Supported by grants from the Department of Defense (W81XWH-09-1-0127), the NIH (2-R01-CA089569), the Elsa U. Pardee Foundation, a Marsha Rivkin Center for Ovarian Cancer Research Pilot Study Award, and generous philanthropic support from Section of Urology and Section of Research in the Department of Surgery, University of Chicago.

Todos los ratones fueron alojados, mantenidos y sacrificados de acuerdo con Animal Institucional de Cuidado y Uso Comisión (IACUC) directrices y bajo la supervisión de la Universidad de Centro de Recursos Animales de Chicago. 1. Los animales Preparación para Estudios Experimentales <ol><li> Permitir que los animales se aclimaten a la nueva vivienda y medio ambiente, para recuperarse de los posibles efectos fisiológicos de transporte y manipulación. Nota: La siguiente técnica es aplicable a todas las cepas disponibles en el mercado de los ratones. El número de animales que se utilizarán para un experimento depende del diseño del estudio y se debe hacer con la consulta de un estadístico. </li></ol> 2. Identificación y aislamiento de peritoneales depósitos de grasa. <ol><li> La eutanasia a los animales a través de CO 2 sobredosis y un método físico secundario a confirmar la muerte. </li><li> Como cosecha depósitos de grasa peritoneal constituye la extracción de órganos internos (método secundario), make una incisión en la línea media cerca del papilas inguinal a través de la pared peritoneal para exponer los órganos internos (Figura 1a). </li><li> Para la grasa omental (OM), exponer el complejo omental / pancreática mediante la ampliación del bazo de la cavidad peritoneal con una pinza (Figura 1C). Suelte omento del páncreas y el bazo por el recorte de cerca todas las conexiones de tejido. Asegúrese de que cualquier tejido pancreático restante se escinde 4. </li><li> Para la grasa gonadal (GF), utilizar pinzas para levantar la grasa gonadal que rodea los ovarios y los impuestos especiales cortando conexiones de tejido (Figura 1A superior righ t) 4. </li><li> Para la grasa uterino (UF), utilizar pinzas para levantar la grasa uterino que rodea a los cuernos uterinos y los impuestos especiales cortando conexiones de tejido (Figura 1 abajo a la derecha) 4. </li><li> Para la grasa mesentérica (MF), cortar la unión entre el intestino delgado y el píloro. El uso de fórceps para sujetar firmemente el extremo libreel intestino delgado, y poco a poco &quot;piel&quot; lejos de la grasa mesentérica. Suelte la grasa mesentérica de la raíz mesentérica con unas tijeras de disección (Figura 1A inferior izquierda) 4. </li><li> Para el Fat esplenoportal (SF), levantar el extremo distal del bazo utilizando pinzas para exponer la banda delgada de tejido graso que conecta el hilio del bazo para el páncreas. Extirpar la grasa esplenoportal por primera liberándolo del páncreas, y luego, con cuidado disección del bazo (Figura 1B) 4. </li></ol> 3. Vía Punto de Identificación Utilizando Giemsa tinción <ol><li> Omentos Impuestos Especiales (consulte el paso 2.3) a partir de ratones C57BL / 6 y fijar en el 5% de formalina tamponada neutra a 4 ° C durante 16 horas (O / N). </li><li> Para parafina del tejido fijo, elegir un molde que es apropiado para el tamaño del tejido. Verter parafina fundida desde el depósito de parafina para llenar el molde. Abra el casete y el uso de calor paraceps, transferir el tejido en el molde. <ol><li> Orientar cuidadosamente los tejidos durante la incrustación de parafina para producir secciones longitudinales. Coloque el casete de tejido marcado sobre la moldura y presione firmemente en su lugar. Deje que el molde se enfríe durante al menos 30 minutos. </li></ol></li><li> Cortar secciones de serie (4 micras de espesor) de la parafina fijado en formol e incrustados (FFPE) bloque de tejido. Coloque una diapositiva prefiltrado en las secciones como la cinta de tejido se desprende del bloque de parafina. </li><li> En serie sección de todo el epiplón; recoger y manchar cada tercera sección para Giemsa (consulte 3.6). Deje que el portaobjetos de vidrio con las secciones se sequen al aire, preferiblemente O / N a temperatura ambiente. Diapositivas secas están listos para la fijación. Manchar la primera sección de hematoxilina y eosina para comparaciones con diapositivas Giemsa manchadas. </li><li> Desparafinar las diapositivas por dos incubaciones secuenciales 5 min en xilenos. Rehidrate diapositivas por dos incubaciones secuenciales en el siguiente: etanol 100%, etanol al 95%, y, finalmente, pulse water. <ol><li> Tome las precauciones adecuadas para evitar las diapositivas de secado. Realice todos los pasos a TA. </li></ol></li><li> Completamente sumergir los portaobjetos en un tarro Coplin que contenía solución de Giemsa al 5% (w / v preparado en agua del grifo) y se incuba durante 4 min a TA. Enjuague los portaobjetos en agua del grifo durante 60 segundos, aire seco y montar con cubreobjetos utilizando medios de montaje. </li><li> Imagen de las diapositivas teñidas utilizando un escáner de diapositivas entera y el proceso con el software del fabricante. Cuantificar el volumen mancha lechosa en secciones epiplón teñidas con Giemsa utilizando el software ImageJ 4. </li></ol> 4. Propagación y Preparación de las células del cáncer ovárico para los estudios in vivo y ex vivo <ol><li> Pre-caliente 15 ml de medio de crecimiento celular a 37 ° C en un baño de calor. Preparar un tejido tamaño adecuado cultivo en matraz (por ejemplo, 75 cm de área 2 de superficie) por medio del etiquetado con el nombre de la línea celular, número de pases, la fecha y la persona que preparó la acción congelada, y la fechay persona que está descongelando / placas las células. Nota: En los estudios de la metástasis dicha información detallada es crucial, ya que la fecha de congelación abajo y número de pases puede afectar el fenotipo metastásico. </li><li> Mediante el entorno estéril de la campana de seguridad biológica, una pipeta 10 ml de medio en el matraz de cultivo T-75. Retirar un vial de células del sistema de nitrógeno líquido y se revise la etiqueta para confirmar el tipo de célula. Descongelar sólo un vial de células en un momento por calentamiento en baño de 37 ° C de calor. </li><li> Utilizando una técnica estéril, pipeta de 1x10 6 células descongeladas en el frasco de cultivo. Colocar el matraz en la incubadora para permitir que las células se unan. Agite suavemente el frasco de un lado a otro para formar una suspensión celular uniforme. <ol><li> Colocar el frasco en cultivo de tejidos incubadora y se mantiene a 37 ° C en 5% de CO 2 medio ambiente. Permitir que las células se adhieran O / N. </li></ol></li><li> Aspirar los medios de comunicación, y reemplazar con medio de crecimiento pre-calentado fresco. Colocar el matraz en la incubadora y todocélulas ujo crezcan. Monitorear el crecimiento celular diariamente por inspección visual cada 2-3 días utilizando un microscopio invertido. Utilice técnicas de cultivo celular estándar a las células de paso al llegar a un 70-80% de confluencia. Nota: Para los ensayos experimentales cosechan las células a 70% de confluencia para asegurar que las células proliferan activamente. </li><li> Aspirar el medio de cultivo y enjuague con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS). Aspirar PBS y añadir 0,25% de tripsina / EDTA (de 2 a 3 ml de una superficie 75 cm 2) e incubar 5 min a 37 ºC. Visualmente confirman que las células se han separado y añadir un volumen igual de medio de crecimiento, y la pipeta suavemente las células arriba y abajo para obtener una suspensión de células individuales. Nota: Es muy importante que el medio de crecimiento contiene suero, ya que inactiva la tripsina. Preparar al menos 2 a 4 veces más células que el número requerido para un experimento dado para compensar la pérdida de células durante los pasos subsiguientes </li><li> Determinar el porcentaje de células viables en elsuspensión a través de ensayo de exclusión con azul de tripano usando un hemocitómetro o un contador de células automatizado. Nota: En este caso, utilice únicamente preparaciones de células en la que ≥ 96% de las células son viables. </li><li> Transferir la suspensión celular del matraz a un tubo cónico de 50 ml. Células de pellets por centrifugación de 5 min a 1.100 xg, a 4 ° C. </li><li> Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en PBS a una concentración de 2x10 6 células por ml. </li></ol> 5. inyección intraperitoneal de células Nota: En nuestros experimentos, los ratones se manejan en un flujo de aire laminar o gabinete de bioseguridad dentro de nuestras instalaciones de barrera con el fin de limitar el riesgo de exposición a agentes patógenos, el fin de demostrar esta técnica con claridad, se llevaron a cabo los procedimientos en el vídeo que acompaña en un laboratorio autorizado para el trabajo animal. Esta técnica en particular no requiere que los animales bajo anestesia. Bajo los protocolos aprobados, realice este technique en animales vivos. Utilice cepas adecuadas de ratones para este estudio. Por ejemplo: utilizar ratones desnudos atímicos inmunodeprimidos, para el estudio de las células del cáncer de ovario humano (SKOV3ip.1 y HeyA8) la colonización; utilizar inmunocompetentes C57BL / 6 ratones para el estudio de células de ratón de cáncer de ovario (ID8) la colonización. <ol><li> Carga 500 l de la suspensión de células individuales en la jeringa y poner en el tapado de la aguja 25 G estéril. Esto reduce de cizallamiento de células antes de la inyección. </li><li> Escoja el ratón por la piel del cuello y sostenga la cola con la palma y el dedo índice y fijar la pata trasera izquierda entre el anular y el meñique (cuando el ratón está restringido con la mano izquierda). Nota: Para evitar los órganos abdominales traumatizantes, restringir el ratón también de modo que no se pueda mover durante la inyección. </li><li> Imagina una línea a través del abdomen justo por encima de las rodillas, y localizar un punto en el lado derecho del animal y cerca de la línea media. El punto de entrada es craneal y ligeramente medialdel último pezón. Nota: La inserción de la aguja en el lado derecho del ratón evita el ciego y reduce el riesgo de perforar el intestino 11. </li><li> Insertar la aguja en la región lateral inferior del abdomen de los ratones a una profundidad de aproximadamente 0,5 cm. Tire hacia atrás el émbolo para confirmar que la aguja no ha penetrado un vaso sanguíneo u otros órganos peritoneales. <ol><li> Si se aspira cualquier fluido desechar la jeringa (y de la muestra) 11. Un aspirado marrón verdoso o amarillo indica penetración de la aguja en los intestinos o la vejiga, respectivamente. </li></ol></li><li> Inyectar la muestra usando presión suave y constante. Retire la aguja y volver el ratón a su jaula. No vuelva a tapar la jeringa antes de su eliminación en el contenedor de objetos punzantes. </li><li> Ratones Sacrificio vía asfixia con CO2 y la extracción de órganos vitales en puntos específicos de tiempo después de la inyección. </li></ol> 6. Vía punto de colonización En vivo <ol><li> Quantitación de la localización celular de cáncer de manchas lechosas mediante citometría de flujo <ol><li> Aislar los depósitos de grasa peritoneales de ratones (como se describe en el paso 2.3 a 2.7) inyectados con fluorescencia etiquetados células cancerosas y tejidos lugar inmediatos en helado de PBS. <ol><li> Para esta técnica en particular, el peso del partido todos los tejidos adiposos de grasa a epiplón. Tejidos de transferencia para separar tubos de 5 ml que contienen 1,5 ml de DMEM libre de suero y 0,1% (w / v) de albúmina de suero bovino. Tejidos piscina cosechadas de tres ratones independientes para asegurar un rendimiento suficiente de células para citometría de flujo. </li></ol></li><li> Tejidos de carne picada utilizando tijeras quirúrgicas y añadir 1,5 ml de DMEM libre de suero que contiene 0,4% (w / v) de colagenasa I. incubar la suspensión de tejido a 37 ° C durante 30 min con mezcla rotacional. <ol><li> Como paso opcional, desvincularse aún más el tejido por la masticación. En este caso, la transferencia de la suspensión de tejido-colagenasa a una bolsa de microstomacher, masticar durante 10 min a baja, girando la orientaciónde las bolsas después de 5 min. </li></ol></li><li> Filtrar las muestras a través de un filtro de malla de nylon (60 micras de poro) para eliminar los residuos más grandes. Recoger las células por medio de centrifugación a 250 xg durante 5 min a 4 ° C y descartar la fracción sobrenadante. </li><li> Resuspender el sedimento de células en 100 l de PBS combinados con 900 l de tampón de lisis ACK y se incuba a temperatura ambiente durante 1 min. Células centrifugar a 250 xg durante 5 minutos y descartar el sobrenadante. <ol><li> Resuspender el sedimento de células en 250 l de PBS enfriado con hielo. Filtrar las muestras a través de una malla de nylon de poro 60 micras para garantizar la suspensión de células individuales. Enjuague el filtro con 250 l de helado de PBS. </li></ol></li><li> Cuantificar el número de células marcadas fluorescentemente en la población usando un citómetro de flujo equipado con un láser de color verde amarillo 561-nm y A / 15 nm de paso de banda 585 nm filtro. Establezca la puerta para que las células tdTomato positivos basados ​​en el análisis de las células de los padres y / o controles negativos adecuados 4. </li></ol&gt; </li><li> La cuantificación de las metástasis microscópicas y macroscópicas <ol><li> En el punto final experimental deseada (s), aislar, e inmediatamente colocar los tejidos en los medios de fijación apropiado. Fijar las muestras más grandes, como las gónadas intactas, de útero, y los depósitos de grasa mesentérica en 10% de formalina tamponada neutra para 48 horas a 4 ° C. Fijar las muestras más pequeñas (y grasa omental esplenoportal, así como equivalentes de tejido uterino y de la grasa mesentérica) en 5% de formalina tamponada neutra al 4 ° C durante 2-16 h. <ol><li> Alternativamente, broche congelar tejidos colocándolos en un medio de congelación como octubre y colocar en una cantidad apropiada de nitrógeno líquido. </li></ol></li><li> Transferencia fija tejidos a etanol al 70% y se almacena a 4 ° C hasta su inclusión en parafina. Insertar y el tejido proceso como se describe en 3.2 y 3.3. <ol><li> Utilice la sección H &amp; E manchado para evaluar los tejidos para la presencia o ausencia de metástasis microscópicas (es decir, grupos de 50 células). Confirme tél presencia de metástasis microscópicas por un método secundaria como una mancha de IHC para citoqueratina 8/18 para detectar células de cáncer de ovario. </li></ol></li></ol></li></ol> 7. Vía punto Colonización Ex Vivo <ol><li> Establecimiento de condiciones de cultivo básicas ex vivo de órganos omental <ol><li> Coloque cada epiplón en un solo inserto de placa de cultivo y sitúa dentro de un pocillo de una placa de cultivo de tejidos de doce pocillos que contenía 500 l de DME media / F12 que contiene 20% de FCS. Mantener cultivos de órganos a 37 ° C en un entorno de 5% de CO2 durante 24 a 48 horas y / o puntos de tiempo adicionales. Usar tres omentos independiente (muestras por triplicado) para cada condición (por ejemplo, tipo de papel / punto de tiempo). </li><li> Para confirmar la integridad de los tejidos en los puntos finales experimentales, fijar y muestras de proceso como se describe en el Paso 3. Contando sana frente adipocitos necróticas en secciones de H &amp; E puede evaluar la integridad del tejido. Un mínimo de 120 células de ~Se requiere 5 muestras biológicas para formular un porcentaje de tejido vivo presente 10. </li><li> Para medir la función del tejido, lugar omentos (n = 3) en pocillos separados de una placa de 24 pocillos que contenía 500 l de DME media / F12 con 20% de FCS. Permita omentos para acondicionar los medios de comunicación a 37 ° C en un ambiente de CO2 al 5% durante 24 horas, y luego eliminar 250 l para su uso en un IL-6 ELISA ensayo 10. </li></ol></li><li> Ex vivo de co-cultivo del epiplón ratón con células SKOV3ip.1-GFP <ol><li> Crecer y preparar células con fluorescencia etiquetados como se describe en la sección 4 y resuspender a una concentración de 2 × 10 6 células por ml. </li><li> Aplicar ~ 6 l del adhesivo tisular a la membrana de la inserción de la cultura y deje que se seque al aire. Lavar la membrana dos veces con agua estéril para eliminar cualquier exceso de adhesivo. Secar las membranas debajo de una campana laminar. </li><li> Extirpar con cuidado el omentos y adjuntarlo a la memb recubierto con adhesivorane usando pinzas estériles. Permitir que el tejido se adhiera a la membrana durante 1 min antes de la adición de medios de comunicación. Añadir 500 l de la suspensión celular en la parte superior de cada epiplón en cada inserto de cultivo. Llene el área alrededor de la cámara transwell con 2,5 ml de DME / F-12 10. </li><li> Incubar omentos con suspensión de células durante 6 horas a 37 ° C en un entorno de 5% de CO 2. Retire con cuidado y lavar el omentos con ~ 10 ml de PBS. Visualice fluorescentes focos de células cancerosas mediante un sistema de imagen fluorescente apropiada 10. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Bast, R. C., Hennessy, B., Mills, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology+of+ovarian+cancer:+new+opportunities+for+translation.">The biology of ovarian cancer: new opportunities for translation.</a> Nature Reviews Cancer. 9 (6), 415-428 (2009).</li><li>Bowtell, D. D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genesis+and+evolution+of+high-grade+serous+ovarian+cancer.">The genesis and evolution of high-grade serous ovarian cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 10 (11), 803-808 (2010).</li><li>Colgan, T. J., Chang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+18+Familial+Cancer+and+Prophylactic+Surgery.">Chapter 18 Familial Cancer and Prophylactic Surgery.</a> Diagnostic Pathology of Ovarian Tumors. , 277-288 (2011).</li><li>Clark, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milky+Spots+Promote+Ovarian+Cancer+Metastatic+Colonization+of+Peritoneal+Adipose+in+Experimental+Models.">Milky Spots Promote Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Peritoneal Adipose in Experimental Models.</a> The American Journal of Pathology. 183 (2), 576-591 (2013).</li><li>Platell, C., Cooper, D., Papadimitriou, J. M., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+omentum.">The omentum.</a> World Journal Of Gastroenterology: WJG. 6 (2), 169-176 (2000).</li><li>Hagiwara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milky+spots+as+the+implantation+site+for+malignant+cells+in+peritoneal+dissemination+in+mice.">Milky spots as the implantation site for malignant cells in peritoneal dissemination in mice.</a> Cancer Research. 53 (3), 687-692 (1993).</li><li>Gerber, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+Attachment+of+Peritoneal+Tumor+Metastases+to+Omental+Immune+Aggregates+and+Possible+Role+of+a+Unique+Vascular+Microenvironment+in+Metastatic+Survival+and+Growth.">Preferential Attachment of Peritoneal Tumor Metastases to Omental Immune Aggregates and Possible Role of a Unique Vascular Microenvironment in Metastatic Survival and Growth.</a> The American Journal of Pathology. 169 (5), 1739-1752 (2010).</li><li>Liebermann-Meffert, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+greater+omentum.+Anatomy,+embryology,+and+surgical+applications.">The greater omentum. Anatomy, embryology, and surgical applications.</a> The Surgical Clinics of North America. 80 (1), 275-293 (2000).</li><li>Collins, D., Hogan, A. M., O&#8217;Shea, D., Winter, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Omentum:+Anatomical,+Metabolic,+and+Surgical+Aspects.">The Omentum: Anatomical, Metabolic, and Surgical Aspects.</a> Journal of Gastrointestinal Surgery. 13 (6), 1138-1146 (2009).</li><li>Khan, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+metastatic+colonization+of+human+ovarian+cancer+cells+to+the+omentum.">In vitro metastatic colonization of human ovarian cancer cells to the omentum.</a> Clinical, &amp; Experimental Metastasis. 27 (3), 185-196 (2010).</li><li>Shimizu, S., Hans, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Routes+of+Administration.">Routes of Administration.</a> The Laboratory Mouse. , 527-542 (2004).</li><li>Vang, R., Shih, I. -. M., Kurman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fallopian+tube+precursors+of+ovarian+low-+and+high-grade+serous+neoplasms.">Fallopian tube precursors of ovarian low- and high-grade serous neoplasms.</a> Histopathology. 62 (1), 44-58 (2012).</li><li>Folkins, A. K., Jarboe, E. A., Roh, M. H., Crum, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precursors+to+pelvic+serous+carcinoma+and+their+clinical+implications.">Precursors to pelvic serous carcinoma and their clinical implications.</a> Gynecologic Oncology. 113 (3), 391-396 (2009).</li><li>Li, J., Fadare, O., Xiang, L., Kong, B., Zheng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+serous+carcinoma:+recent+concepts+on+its+origin+and+carcinogenesis.">Ovarian serous carcinoma: recent concepts on its origin and carcinogenesis.</a> Journal of Hematology, &amp; Oncology. 5 (1), 8 (2012).</li><li>Kurman, R. J., Shih, I. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+pathogenesis+of+epithelial+ovarian+cancer:+a+proposed+unifying+theory.">The origin and pathogenesis of epithelial ovarian cancer: a proposed unifying theory.</a> The American Journal Of Surgical Pathology. 34 (3), 433-443 (2010).</li><li>Crum, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distal+fallopian+tube:+a+new+model+for+pelvic+serous+carcinogenesis.">The distal fallopian tube: a new model for pelvic serous carcinogenesis.</a> Current Opinion In Obstetrics, &amp; Gynecology. 19 (1), 3-9 (2007).</li><li>Crum, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+BRCA:+The+Tubal+Fimbria+Emerges+as+an+Origin+for+Pelvic+Serous+Cancer.">Lessons from BRCA: The Tubal Fimbria Emerges as an Origin for Pelvic Serous Cancer.</a> Clinical Medicine, &amp; Research. 5 (1), 35-44 (2007).</li><li>Foulkes, W. D., Narod, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+risk+and+family+history.">Ovarian cancer risk and family history.</a> The Lancet. 349, 878 (1997).</li><li>Antoniou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Average+Risks+of+Breast+and+Ovarian+Cancer+Associated+with+BRCA1+or+BRCA2+Mutations+Detected+in+Case+Series+Unselected+for+Family+History:+A+Combined+Analysis+of+22+Studies.">Average Risks of Breast and Ovarian Cancer Associated with BRCA1 or BRCA2 Mutations Detected in Case Series Unselected for Family History: A Combined Analysis of 22 Studies.</a> The American Journal of Human Genetics. 72 (5), 1117-1130 (2003).</li><li>King, M. -. C., Marks, J. H., Mandell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+York+Breast+Cancer+Study+Group+Breast+and+ovarian+cancer+risks+due+to+inherited+mutations+in+BRCA1+and+BRCA2.">New York Breast Cancer Study Group Breast and ovarian cancer risks due to inherited mutations in BRCA1 and BRCA2.</a> Science. 302 (5645), 643-646 (2003).</li><li>Kj&#230;r Kr&#252;ger, S., Gayther, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+and+genetic+susceptibility+in+relation+to+the+BRCA1+and+BRCA2+genes.+Occurrence,+clinical+importance+and+intervention.">Ovarian cancer and genetic susceptibility in relation to the BRCA1 and BRCA2 genes. Occurrence, clinical importance and intervention.</a> Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica. 85 (1), 93-105 (2006).</li><li>Easton, D. F., Ford, D., Bishop, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+and+ovarian+cancer+incidence+in+BRCA1-mutation+carriers.+Breast+Cancer+Linkage+Consortium.">Breast and ovarian cancer incidence in BRCA1-mutation carriers. Breast Cancer Linkage Consortium.</a> American Journal of Human Genetics. 56 (1), 265-271 (1995).</li><li>Rebbeck, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prophylactic+Oophorectomy+in+Carriers+of+BRCA1or+BRCA2Mutations.">Prophylactic Oophorectomy in Carriers of BRCA1or BRCA2Mutations.</a> New England Journal of Medicine. 346 (21), 1616-1622 (2002).</li><li>Olivier, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+outcome+of+prophylactic+oophorectomy+in+BRCA1/BRCA2+mutation+carriers+and+events+during+follow-up.">Clinical outcome of prophylactic oophorectomy in BRCA1/BRCA2 mutation carriers and events during follow-up.</a> British Journal Of Cancer. 90 (8), 1492-1497 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

El desarrollo de terapias para dirigirse a las células diseminadas requiere una comprensión mecanicista de la colonización metastásica, el primer paso crítico en el desarrollo de la enfermedad peritoneal. Para abordar estas cuestiones que reportamos enfoques que se pueden utilizar para discernir cómo la composición del tejido único del epiplón y la arquitectura promueven la colonización metastásica del cáncer de ovario. Las características distintivas de nuestro enfoque son: 1) el enfoque ...

A diferencia de la mayoría de los tumores sólidos, metástasis de cáncer de ovario seroso de alto grado (HGSC) se limitan a la cavidad peritoneal 1. Por lo tanto, las terapias peritoneales eficaces potencialmente podrían controlar o erradicar HGSC. Actualmente, una aproximación terapéutica estándar es de citorreducción quirúrgica combinada con quimioterapia 1.3. Desafortunadamente, la gran mayoría de los pacientes experimentan y sucumben a las complicaciones de la recurrencia de la enfermedad. Estas estadísticas deprimentes muestran la necesidad de mejorar la comprensión de la colonización metastásica, el proceso por el cual las células cancerosas para localizar, utilizar y proliferar dentro de los tejidos del huésped para formar metástasis 2. El epiplón es un sitio preferido de principios HGSC metástasis 4-7. A diferencia de otros peritoneal adiposo, el tejido adiposo omental contiene estructuras inmunes inusuales conocidas como manchas lechosas, que contienen B, T y células NK y macrófagos, que desempeñan papeles clave en HomeOS peritonealesTasis 8,9. Además de sus funciones fisiológicas, encontramos que manchas lechosas desempeñan un papel activo en el cáncer de ovario colonización metastásica 4. En los ensayos de metástasis experimentales, SKOV3ip.1, CaOV3 y HeyA8 (humano) y ID8 (murino; C57BL / 6) células ováricas cancerosas rápidamente caseros para manchas lechosas, lo que sugiere que las células se están moviendo hacia un factor quimiotáctico secretada. Curiosamente, las células cancerosas no colonizan adiposo peritoneal que carecen de manchas lechosas (es decir, gonadales y grasa uterina) 4. Con el fin de identificar los mecanismos que regulan la colonización mancha lechosa, hemos optimizado modelos de xenoinjerto que permiten la interrogación de eventos celulares y moleculares en el transcurso de tiempo de la colonización metastásica 4. Una ventaja específica de los métodos descritos en este documento es su énfasis en la arquitectura y la función del tejido, lo que permite a los usuarios probar hipótesis en integrarse plenamente en vivo y modelos ex vivo de m4,10 colonización etastatic. Al comparar la localización de células cancerosas y el crecimiento de los depósitos de grasa peritoneal que, o bien contienen o carecen de manchas lechosas, los investigadores pueden probar la contribución (s) relativa de los adipocitos y células dentro manchas lechosas a la presentación y el crecimiento progresivo de las células de cáncer de ovario en los tejidos fisiológicamente relevantes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dissection Tools</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geimsa</td>
			<td>Fluka/Sigma Aldrich</td>
			<td>48900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% Formalin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td>Without calcium and Magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 gauge needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>329652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stomacher</td>
			<td>Seward Labsystems</td>
			<td>Stomacher 80 Biomaster</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microstomacher bag</td>
			<td>Stomacher Lab Systems</td>
			<td>BA6040/Micro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysis Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell culture plate insert</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PICM01250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Tak</td>
			<td>BD</td>
			<td>354240</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer metastatic colonization of milky spot structures in peritoneal adipose

Alto grado de cáncer de ovario seroso (HGSC), la causa de metástasis peritoneales generalizadas, sigue teniendo un muy mal pronóstico; menos del 30% de las mujeres están vivos 5 años después del diagnóstico. El epiplón es un sitio preferido de la formación de metástasis HGSC. A pesar de la importancia clínica de este microambiente, la contribución del tejido adiposo omental a la progresión del cáncer de ovario sigue siendo poco estudiada. Adiposo omental es inusual, ya que contiene estructuras conocidas como manchas lechosas, que se componen de B, T, y células NK, macrófagos, y células progenitoras que rodean nidos densos de vasculatura. Lechosas manchas juegan un papel clave en las funciones fisiológicas del epiplón, que son necesarios para la homeostasis peritoneal. Hemos demostrado que manchas lechosas también promueven el cáncer metastásico de ovario de la colonización adiposo peritoneal, un paso clave en el desarrollo de metástasis peritoneales. Aquí se describen los métodos que desarrollaron para evaluar y cuantificar manchas lechosas en poritoneal adiposo y estudiar su contribución funcional a célula de cáncer de ovario metastásico la colonización de los tejidos omental tanto in vivo como ex vivo. Estos enfoques son generalizables a modelos de ratón y líneas celulares adicional, permitiendo así que el estudio de la formación de metástasis de cáncer de ovario de localización inicial de las células a las estructuras mancha lechosa para el desarrollo de metástasis peritoneales generalizadas.

Identificación y histológico El examen de peritoneales depósitos de grasa Disección anatómica bruto permite la identificación de cuatro de los cinco principales fuentes de grasa peritoneal (Figura 1A). Moviéndose a la derecha del centro de la parte superior son: el epiplón (OM; esbozado) situado sobre el estómago y el bazo, la grasa gonadal (GF) que rodea el ovario izquierdo (ov), la grasa uterina (UF) unido a los cuernos uterinos (uh) y el mesenter...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose at JoVE.com

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

En vivo y ex vivo para estudiar Cáncer de ovario metastásico colonización de Estructuras Vía lugar en Peritoneal adiposo

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

in-vivo-ex-vivo-approaches-to-study-ovarian-cancer-metastatic

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Medicine

Unit 2

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

Cancer

SCIENTISTS IN ACTION

12.9K vistas.  The University of Chicago. We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

Video: In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness of a variety of oncolytic platforms including HSV, Reovirus, and Vaccinia OVs as treatment for cancer are currently underway2-5. One key characteristic of oncolytic viruses is that they can be genetically modified to express reporter transgenes which makes it possible to visualize the infection of tissues by microscopy or bio-luminescence imaging6,7. This offers a unique advantage since it is possible to infect tissues from patients ex vivo prior to therapy in order to ascertain the likelihood of successful oncolytic virotherapy8. To this end, it is critical to appropriately sample tissue to compensate for tissue heterogeneity and assess tissue viability, particularly prior to infection9. It is also important to follow viral replication using reporter transgenes if expressed by the oncolytic platform as well as by direct titration of tissues following homogenization in order to discriminate between abortive and productive infection. The object of this protocol is to address these issues and herein describes 1. The sampling and preparation of tumor tissue for cell culture 2. The assessment of tissue viability using the metabolic dye alamar blue 3. Ex vivo infection of cultured tissues with vaccinia virus expressing either GFP or firefly luciferase 4. Detection of transgene expression by fluorescence microscopy or using an In Vivo Imaging System (IVIS) 5. Quantification of virus by plaque assay. This comprehensive method presents several advantages including ease of tissue processing, compensation for tissue heterogeneity, control of tissue viability, and discrimination between abortive infection and bone fide viral replication.

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are promising for cancer therapeutics. The ability to ascertain the infectability of live tissue specimens obtained from patients prior to treatment is a unique advantage of this therapeutic approach. This protocol describes how to process tissues for ex vivo infection with oncolytic virus and subsequent viral quantification.

Ex infección in vivo del tejido vivo con virus oncolíticos

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

Investigación

Medicina

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent until many years after removal of the primary tumor and adjuvant therapy. A likely explanation of this phenomenon is that tumor cells have seeded metastatic sites, are resistant to conventional therapies, and remain dormant for long periods of time 1-4.
The existence of dormant cancer cells at secondary sites has been described previously as quiescent solitary cells that neither proliferate nor undergo apoptosis 5-7. Moreover, these solitary cells has been shown to disseminate from the primary tumor at an early stage of disease progression 8-10 and reside growth-arrested in the patients' bone marrow, blood and lymph nodes 1,4,11. Therefore, understanding mechanisms that regulate dormancy or the switch to a proliferative state is critical for discovering novel targets and interventions to prevent disease recurrence. However, unraveling the mechanisms regulating the switch from tumor dormancy to metastatic growth has been hampered by the lack of available model systems.
in vivo and ex vivo model systems to study metastatic progression of tumor cells have been described previously 1,12-14. However these model systems have not provided in real time and in a high throughput manner mechanistic insights into what triggers the emergence of solitary dormant tumor cells to proliferate as metastatic disease. We have recently developed a 3D in vitro system to model the in vivo growth characteristics of cells that exhibit either dormant (D2.OR, MCF7, K7M2-AS.46) or proliferative (D2A1, MDA-MB-231, K7M2) metastatic behavior in vivo . We demonstrated that tumor cells that exhibit dormancy in vivo at a metastatic site remain quiescent when cultured in a 3-dimension (3D) basement membrane extract (BME), whereas cells highly metastatic in vivo readily proliferate in 3D culture after variable, but relatively short periods of quiescence. Importantly by utilizing the 3D in vitro model system we demonstrated for the first time that the ECM composition plays an important role in regulating whether dormant tumor cells will switch to a proliferative state and have confirmed this in in vivo studies15-17. Hence, the model system described in this report provides an in vitro method to model tumor dormancy and study the transition to proliferative growth induced by the microenvironment.

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

A modified 3-D in vitro system is presented in which growth characteristics of several tumor cell lines in reconstituted basement membrane correlate with the dormant or proliferative behavior of the tumor cells at a metastatic secondary site in vivo.

Un In Vitro Sistema para el Estudio de latencia del tumor y el salto hacia el crecimiento metastásico

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

Una novela de alta resolución<em&gt; En vivo</em&gt; Técnica de escaneo para el Estudio de la respuesta dinámica de estructuras intracraneales al crecimiento del tumor y Terapéutica

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic lesions. Mouse models are an important tool to investigate inflammatory processes in atherogenesis, but these models suffer from the phenotypic and functional differences between the murine and human immune system. In vitro cell experiments are used to specifically evaluate cell type-dependent changes caused by a substance of interest, but culture-dependent variations and the inability to analyze the influence of specific molecules in the context of the inflammatory compound in atherosclerotic lesions limit the impact of the results. In addition, measuring levels of a molecule of interest in human blood helps to further investigate its clinical relevance, but this represents systemic and not local inflammation. Therefore, we here describe a plaque culture model to study human atherosclerotic lesion biology ex vivo. In short, fresh plaques are obtained from patients undergoing endarterectomy or coronary artery bypass grafting and stored in RPMI medium on ice until usage. The specimens are cut into small pieces followed by random distribution into a 48-well plate, containing RPMI medium in addition to a substance of interest such as cytokines or chemokines alone or in combination for defined periods of time. After incubation, the plaque pieces can be shock frozen for mRNA isolation, embedded in Paraffin or OCT for immunohistochemistry staining or smashed and lysed for western blotting. Furthermore, cells may be isolated from the plaque for flow cytometry analysis. In addition, supernatants can be collected for protein measurement by ELISA. In conclusion, the presented ex vivo model opens the possibility to further study inflammatory lesional biology, which may result in identification of novel disease mechanisms and therapeutic targets.

A Human Ex Vivo Atherosclerotic Plaque Model to Study Lesion Biology

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process. This manuscript illustrates an easy to use ex vivo model to investigate fresh carotid or coronary artery plaques. The ex vivo model allows for the investigation of potential substances on the inflammatory milieu in human atherosclerotic lesions and results can be analyzed by various methods.

Un humano<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Placa aterosclerótica modelo para estudiar la lesión Biología

Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of the vasculature. There are various methods to study the inflammatory compound in atherosclerotic ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

In vivo MRI de 19F para el seguimiento de la célula

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

Molecular Profiling del microambiente tumoral invasiva en un modelo de 3 dimensiones de las células del cáncer colorrectal y<em&gt; Ex vivo</em&gt; Los fibroblastos

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Una<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo para estudiar la acción hormonal en el pecho humano

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
First we describe how to generate subcutaneous tumors in mice, using antigen-negative cell lines as negative controls and antigen-positive cells as positive controls in the same mice for intraindividual comparison. We outline how to administer intravenously near-infrared fluorophore labelled (AlexaFluor680) antigen-specific nanobodies and conventional antibodies. In vivo imaging was performed with a small-animal NIRF-Imaging system. After the in vivo imaging experiments the mice were sacrificed. We then describe how to prepare the tumors for parallel ex vivo analyses by flow cytometry and fluorescence microscopy to validate in vivo imaging results.
The use of the near-infrared fluorophore labelled nanobodies allows for non-invasive same day imaging in vivo. Our protocols describe the ex vivo quantification of the specific labeling efficiency of tumor cells by flow cytometry and analysis of the distribution of the antibody constructs within the tumors by fluorescence microscopy. Using near-infrared fluorophore labelled probes allows for non-invasive, economical in vivo imaging with the unique ability to exploit the same probe without further secondary labelling for ex vivo validation experiments using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.

Validación de nanocuerpo y basados ​​en anticuerpos<em&gt; En Vivo</em&gt; Experimentos tumor de xenoinjerto NIRF-de formación de imágenes en ratones utilizando<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Citometría de flujo y microscopía

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice ...

Human Dupuytren's Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from cirrhosis to cardiovascular diseases). There is no effective treatment and the in vitro tools available do not mimic the in vivo situation rendering the progress of the out of control wound healing process still enigmatic.
To date, 2D and 3D cultures of fibroblasts derived from DD patients are the main experimental models available. Primary cell cultures have many limitations; the fibroblasts derived from DD are altered by the culture conditions, lack cellular context and interactions, which are crucial for the development of fibrosis and weakly represent the derived tissue. Real-time PCR analysis of fibroblasts derived from control and DD samples show that little difference is detectable. 3D cultures of fibroblasts include addition of extracellular matrix that alters the native conditions of these cells. 
As a way to characterize the fibrotic, proliferative properties of these resection specimens we have developed a 3D culture system, using intact human resections of the nodule part of the cord. The system is based on transwell plates with an attached nitrocellulose membrane that allows contact of the tissue with the medium but not with the plastic, thus, preventing the alteration of the tissue. No collagen gel or other extracellular matrix protein substrate is required. The tissue resection specimens maintain their viability and proliferative properties for 7 days. This is the first &#8220;organ&#8221; culture system that allows human resection specimens from DD patients to be grown ex vivo and functionally tested, recapitulating the in vivo situation.

Human Dupuytren&#039;s Ex Vivo Culture for the Study of Myofibroblasts and Extracellular Matrix Interactions

Dupuytren&#8217;s disease (DD) is a fibroproliferative disease of the palm of the hand. Here, we present a protocol to culture resection specimens from DD in a three-dimensional (3D) culture system. Such short-term culture system allows preservation of the 3D structure and molecular properties of the fibrotic tissue.

Humano Dupuytren<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura para el Estudio de miofibroblastos y matriz extracelular Interacciones

Organ fibrosis or &#8220;scarring&#8221; is known to account for a high death toll due to the extensive amount of disorders and organs affected (from ...

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. Despite the discovery of key regulators of uterine contractility, this process is still not fully understood. Transgenic mice provide an ideal model in which to study parturition. Previously, the only method to study uterine contractility in the mouse was ex vivo isometric tension recordings, which are suboptimal for several reasons. The uterus must be removed from its physiological environment, a limited time course of investigation is possible, and the mice must be sacrificed. The recent development of radiometric telemetry has allowed for longitudinal, real-time measurements of in vivo intrauterine pressure in mice. Here, the implantation of an intrauterine telemeter to measure pressure changes in the mouse uterus from mid-pregnancy until delivery is described. By comparing differences in pressures between wild type and transgenic mice, the physiological impact of a gene of interest can be elucidated. This technique should expedite the development of therapeutics used to treat myometrial disorders during pregnancy, including preterm labor.

Intrauterine Telemetry to Measure Mouse Contractile Pressure In Vivo

This manuscript provides a protocol for implanting telemeters in the mouse for the purpose of measuring intrauterine pressures during pregnancy.

Telemetría intrauterina para medir la presión del ratón contráctil<em&gt; En Vivo</em

A complex integration of molecular and electrical signals is needed to transform a quiescent uterus into a contractile organ at the end of pregnancy. ...