el sli umbral de intensidadDers (uno para establecer el límite superior, uno para establecer el límite inferior) para crear un rango inclusivo que resalta todos los objetos oscuros. Una gama de 0-1,500 en una escala de 0-4,095 es un buen punto de partida para la sintonía fina. </li><li> Aplicar un filtro de tamaño para excluir los objetos que son más grandes y más pequeño que un solo objeto gusano, tales como el anillo de cobre y cualquier residuo en los platos. Establecer dos parámetros de tamaño para hacer esto que cubren tamaños de gusanos individuales en una variedad de posturas con la Medida&gt; Seleccionar Mediciones elemento de menú en el cuadro de diálogo Opciones Conde / Tamaño. (Rango de Área: 28,000-120,000 m 2 y la gama Perímetro: 600-2,500 micras). </li><li> Si una cepa mutante es significativamente más pequeño o más grande que otros animales en la placa a analizar, ampliar la gama de los valores de filtro para el reconocimiento de objetos para dar cabida a los diferentes tamaños de las cepas primero antes de seguimiento de los animales para que los ajustes no necesitan ser cambiados mediados de análisis. </li></ol> &lt;/ Li&gt; <li> Completar el proceso de seguimiento, haga clic en Continuar en el cuadro de diálogo de seguimiento. Comparar visualmente las pistas de salida con el progreso de cada gusano en la película para asegurar que cada gusano se representa a menos que haya una razón válida para excluir que en base a la configuración de filtros automáticos. Elimine manualmente las pistas que fueron producidos por la presencia de objetos que no son gusanos confirmado que cumplían con los criterios de filtrado de tamaño. </li><li> Utilice el software para calcular la velocidad de cada gusano entre cada fotograma (distancia recorrida por el centro de gravedad de un objeto por 1 seg entre bastidores) y mostrar la velocidad promedio para cada pista y la velocidad promedio en todas las pistas para la población de gusanos en el anillo de cobre. Considere este promedio final sea n = 1 en términos de ensayos experimentales. Exportar los datos a una hoja de cálculo para el análisis estadístico y el archivado de datos. </li><li> Una vez que los datos han sido registrados en el primer anillo en la placa, mueva el retorno de la inversión para el siguiente anillo yrepita el proceso de seguimiento, sin cambiar ninguno de los parámetros. </li><li> Calcular la velocidad relativa de la locomoción a través de: </li><li> Velocidad relativa (%) = tratado (400 mM) Velocidad / no tratada (0 mm) Velocidad x 100. NOTA: Las diferentes manipulaciones genéticas menudo alteran la tasa de locomoción basal de los animales. Con el fin de determinar el efecto del etanol sobre la velocidad de locomoción de los animales y para poder comparar estos efectos a través de diferentes genotipos o condiciones, calcular una velocidad relativa. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

La neurobiología simple y herramientas genéticas disponibles en C. elegans hacer el gusano un excelente modelo en el que el estudio de las bases moleculares de los efectos del etanol sobre el comportamiento. Aquí se describe un ensayo que se ha utilizado para identificar varios mediadores moleculares y ambientales de la respuesta de comportamiento aguda a etanol 8,10,20,24,25. Este método permite la diferenciación y el examen simultáneo de dos fenotipos comportamiento de respuesta etanol difere...

Alcohol use disorders (AUD) are widespread and produce serious health, social, and economic problems. In humans, the susceptibility to developing an AUD is heavily influenced by both genetics and the environment1,2. A strong physiological predictor of abuse liability is the initial level of response (LR) to alcohol (ethanol) that is exhibited by na&#239;ve drinkers3-5. This LR phenotype is influenced by genetics and non-genetic components6. Determining the molecular mechanisms that influence the LR to ethanol is an important goal of the study of ethanol response behaviors.
The nematode, Caenorhabditis elegans, has been increasingly used as a model for studying the effects of ethanol on behavior7-9. There is strong molecular conservation in the machinery of nervous system function between worms and mammals, and several genes that have been shown to influence the LR to ethanol in worms have been shown to influence LR to ethanol in mammals10-16, and have been implicated in abuse liability in humans17-19. 
Ethanol intoxicates worms, which is reflected in a decrease in their locomotion speed. Several different laboratories have developed behavioral assays that differ in several ways, for example, the locomotion behavior that they study (crawling versus swimming11,12,14,20,21) or in the composition of the solutions in which the assays are performed (nematode growth medium versus Dent&#8217;s saline20,22). Interestingly, these diverse assays have yielded somewhat different dose response profiles for the effects of ethanol. These results have pointed to important differences in the underlying behaviors of crawling and swimming9,23, as well as a role for the environmental variable osmolarity in ethanol responses20, and have highlighted the importance of describing experimental detail of the various assays.
An assay to measure the acute effects of ethanol on crawling behavior is presented here. This assay has been used extensively to study the genetic and environmental influences on the LR to ethanol8,10,20,24,25. The mammalian LR phenotype is a composite of at least two components, initial sensitivity to ethanol and acute functional tolerance to ethanol26,27. In worms, the LR phenotype has been shown to be separable into these two components through the use of this behavioral assay. The influences of genetic and environmental manipulations on both phenotypes can be examined using this single assay. Importantly, these two phenotypes are genetically separable.

<table><tbody><tr><td>C. elegans strains</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>60 x 15 mm Petri plates, triple vented</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628161</td><td>Other plate brands will suffice.</td></tr><tr><td>NGM agar</td><td>Various</td><td></td><td>NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1 ml (1 M) CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 25 ml (1 M) KPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, pH=6, 975 ml H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Various</td><td></td><td>&lt;I&gt;e.g.&lt;/I&gt;, Fisher Scientific #10300</td></tr><tr><td>37 &amp;deg;C Incubator</td><td>Various</td><td></td><td>For drying agar</td></tr><tr><td>Digital balance</td><td>Various</td><td></td><td>For determining plate weights and agar volume</td></tr><tr><td>Copper rings</td><td>Plumbmaster</td><td>STK#35583 (48 cap thread gasket)</td><td>1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings</td></tr><tr><td>100% ethanol</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>QImaging</td><td>RET-4000R-F-M-12</td><td>This camera has a large field of view.</td></tr><tr><td>Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td>Discontinued model, M60 is current equivalent.</td></tr><tr><td>Light source</td><td>Schott</td><td>A08923</td><td>3&amp;rdquo;x3&amp;rdquo;&amp;nbsp; backlight for even illumination across the field of view</td></tr><tr><td>Imaging and tracking software</td><td>Media Cybernetics</td><td>ImagePro-Plus v6.0-6.3</td><td>Newer versions of the software have tracking functions.</td></tr></tbody></table>

an assay for measuring the effects of ethanol on the locomotion speed of caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

Los datos representativos (Figura 1) de varios genotipos diferentes y sus controles emparejados se presentan 8,24; datos fueron escogidos específicamente que las diferencias de relieve en los animales ensayados. El grado de efecto en 10 minutos de exposición se considera la sensibilidad inicial de una cepa, que se muestra en los ejes izquierda en la figura 1B-G. Las cepas mutantes con una velocidad relativa más grande que el control en 10 min se considera que son resistent...

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An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Un ensayo para medir los efectos del etanol sobre la velocidad de locomoción<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

an-assay-for-measuring-effects-ethanol-on-locomotion-speed

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

8.6K vistas.  Virginia Commonwealth University. C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay. 

Video: An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain is correlated with that strain s ethanol preference, and therefore sedation is a highly relevant measure to study the genetics of alcohol responses and drinking. We demonstrate a simple way to expose flies to ethanol and measure its intoxicating effects. The assay we describe can determine acute sensitivity, as well as ethanol tolerance induced by repeat exposure. It does not require a technically involved setup, and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A simple assay to measure the sedating effects of ethanol on Drosophila flies, based on the loss of righting reflex, is described.

Una manera sencilla de medir la sensibilidad de etanol en las moscas

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain ...

Investigación

Neurociencias

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

At the neuromuscular junction (NMJ), the binding of the excitatory neurotransmitter acetylcholine (ACh) to postsynaptic receptors leads to muscle contraction. As in vertebrate skeletal muscle, cholinergic signaling in the body wall muscles of the model organism Caenorhabditis elegans is required for locomotion. Exposure to levamisole, a pharmacological agonist of one class of ACh receptors on the body wall muscles, causes time-dependent paralysis of wild-type animals. Altered sensitivity to levamisole suggests defects in signaling at the NMJ or muscle function. Here, a protocol for a liquid levamisole assay performed on C. elegans grown in 24-well plates is presented. Vigorous swimming of the animals in liquid allows for the assessment and quantitation of levamisole-induced paralysis in hundreds of worms over a one-hour time period without requiring physical manipulation. This procedure can be used with both wild-type and mutants that have altered sensitivity to levamisole to demonstrate the functional consequences of altered signaling at the NMJ.

Measuring Caenorhabditis elegans Sensitivity to the Acetylcholine Receptor Agonist Levamisole

The present protocol describes an assay to determine response to levamisole, a pharmacological agonist of one class of Caenorhabditis elegans acetylcholine receptors. In this liquid levamisole swim assay, researchers visually observe and quantitate the time-dependent paralysis of animals cultivated in 24-well plates.

Medición de la sensibilidad de Caenorhabditis elegans al agonista del receptor de acetilcolina Levamisol

At the neuromuscular junction (NMJ), the binding of the excitatory neurotransmitter acetylcholine (ACh) to postsynaptic receptors leads to muscle ...

Genética

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C. elegans genome includes potential antipsychotic drug (APD) targets conserved in humans, including genes encoding proteins required for neurotransmitter synthesis and for synaptic structure and function. APD exposure produces developmental delay and/or lethality in nematodes in a concentration-dependent manner. These phenotypes are caused, in part, by APD-induced inhibition of pharyngeal pumping1,2. Thus, the developmental phenotype has a neuromuscular basis, making it useful for pharmacogenetic studies of neuroleptics. Here we demonstrate detailed procedures for testing APD effects on nematode development and pharyngeal pumping. For the developmental assay, synchronized embryos are placed on nematode growth medium (NGM) plates containing APDs, and the stages of developing animals are then scored daily. For the pharyngeal pumping rate assay, staged young adult animals are tested on NGM plates containing APDs. The number of pharyngeal pumps per unit time is recorded, and the pumping rate is calculated. These assays can be used for studying many other types of small molecules or even large molecules.

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Approaches for testing the effects of antipsychotic drugs (APDs) in Caenorhabditis elegans are demonstrated. Assays are described for testing drug effects on development and viability and on pharyngeal pumping rate. These methods are also applicable for pharmacogenetic experiments with drug classes other than APDs.

Métodos para el estudio de los mecanismos de acción de los fármacos antipsicóticos en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster provides an excellent model to study the genetic underpinnings of alcohol sensitivity. In contrast to studies in human populations, the Drosophila model allows strict control over genetic background, and virtually unlimited numbers of individuals of the same genotype can be reared rapidly under well-controlled environmental conditions without regulatory restrictions and at relatively low cost. Flies exposed to ethanol undergo physiological and behavioral changes that resemble human alcohol intoxication, including loss of postural control, sedation, and development of tolerance. Here, we describe a simple, low-cost, high-throughput assay for assessing alcohol sedation sensitivity in large numbers of single flies. The assay is based on video recording of single flies introduced without anesthesia in 24-well cell culture plates in a set-up that enables synchronous initiation of alcohol exposure. The system enables a single person to collect individual ethanol sedation data on as many as 2,000 flies within an 8 h work period. The assay can, in principle, be extended to assess the effects of exposure to any volatile substance and applied to measure effects of acute toxicity of volatiles on other insects, including other fly species.

High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster

Current methods to measure alcohol sensitivity in Drosophila are designed to test groups of flies. We present a simple, low-cost, high-throughput assay for assessing alcohol sedation sensitivity in large numbers of single flies. The method does not require specialized tools and can be performed in any laboratory using common materials.

Método de alto rendimiento para medir el tiempo de sedación del alcohol de la Drosophila melanogaster individual

Drosophila melanogaster provides an excellent model to study the genetic underpinnings of alcohol sensitivity. In contrast to studies in human ...

Comportamiento

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of diverse human diseases. Worms are particularly well-suited for high-throughput genetic and drug screens to gain deeper insight into therapeutic targets and therapies by exploiting their fast development cycle, large brood size, short lifespan, microscopic transparency, low maintenance costs, robust suite of genomic tools, mutant repositories, and experimental methodologies to interrogate both in vivo and ex vivo physiology. Worm locomotor activity represents a particularly relevant phenotype that is frequently impaired in mitochondrial disease, which is highly heterogeneous in causes and manifestations but collectively shares an impaired capacity to produce cellular energy. While a suite of different methodologies may be used to interrogate worm behavior, these vary greatly in experimental costs, complexity, and utility for genomic or drug high-throughput screens. Here, the relative throughput, advantages, and limitations of 16 different activity analysis methodologies were compared that quantify nematode locomotion, thrashing, pharyngeal pumping, and/or chemotaxis in single worms or worm populations of C. elegans at different stages, ages, and experimental durations. Detailed protocols were demonstrated for two semi-automated methods to quantify nematode locomotor activity that represent novel applications of available software tools, namely, ZebraLab (a medium-throughput approach) and WormScan (a high-throughput approach). Data from applying these methods demonstrated similar degrees of reduced animal activity occurred at the L4 larval stage, and progressed in day 1 adults, in mitochondrial complex I disease (gas-1(fc21)) mutant worms relative to wild-type (N2 Bristol) C. elegans. This data validates the utility for these novel applications of using the ZebraLab or WormScan software tools to quantify worm locomotor activity efficiently and objectively, with variable capacity to support high-throughput drug screening on worm behavior in preclinical animal models of mitochondrial disease.

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

This study presents protocols for two semi-automated locomotor activity analysis approaches in C. elegans complex I disease gas-1(fc21) worms, namely, ZebraLab (a medium-throughput assay) and WormScan (a high-throughput assay) and provide comparative analysis among a wide array of research methods to quantify nematode behavior and integrated neuromuscular function.

Análisis comparativo de métodos experimentales para cuantificar la actividad animal en modelos de enfermedad mitocondrial de Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

Alcohol use disorder (AUD) is a serious health challenge. Despite a large hereditary component to AUD, few genes have been unambiguously implicated in their etiology. The fruit fly, Drosophila melanogaster, is a powerful model for exploring molecular-genetic mechanisms underlying alcohol-related behaviors and therefore holds great promise for identifying and understanding the function of genes that influence AUD. The use of the Drosophila model for these types of studies depends on the availability of assays that reliably measure behavioral responses to ethanol. This report describes an assay suitable for assessing ethanol sensitivity and rapid tolerance in flies. Ethanol sensitivity measured in this assay is influenced by the volume and concentration of ethanol used, a variety of previously reported genetic manipulations, and also the length of time the flies are housed without food immediately prior to testing. In contrast, ethanol sensitivity measured in this assay is not affected by the vigor of fly handling, sex of the flies, and supplementation of growth medium with antibiotics or live yeast. Three different methods for quantitating ethanol sensitivity are described, all leading to essentially indistinguishable ethanol sensitivity results. The scalable nature of this assay, combined with its overall simplicity to set-up and relatively low expense, make it suitable for small and large scale genetic analysis of ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila.

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

Straightforward assays for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in Drosophila facilitate the use of this model organism for investigating these important ethanol-related behaviors. Here, a relatively simple, scalable assay for measuring ethanol sensitivity and rapid tolerance in flies is described.

Un ensayo de conducta Barato, escalable para medir etanol Sedación La sensibilidad y la tolerancia rápida en<em&gt; Drosophila</em

Alcohol use disorder (AUD) is a serious health challenge. Despite a large hereditary component to AUD, few genes have been unambiguously implicated in ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

C. elegans Ensayo de quimiotaxis

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Biología

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

C. elegans egg-laying behavior is affected by environmental cues such as osmolarity1 and vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease egg-laying and retain fertilized eggs in their uterus3. However, the effect of different sources of food, especially pathogenic bacteria and particularly Enterococcus faecalis, on egg-laying
	behavior is not well characterized. The egg-in-worm (EIW) assay is a useful tool to quantify the effects of different types of bacteria, in this case E. faecalis, on egg- laying behavior.
	
	EIW assays involve counting the number of eggs retained in the uterus of C. elegans4. The EIW assay involves bleaching staged, gravid adult C. elegans to remove the cuticle and separate the retained eggs from the animal. Prior to bleaching, worms are exposed to bacteria (or any type of environmental cue) for a fixed period of time. After bleaching, one is very easily able to count the number of eggs retained inside the uterus of the worms. In this assay, a quantifiable increase in egg retention after E. faecalis exposure can be easily measured. The EIW assay is a behavioral assay that may be used to screen for potentially pathogenic bacteria or the presence of environmental toxins. In addition, the EIW assay may be a tool to screen for drugs that affect neurotransmitter signaling since egg-laying behavior is modulated by neurotransmitters such as serotonin and acetylcholine5-9.

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

An egg-in-worm (EIW) assay is a useful method to quantify egg-laying behavior. Alterations in egg laying can be a behavioral response of the model organism Caenorhabditis elegans to potentially harmful environmental substances such as those produced by pathogenic bacteria.

Medición de los efectos de las bacterias en<em&gt; C. Elegans</em&gt; Comportamiento El uso de un ensayo de retención de huevo

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

Touch Habituation Assay: A Method to Study Non-Associative Learning in C. elegans

Source: Mersha, M. D., et al. <a href="https://www.jove.com/video/56771/long-term-behavioral-reproductive-consequences-embryonic-exposure-to">Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video introduces the touch habituation assay, a C. elegans behavioral method of assessing mechanosensation and quantifying time to habituation.

Ensayo de habituación al tacto: un método para estudiar el aprendizaje no asociativo en C. elegans

Source: Mersha, M. D., et al. Long-term Behavioral and Reproductive Consequences of Embryonic Exposure to Low-dose Toxicants. J. Vis. Exp. (2018).
This ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Caenorhabditis elegans (gusano)

Electrotaxis Assay: A Method to Observe Locomotion in C. elegans

Source: Tong, J,&#160;et al. <a href="https://www.jove.com/video/50226/microfluidic-based-electrotaxis-for-on-demand-quantitative-analysis">Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of&#160;Caenorhabditis elegans&#39; Locomotion.</a>&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2013).
Researchers can trigger on-demand movement in C. elegans by applying an electric field that worms sense and respond to.&#160; This video introduces electrotactic behavior and shows a sample protocol that is done in a microfluidic device.

Ensayo de electrotaxis: un método para observar la locomoción en C. elegans

Source: Tong, J,&#160;et al. Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of&#160;Caenorhabditis elegans&#39; Locomotion.&#160;J. ...

Un ensayo para medir los efectos del etanol sobre la velocidad de locomoción

Resumen

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