Damos las gracias a Ciencias de la Vida y de la Facultad de Artes y Ciencias en la Universidad de la Reina para la financiación de este trabajo. Además, agradecemos al laboratorio Chin-Sang de proporcionar los reactivos necesarios, equipo y soporte técnico. También agradecemos a QGEM 2011, especialmente de Tony El, por su contribución a la discusión.

1. Preparación / lavado de los gusanos <ol><li> Sincronizar los gusanos adultos jóvenes 11. </li><li> Pipetear 2 ml de la basal S sobre una placa de 5 cm quimiotaxis de escena gusanos que han borrado sólo el césped del OP50 E. coli. Incline la placa según sea necesario para asegurar que los gusanos se lavan de la superficie de la placa en el búfer. </li><li> Pipetear 1 ml de la solución basal gusano-S en un tubo de microcentrífuga. </li><li> Centrifugar durante 10 segundos utilizando un PicoFuge a 6.600 rpm. </li><li> Aspirar el Basal S, dejando el sedimento de gusanos inalteradas. </li><li> Añadir 1 ml de solución S Basal al tubo de microcentrífuga, invertir varias veces para lavar los gusanos. </li><li> Repetir los pasos 1.4 a 1.6 otras tres veces. </li><li> Centrifugar durante 10 seg quinta vez, esta vez de aspirar el sobrenadante a un volumen final de ca. 100 l. </li><li> Pipetear 2 l de los gusanos en una placa de NGM para garantizar que no entre 50 y 250 gusanos en cada uno de 2 l de muestra. Ajustarla concentración de gusanos en la basal S según sea necesario por la resuspensión de los gusanos en un volumen más pequeño o más grande de S basal. </li><li> Usa los gusanos en el ensayo inmediatamente después de lavar los gusanos durante un máximo de 1 hora. </li></ol> 2. Preparación de las placas de prueba <ol><li> Con motivo de la parte inferior de una placa de 5 cm, dividir el plato en 4 cuadrantes iguales. La quimiotaxis de agar NGM o pueden ser utilizados. Un mínimo de 3 ensayos son necesarios por cepa genética se está probando. </li><li> Marque un círculo de radio de 0,5 cm alrededor del origen (Figura 1). </li><li> Marque un punto en cada cuadrante, ya sea con una &quot;T&quot; de &quot;Test&quot; o &quot;C&quot; para el &quot;control&quot;, asegurar que los sitios son equidistantes del origen y la otra. Los puntos deben ser de al menos 2 cm de distancia desde el origen. Marque los cuadrantes superiores izquierda e inferior derecha como cuadrantes de prueba y de la parte superior derecha y los cuadrantes inferior izquierda como controles (Figura 1). </li></ol> 3. Ejecución del ensayo </p&gt; <ol><li> Mezclar la solución de ensayo mediante la combinación de volúmenes iguales del compuesto de ensayo y 0,5 M de azida (un anestésico utilizado para detener a los gusanos al llegar a un cuadrante). Mezclar la solución de control mediante la combinación del disolvente utilizado para diluir el compuesto de ensayo con 0,5 M de azida. </li><li> Pipetear 2 l de la solución de tornillo sin fin (preparado en 1.8) a partir del sedimento en el origen (donde las dos líneas se cruzan). </li><li> Inmediatamente después, pipeta de 2 l de la solución de prueba en los dos sitios de &quot;T&quot;. Del mismo modo, pipetear la misma cantidad de la solución de control en los dos sitios de &quot;C&quot;. </li><li> Una vez que las gotas de gusanos y olor han sido absorbidos en el agar, reemplace las tapas e invertir las placas. </li><li> Después de 60 minutos, colocar los gusanos en un 4 ° C incubadora. Sólo quitar una placa de la incubadora cuando se puede contar. Dejando gusanos a temperatura ambiente puede permitir a movilizar de nuevo. </li><li> Anote el número de gusanos en cada cuadrante que cruzó por completo la circ interiorle. </li><li> Repita los pasos 3.2 a 3.6 con la solución de control, tanto en la prueba y cuadrantes de control. Esto servirá como la placa de control. Tres de tales placas se deben hacer y ejecutar para servir como un control apropiado. </li></ol> 4. Interpretación de los Resultados / Determinación del índice de quimiotaxis <ol><li> Calcular el índice de quimiotaxis utilizando la ecuación 1. Esto dará lugar a un índice de quimiotaxis entre -1,0 y 1,0. </li></ol> (1) La quimiotaxis Index = (# Los gusanos de las casillas de prueba - # gusanos de las casillas de control) / (# total de Worms arco) Una puntuación de 1,0 indica atracción máxima hacia el objetivo y representa el 100% de los gusanos que llegan en los cuadrantes que contienen el objetivo química. Un índice de -1,0 evidencia de repulsión máxima. Métodos de ensayo similares ya se han empleado 3 (Tabla 1). <ol start="2"><li> Reporte el Chemotaxi medias Índice (IC) y el error estándar de la media (SEM). Realizar la prueba T de Student comparando los datos de las placas de prueba y de control. </li></ol>

<ol>
	<li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans.">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74, 515-527 (1993).</li><li>Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensory+neurons+with+overlapping+functions+direct+chemotaxis+to+multiple+chemicals+in+C.+elegans.">Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans.</a> Neuron. 7, 729-742 (1991).</li><li>Lee, J., Jee, C., McIntire, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+preference+in+C.+elegans.">Ethanol preference in C. elegans.</a> Genes Brain Behav. 8, 578-585 (2009).</li><li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+behavioral+analysis+in+C.+elegans.">High-throughput behavioral analysis in C. elegans.</a> Nat. Methods. 8, 592-598 (2011).</li><li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants.">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 70, 817-821 (1973).</li><li>Colbert, H. A., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-specific+adaptation+pathways+generate+olfactory+plasticity+in+C.+elegans.">Odorant-specific adaptation pathways generate olfactory plasticity in C. elegans.</a> Neuron. 14, 803-812 (1995).</li><li>Kauffman, A., Parsons, L., Stein, G., Wills, A., Kaletsky, R., Murphy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+Positive+Butanone+Learning,+Short-term,+and+Long-term+Associative+Memory+Assays.">C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays.</a> J. Vis. Exp. (49), e2490 (2011).</li><li>Troemel, E. R., Kimmel, B. E., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+chemotaxis+responses:+sensory+neurons+define+olfactory+preferences+in+C.+elegans.">Reprogramming chemotaxis responses: sensory neurons define olfactory preferences in C. elegans.</a> Cell. 91, 161-169 (1997).</li><li>Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fundamental+role+of+pirouettes+in+Caenorhabditis+elegans+chemotaxis.">The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis.</a> J Neurosci. 19, 9557-9569 (1999).</li><li>Frokjaer-Jensen, C., Ailion, M., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ammonium-acetate+is+sensed+by+gustatory+and+olfactory+neurons+in+Caenorhabditis+elegans.">Ammonium-acetate is sensed by gustatory and olfactory neurons in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 3, e2467 (2008).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+Methods:+Synchronization+and+Observation.">Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation.</a> J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).</li><li>Sengupta, P., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+fate+specification+and+differentiation+in+the+nervous+system+of+Caenorhabditis+elegans.">Cell fate specification and differentiation in the nervous system of Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Genet. 18, 73-80 (1996).</li><li>Hart, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior.">Behavior.</a> WormBook. , (1895).</li></ol>

No tenemos nada que revelar.

La quimiotaxis, aunque controlada por un complejo conjunto de mecanismos neuronales y celulares, puede ser fácil y objetivamente cuantificado utilizando ensayos de quimiotaxis. Para obtener los mejores resultados de los ensayos, se deben tomar ciertos pasos críticos. En primer lugar, la celebración de los gusanos es esencial en la obtención de resultados experimentales consistentes. Gusanos en diferentes etapas de la vida se comportan de manera diferente 13; gusanos etapa tan mixtas pueden sesgar los resu...

Ward, desarrollado por primera vez el ensayo de quimiotaxis en 1973 5, y desde entonces ha tenido aplicaciones de gran alcance. Neurobiología es un campo que se ha beneficiado del uso de una variedad de ensayos de quimiotaxis. Adaptación olfativa, una forma simple de aprendizaje y la memoria, se ha demostrado en C. elegans utilizando ensayos de quimiotaxis 6. Ellos también se han utilizado para mostrar que C. elegans pueden desarrollar tolerancia a etanol-un resultado que no sólo demuestra la plasticidad de comportamiento de los gusanos, pero que también muestra que los gusanos pueden ser muy útiles en el estudio de la dependencia del alcohol en los seres humanos 3. Los ensayos incluso han sido desarrollados para demostrar la capacidad de C. elegans para almacenar la memoria a corto y largo plazo, mostrando que las asociaciones son hechos por los gusanos entre quimioatrayentes y alimentos (OP50) 7. Además, dada la amplia información disponible en la actualidad con respecto a la C. elegans genoma, la chemotaxis comportamiento de C. elegans ha sido modificado varias veces mediante la inducción de mutaciones 1,8. Esto permite muchas posibilidades excitantes de ingeniería, tales como el desarrollo de C. elegans como una herramienta de biorremediación. Así, desde el desarrollo inicial del ensayo de quimiotaxis en 1973, ha sido frecuentemente alterado y utilizado para dilucidar misterios en una variedad de disciplinas. Algunos ensayos dirigidos a descubrir la ruta específica adoptada por los gusanos hacia un objetivo. El ensayo de prototipo de este tipo fue desarrollado por Ward 5. Tres gusanos fueron colocados en agar fundido durante 15 min. Sus movimientos fueron rastreadas por la huella que dejan al viajar de la periferia de la placa hasta un gradiente de un atrayente en el centro de la placa. Todos los gusanos en la placa fueron detenidos usando cloroformo al final de cada ensayo. Una descendiente de este método coloca un solo tornillo sin fin en el centro de la placa con el atrayente y el control de unt distancias iguales y opuestas desde el origen 2. Pierce-Shimomura et al. desarrollado un ensayo para observar la naturaleza exacta del movimiento involucrados en la quimiotaxis 9. Gusanos individuales se colocaron en placas de Petri de 9 cm que contienen ya sea una concentración uniforme del atrayente o un gradiente de forma radial, que culmina en la fuente del atrayente. Un programa de software que reconoce el gusano se utiliza para registrar el comportamiento observado. Una cámara de vídeo conectada a un microscopio trabajó conjuntamente con la etapa de ajustar la placa de Petri automáticamente como el ensayo corrió para asegurar el gusano se mantuvo en el campo de visión. A partir de esto, la información más detallada fue descubierto con respecto a la causa de piruetas mostrados por C. elegans. Otros ensayos, más similares a la descrita aquí, a prueba la respuesta de una gran población de gusanos a los compuestos de ensayo. Ensayos de dos cuadrantes quimiotaxis han sidoutilizados para explorar los roles que varios receptores, neuronas, y las moléculas de transducción de señales reproducen cuando C. elegans fue expuesto a varios compuestos 1. Entre 20-50 gusanos lavados se colocan cerca del centro de la placa con un atrayente y un control en los extremos polares junto con el anestésico, azida de sodio (NaN3). Después de 60 min, se generó un índice de quimiotaxis con valores de -1,0 a 1,0 en base a la diferencia entre el número de gusanos se colocará en el atrayente o el control. Un índice quimiotáctico similar se utilizó en el ensayo descrito en este artículo, aunque el ensayo anterior no evaluó estrictamente gusanos no móviles. A continuación, este ensayo se aplica aún más al ensayo de los efectos de la ablación neuronal sobre la quimiotaxis. Otra variación del ensayo mencionado anteriormente se lleva a cabo donde 100-200 gusanos fueron colocados en el centro de una placa que contiene cuatro cuadrantes 3. Cuadrantes adyacentes o bien contenían la prueba olas sustancias controladas. Al igual que en los ensayos anteriores, los gusanos fueron inmovilizados por la acción de azida de sodio antes de ser marcado. Un método similar se describe aquí como una forma de evaluar la respuesta de C. elegans a diversos compuestos. Sin embargo, el siguiente método tiene la ventaja añadida de sólo evaluar los gusanos que han pasado un umbral de distancia que separa móvil de gusanos inmóviles. Otros ensayos han incorporado directrices similares para ignorar gusanos inmóviles. Frøkjær-Jensen et al. desarrollaron un ensayo versátil que puede ser utilizado para probar compuestos solubles tanto volátiles y el agua 10. Una placa de Petri se dividió en cuatro cuadrantes. Los cuadrantes superior e inferior no contienen disolventes. El cuadrante izquierdo contenía agua y el derecho mencionado el atrayente. Al probar sustancias olorosas volátiles, el analito se coloca en la tapa de la placa, sobre el cuadrante correcto, mientras que los compuestos solubles en agua se colocaron directamente sobre la AGAr. Los métodos existentes en la actualidad para evaluar la respuesta quimiotáctica de C. elegans están siendo constantemente refinado para optimizar su facilidad de uso, la eficiencia y exactitud. Así, mientras que el ensayo descrito aquí tiene la capacidad de evaluar el mayor número de gusanos (máximo rendimiento:. 250 gusanos / hora por placa, ligeramente mayor que el rendimiento demostrado por Lee et al 3); la fuerza real de este método es el sucinta culminación de muchos de los atributos de los ensayos anteriores (Tabla 1).

<table><tbody><tr><td>S Basal (- cholesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K phosphate buffer, pH 6.0; dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 liter.] Autoclave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PicoFuge</td><td>Stratagene</td><td>400552</td><td></td></tr><tr><td>Microscopes</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P1000 Pipette</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P10 Pipette</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 M Sodium Azide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chemotaxis Agar [1.6% BBL-agar (Benton-Dickinson) or 2% Difco-agar. Autoclave. Add 5 mM potassium phosphate, pH 6.0; 1 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;]</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethanol/Distilled Water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Test Compounds (eg. 0.5% diacetyl)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bio-Rad</td><td>166-0600</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Amresco</td><td>CA97062-046</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>VWR</td><td>CA12001-120</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;OH</td><td>BDH</td><td>CABDH8641-2</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6531</td><td></td></tr></tbody></table>

c. elegans chemotaxis assay

Muchos organismos utilizan la quimiotaxis a buscar las fuentes de alimentos, evitar sustancias nocivas, y encontrar pareja. Caenorhabditis elegans tiene impresionante comportamiento quimiotaxis. La premisa detrás de probar la respuesta de los gusanos a un odorante es colocarlos en un área y observar el movimiento evocada en respuesta a un odorante. A pesar de los muchos ensayos disponibles, optimizando gusano de partida ubicación con respecto a tanto las zonas de ensayo y de control, y reducir al mínimo la interacción de los gusanos uno con el otro, mientras se mantiene un tamaño de la muestra significativa sigue siendo un trabajo en progreso 1-10. El método descrito aquí tiene como objetivo hacer frente a estos problemas mediante la modificación del ensayo desarrollado por Bargmann et al. 1. Una placa de Petri se divide en cuatro cuadrantes, dos cuadrantes opuestos marcados &quot;Prueba&quot; y dos se designan como &quot;control&quot;. Anestésico se coloca en todos los sitios de control de prueba y. Los gusanos se colocan en el centro de la placa con un circle marcado alrededor del origen para asegurarse de que se ignoran los gusanos no móviles. La utilización de un sistema de cuatro cuadrantes en lugar de uno o dos 2 1 elimina el sesgo en el movimiento de los gusanos, ya que son equidistantes a partir de muestras de prueba y de control, independientemente de qué lado del origen que comenzaron. Esto evita el problema de los gusanos que se ven obligados a viajar a través de un conjunto de otros gusanos de responder a un olor, lo que puede retrasar gusanos u obligar a tomar una ruta más tortuosa, dando una interpretación incorrecta de su ruta prevista. Este método también presenta ventajas prácticas por tener un tamaño de muestra más grande y permite al investigador para ejecutar el ensayo sin supervisión y marcó los gusanos una vez que el tiempo asignado ha expirado.

Comparación de tipo salvaje (N2) C. elegans para el ODR-10 (KY10) mutante. Se utilizó diacetilo, un conocido C. elegans quimioatrayente, para comparar los gusanos de tipo salvaje a la de un mutante que carece del receptor para diacetil 1,12. Para los gusanos de tipo salvaje (N2), el índice de quimiotaxis fue 0,100 ± 0,066 a etanol y 0,839 ± 0,031 hasta 0,5% diacetil. Como era de esperar, diacetilo provoca una respuesta quimioatrayentes signifi...

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C. elegans Chemotaxis Assay

Un método para evaluar cuantitativamente la respuesta quimiotáctica de los<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Se describe. Un índice quimiotáctico (CI) se empleó como una forma de evaluar con precisión la respuesta de los gusanos a ciertos objetivos, y servir como una plataforma de la comparación entre las cepas y los compuestos de interés.

C. elegans Ensayo de quimiotaxis

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Research

JoVE Journal

Biology

C. elegans Chemotaxis Assay

45.6K vistas.  Queen's University. Un método para evaluar cuantitativamente la respuesta quimiotáctica de los Caenorhabditis elegans Se describe. Un índice quimiotáctico (CI) se empleó como una forma de evaluar con precisión la respuesta de los gusanos a ciertos objetivos, y servir como una plataforma de la comparación entre las cepas y los compuestos de interés.

Video: C. elegans Chemotaxis Assay

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment through neuron-specific detection of food and chemical odors1, 2, and can associate nutritive states with chemical odors3, temperature4, and the pathogenicity of a food source5.
Here, we describe assays of C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. We modified an aversive olfactory learning paradigm6 to instead produce a positive response; the assay involves starving ~400 worms, then feeding the worms in the presence of the AWC neuron-sensed volatile chemoattractant butanone at a concentration that elicits a low chemotactic index (similar to Toroyama et al.7). A standard population chemotaxis assay1 tests the worms' attraction to the odorant immediately or minutes to hours after conditioning.
After conditioning, wild-type animals' chemotaxis to butanone increases ~0.6 Chemotaxis Index units, its "Learning Index". Associative learning is dependent on the presence of both food and butanone during training. Pairing food and butanone for a single conditioning period ("massed training") produces short-term associative memory that lasts ~2 hours. Multiple conditioning periods with rest periods between ("spaced training") yields long-term associative memory (&lt;40 hours), and is dependent on the cAMP Response Element Binding protein (CREB),6 a transcription factor required for long-term memory across species.8
Our protocol also includes image analysis methods for quick and accurate determination of chemotaxis indices. High-contrast images of animals on chemotaxis assay plates are captured and analyzed by worm counting software in MatLab. The software corrects for uneven background using a morphological tophat transformation.9 Otsu's method is then used to determine a threshold to separate worms from the background.10 Very small particles are removed automatically and larger non-worm regions (plate edges or agar punches) are removed by manual selection. The software then estimates the size of single worm by ignoring regions that are above a specified maximum size and taking the median size of the remaining regions. The number of worms is then estimated by dividing the total area identified as occupied by worms by the estimated size of a single worm.
We have found that learning and short- and long-term memory can be distinguished, and that these processes share similar key molecules with higher organisms.6,8 Our assays can quickly test novel candidate genes or molecules that affect learning and short- or long-term memory in C. elegans that are relevant across species.

C. elegans Positive Butanone Learning, Short-term, and Long-term Associative Memory Assays

Here we describe methods to test C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. These population assays employ the worms abilities to chemotax toward volatile odorants, and form positive associations upon pairing food with the chemoattractant butanone. Increasing the number of conditioning periods induces long-term memory.

C. elegans de aprendizaje positivo butanona, a corto plazo y largo plazo Ensayos de la memoria asociativa

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment ...

Investigación

Neurociencias

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and pathways as well as its ease of cultivation. Several C. elegans disease models have been reported, including neurodegenerative disorders such as Parkinson's disease (PD), which involves the degeneration of dopaminergic (DA) neurons 1. Both transgenes and neurotoxic chemicals have been used to induce DA neurodegeneration and consequent movement defects in worms, allowing for investigations into the basis of neurodegeneration and screens for neuroprotective genes and compounds 2,3.
Screens in lower eukaryotes like C. elegans provide an efficient and economical means to identify compounds and genes affecting neuronal signaling. Conventional screens are typically performed manually and scored by visual inspection; consequently, they are time-consuming and prone to human errors. Additionally, most focus on cellular level analysis while ignoring locomotion, which is an especially important parameter for movement disorders.
We have developed a novel microfluidic screening system (Figure 1) that controls and quantifies C. elegans' locomotion using electric field stimuli inside microchannels. We have shown that a Direct Current (DC) field can robustly induce on-demand locomotion towards the cathode ("electrotaxis") 4. Reversing the field's polarity causes the worm to quickly reverse its direction as well. We have also shown that defects in dopaminergic and other sensory neurons alter the swimming response 5. Therefore, abnormalities in neuronal signaling can be determined using locomotion as a read-out. The movement response can be accurately quantified using a range of parameters such as swimming speed, body bending frequency and reversal time.
Our work has revealed that the electrotactic response varies with age. Specifically, young adults respond to a lower range of electric fields and move faster compared to larvae 4. These findings led us to design a new microfluidic device to passively sort worms by age and phenotype 6.
We have also tested the response of worms to pulsed DC and Alternating Current (AC) electric fields. Pulsed DC fields of various duty cycles effectively generated electrotaxis in both C. elegans and its cousin C. briggsae 7. In another experiment, symmetrical AC fields with frequencies ranging from 1 Hz to 3 KHz immobilized worms inside the channel 8.
Implementation of the electric field in a microfluidic environment enables rapid and automated execution of the electrotaxis assay. This approach promises to facilitate high-throughput genetic and chemical screens for factors affecting neuronal function and viability.

Microfluidic-based Electrotaxis for On-demand Quantitative Analysis of Caenorhabditis elegans' Locomotion

A semi-automated micro-electro-fluidic method to induce on-demand locomotion in Caenorhabditis elegans is described. This method is based on the neurophysiologic phenomenon of worms responding to mild electric fields (&#x201C;electrotaxis&#x201D;) inside microfluidic channels. Microfluidic electrotaxis serves as a rapid, sensitive, low-cost, and scalable technique to screen for factors affecting neuronal health.

Electrotaxis microfluidos basados ​​en On-Demand Análisis cuantitativo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

The nematode Caenorhabditis elegans is a versatile model organism for biomedical research because of its conservation of disease-related genes and ...

Bioingeniería

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

Análisis Automatizado de un Ensayo de Preferencia Chemosensorial Basada en Población de Nematodo

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Comportamiento

<meta charset="utf8"></head><body>Extracción y cuantificación de respuestas de feromonas sexuales volátiles en C. elegans

Volatile Sex Pheromone Extraction and Chemoattraction Assay in Caenorhabditis elegans

Chemical communication is vital in organismal health, reproduction, and overall well-being. Understanding the molecular pathways, neural processes, and computations governing these signals remains an active area of research. The nematode Caenorhabditis elegans provides a powerful model for studying these processes as it produces a volatile sex pheromone. This pheromone is synthesized by virgin females or sperm-depleted hermaphrodites and serves as an attractant for males.
This protocol describes a detailed method for isolating the volatile sex pheromone from several C. elegans strains (WT strain N2, daf-22, and fog-2) and C. remanei. We also provide a protocol for quantifying the male chemotaxis response to the volatile sex pheromone. Our analysis utilizes measurements such as chemotaxis index (C.I.), arrival time (A.T.), and a trajectory plot to compare male responses under various conditions accurately. This method allows for robust comparisons between males of different genetic backgrounds or developmental stages. Furthermore, the experimental setup outlined here is adaptable to investigating other chemoattraction chemicals.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Examinando la influencia de las feromonas sexuales volátiles en el comportamiento de los machos de C. elegans

This protocol establishes methods for extracting and quantifying responses to the volatile sex pheromone in C. elegans, providing tools to study chemical communication and navigation trajectory.

Extracción de feromonas sexuales volátiles y ensayo de quimioatracción en Caenorhabditis elegans

Chemical communication is vital in organismal health, reproduction, and overall well-being. Understanding the molecular pathways, neural processes, and ...

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to infection. A common method to measure chemotaxis is the Boyden chamber assay, in which cells and chemoattractant are separated by a porous membrane. As cells migrate through the membrane toward the chemoattractant, they adhere to the underside of the membrane, or fall into the underlying media, and are subsequently stained and visually counted 1. In this method, cells are exposed to a steep and transient chemoattractant gradient, which is thought to be a poor representation of gradients found in tissues 2.
Another assay system, the under-agarose chemotaxis assay, 3, 4 measures cell movement across a solid substrate in a thin aqueous film that forms under the agarose layer. The gradient that develops in the agarose is shallow and is thought to be an appropriate representation of naturally occurring gradients. Chemotaxis can be evaluated by microscopic imaging of the distance traveled. Both the Boyden chamber assay and the under-agarose assay are usually configured as endpoint assays.
The automated ECIS/Taxis system combines the under-agarose approach with Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) 5, 6. In this assay, target electrodes are located in each of 8 chambers. A large counter-electrode runs through each of the 8 chambers (Figure 2). Each chamber is filled with agarose and two small wells are the cut in the agarose on either side of the target electrode. One well is filled with the test cell population, while the other holds the sources of diffusing chemoattractant (Figure 3). Current passed through the system can be used to determine the change in resistance that occurs as cells pass over the target electrode. Cells on the target electrode increase the resistance of the system 6. In addition, rapid fluctuations in the resistance represent changes in the interactions of cells with the electrode surface and are indicative of ongoing cellular shape changes. The ECIS/Taxis system can measure movement of the cell population in real-time over extended periods of time, but is also sensitive enough to detect the arrival of a single cell at the target electrode. 
Dictyostelium discoidium is known to migrate in the presence of a folate gradient 7, 8 and its chemotactic response can be accurately measured by ECIS/Taxis 9. Leukocyte chemotaxis, in response to SDF1&alpha; and to chemotaxis antagonists has also been measured with ECIS/Taxis 10, 11. An example of the leukocyte response to SDF1&alpha; is shown in Figure 1.

The ECIS/Taxis system is an automated, real-time assay that measures cellular chemotaxis. In this assay, cells move beneath a layer of agarose to arrive at a target electrode. Cellular movement is measured by the onset of resistance to AC current 0.

La medición de la quimiotaxis celular con ECIS / taxis

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Biología

Aversive Associative Learning and Memory Formation by Pairing Two Chemicals in Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans is an attractive model organism to study learning and memory at molecular and cellular levels because of the simplicity of its nervous system, whose chemical and electrical wiring diagrams were completely reconstructed from serial electron micrographs of thin sections. Here, we describe detailed protocols for the conditioning of C. elegans by massed and spaced training for the formation of short-term memory (STM) and long-term memory (LTM), respectively. By pairing 1-propanol and hydrochloric acid as conditioned and unconditioned stimuli, respectively, C. elegans was successfully trained to form aversive associative STM and LTM. While na&#239;ve animals were attracted to 1-propanol, the trained animals were no longer or very weakly attracted to 1-propanol. Like in other organisms such as Aplysia and Drosophila, "learning and memory genes" play essential roles in memory formation. Particularly, NMDA-type glutamate receptors, expressed in only six pairs of interneurons in C. elegans, are required for the formation of both STM and LTM, possibly as a coincidence factor. Therefore, the memory trace may reside among the interneurons.

Aversive Associative Learning and Memory Formation by Pairing Two Chemicals in Caenorhabditis elegans

We have previously developed protocols for Caenorhabditis elegans to form short- and long-term associative memories by massed and spaced training, respectively. Here, detailed protocols are described for the conditioning of C. elegans by pairing 1-propanol and hydrochloric acid as conditioned and unconditioned stimuli, respectively, to form aversive associative memory.

Aprendizaje asociativo aversivo y formación de la memoria mediante el emparejamiento de dos sustancias químicas en Caenorhabditis elegans

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Chemotaxis is a process in which cells or organisms move in response to a chemical stimulus. In nature, chemotaxis is important for organisms to sense and move toward food sources and move away from stimuli that may be toxic or harmful. Chemotaxis is also important at the cellular level. For example, chemotaxis is required for the movement of sperm toward an egg prior to fertilization. In the lab, chemotaxis is frequently examined in the nematode, C. elegans, which is known to migrate towards food sources in soil, but away from toxins such as heavy metals, substances with a low pH, and detergents. This video demonstrates how to perform a chemotaxis assay, which includes preparing the chemotaxis plates and the worms, running the assay, and analyzing the data. Then, we discuss examples of how chemotaxis assays can be used in C. elegans as a tool to understand learning and memory, olfactory adaptation, and neurological disease such as Alzheimer&quot;s disease. Chemotaxis experiments in C. elegans have near-limitless possibilities for learning more about the cellular and genetic mechanisms of many biological processes, and may lead to a greater understanding of human biology, development, and disease.

Chemotaxis Assay in Caenorhabditis elegans

Ensayo de Quimiotaxis en C. elegans

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Educación

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Biología básica

Biología I: levadura, Drosophila y C. elegans

C. elegans Survival Assay: A Short-Term Toxicity Test

Source: Possik, E. and Pause, A. <a href="https://www.jove.com/video/2496/measuring-caenorhabditis-elegans-life-span-96-well-microtiter">Measuring Oxidative Stress Resistance of&#160;Caenorhabditis elegans&#160;in 96-well Microtiter Plates.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2015).
This video introduces a short-term survival assay that tests a treatment for acute toxicity or tests a genetic strain for resistance to a toxic condition.&#160; The example protocol shows an example survival assay in which worms are tested for their ability to&#160; resist oxidative stress induced by paraquat (PQ).

C. elegans Ensayo de supervivencia: una prueba de toxicidad a corto plazo

Source: Possik, E. and Pause, A. Measuring Oxidative Stress Resistance of&#160;Caenorhabditis elegans&#160;in 96-well Microtiter Plates.&#160;J. Vis. Exp. ...

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