Nos gustaría agradecer al Dr. Hesham Abdelbary humanos para proporcionar los especímenes quirúrgicos de los datos presentados en la figura 2.

1. Procesamiento de tejidos <ol><li> Para mejores resultados, este protocolo debe llevarse a cabo utilizando tejido aislado recién depositados en los medios de comunicación DMEM con 10% de SFB, 1% Pennicilin / estreptomicina solución, y el 0,1% anfotericina B solución inmediatamente después de la cirugía antes de su procesamiento. Si esto no es posible, los tejidos se puede dejar toda la noche en este medio a 4 grados antes del procesamiento. </li><li> Antes de procesar la muestra, esterilizar unas pinzas de metal y las cuchillas desechables, depositando en una solución de etanol al 70% por lo menos durante 5 minutos. También preparamos una placa de 24 pocillos con 2 ml de DMEM medio que contiene 10% de SFB, 1% Pennicilin / estreptomicina solución, y el 0,1% anfotericina B. </li><li> Recoger la muestra de tejido en una campana de flujo laminar cultivo celular utilizando pinzas esterilizadas y el depósito de tejido en un vacío de 15 cm de placa de Petri, manteniendo la tapa en el lateral, parte estéril hacia arriba. </li><li> En la capilla de cultivo celular, utilizar una biopsia en sacabocados de 2 mm para obtener núcleos diferentes de una variedad de regiones dentro de los tejidos como en la figura 1. Depósito de los núcleos en la tapa de la de Petri de 15 cm con la ayuda de unas pinzas, dejando espacio suficiente entre cada núcleo de manera que se pueden cortar a lo largo del eje horizontal. </li><li> Dividir cada núcleo en 4 cuartos, incluso utilizando una hoja de afeitar esterilizadas como en la figura 1. </li><li> Usando una punta de pipeta, poner a cada trimestre núcleo de un núcleo dado en un lugar bien distinto de A1 a A4 como en la figura 1, ya que contiene 1,5 ml de DMEM con 10% de SFB, 1% Pennicilin / estreptomicina solución, y la solución al 0,1% anfotericina B . Repita este procedimiento para cada núcleo. Esto debería permitir a una muestra representativa del tumor, minimizando el sesgo de un bien dado / condición. Para una mejor representación, aumentar el número de núcleos. </li></ol> 2. Evaluación de la viabilidad del tejido <ol><li> Procesamiento de los tejidos siguientes, agregar 25μl Alamar azul para así # # A1 y ​​A2 como se muestra en la figura 1 y se incuba durante 1 hora a 37 grados en un incubador humidificado con un 5% de CO 2. </li><li> Después de la incubación con alamar azul, eliminar 3 veces 100 l de cada uno de A1 y A2 bien y transferir a 6 diferentes pozos de una placa de 96 pocillos. Leer la señal mediante un lector de placas de fluorescencia (530 excitación, emisión de 590) y mantener los datos en sus archivos. </li><li> Después de Alamar azul señal de que se ha leído, la transferencia de todas las piezas de tejido mediante una punta de pipeta, de A1 a C1 y que contiene DMEM, 10% de SFB + PS + AmphoB. Tenga cuidado de no transferencia de una cantidad excesiva de medios de comunicación y A1. </li><li> Infectar a los pozos A3 y A4, respectivamente, con 10 6 UFP de que expresan GFP y luciferasa que expresan el virus de la vacuna diluida en 25 l de los medios de comunicación. Así A2 puede estar infectada con un virus que expresa que cualquier transgén dado incluso ninguno en absoluto. </li><li> 72 horas más tarde, se añaden 25 l azul Alamar a los pocillos C1 y D1 y repita el paso 2.2 </li></ol> 3. La visualización de la expresión del transgén GFP por microscopía de fluorescencia <ol><li> Quite todos los medios de cultivo celular que cubre las piezas de tejidos con el fin de tomar buenas imágenes de fluorescencia. </li><li> Utilizando un microscopio de disección de fluorescencia con capacidad de, en primer lugar tener una imagen de contraste de fase en una resolución adecuada </li><li> Cambiar a modo de fluorescencia y tomar una foto utilizando el filtro adecuado para visualizar el transgen de interés, en este caso las buenas prácticas agrarias. </li><li> Use un filtro de fluorescencia para otra longitud de onda en la medida de un posible de la de los transgenes de interés (por ejemplo, RFP) para tomar una fotografía de fluorescencia de fondo </li></ol> 4. La visualización de expresión de luciferasa utilizando un sistema de imágenes in vivo (IVIS) <ol><li> Asegúrese de que el IVIS se inicia antes de empezar. </li><li> En los pozos A4 y B4, añadir 5 l de sustrato luciferina 10 mg / ml, mezclar bien e incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Establecer el tiempo de exposición IVIS a 5 segundos y tomar una foto de sus pozos. Si la imagen está saturada, repetir con el tiempo de exposición más bajos. Si no hay señal, aumentar el tiempo de exposición. </li><li> Utilizando el software de imágenes IVIS, puede eliminar el fondo con la señal de bien B4 y seleccione la región de interés para cuantificar la señal de luminiscencia. </li></ol> 5. La evaluación de los títulos virales mediante el ensayo de placa <ol><li> Antes de la cuantificación de los títulos virales, los tejidos debe ser homogeneizada para liberar las partículas virales. Esto se puede hacer varios meses más tarde en las muestras de tejido infectado se almacenan a -80 </li><li> Pese la muestra que debe ser homogeneizada utilizando una balanza analítica. En este caso, vamos a utilizar la muestra tomada a partir de A2 bien. </li><li> Coloque el tejido en un tubo de 5 ml de poliestireno de fondo redondo de halcón y añadir 1 ml de PBS. Homogeneizar el tejido usando un homogeneizador de tejidos. Si es necesario, guarde el homogeneizado a -80 para la evaluación de los títulos virales en un momento posterior. </li><li> A título de virus vaccinia, primer plato 1 millón de células U2OS en una placa de 6 pocillos y se incuba durante la noche en un grado 37, 5% de CO 2 húmedoficados de tal manera que han llegado a aproximadamente el 95% de confluencia del día siguiente a la incubadora. </li><li> El uso medio libre de suero para hacer diluciones seriadas del virus, asegurándose de que cambie la punta de cada paso de dilución. Normalmente hacemos una en 10 diluciones y el uso de 100 l para transferir a 900 microlitros. ¿Cómo diluciones se hacen muchas depende del rendimiento esperado del virus. </li><li> Después de hacer las diluciones, retire el papel que cubre las células U20S chapado a continuación, añadir 500 l de stock de virus diluido (para cada dilución) para infectar a las células U2OS. Se incuban las células durante 1 minuto hora a 37 grados centígrados en un 5% de CO 2 humidificado incubadora. </li><li> Durante este tiempo, calentar el X 2 se concentró DMEM con 20% de SFB, y la solución al 3% del CMC en un baño de agua a 37 grados. </li><li> Después de la incubación de 1 hora, retire el papel que cubre las células infectadas U2OS. Mezcla 1:1 volumen de 3% de CMC: 2X DMEM, 20% de SFB en conjunto y el uso de 2 ml de esta mezcla para cubrir cada pocillo de las células infectadas U2OS. </li><li> Poner de nuevo en las células a 37 grados 5% de CO 2 humidificado incubadora durante 48 horas. </li><li> Después de 48 horas, añadir 2 ml de metanol-acético fijador de ácido en la parte superior de la plantilla del CMC en cada pocillo e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos en una campana de cultivos celulares. </li><li> Descartar la superposición fija y lavar el resto de de los pozos con agua del grifo. </li><li> Tinción de las células U2OS fija con 2 ml de una solución de azul de Coomassie por pocillo y se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente a baja velocidad en un agitador de placas. </li><li> Retire la tinción de Coomassie de los pocillos y lavar los platos con agua del grifo. Deje que se seque con el de la tapa durante aproximadamente una hora. </li><li> Las placas resultantes viral se puede visualizar fácilmente en la figura 2C. Las placas pueden guardarse indefinidamente en esta etapa. </li><li> Contar con placas en la etapa de dilución, donde entre 10 y 100 placas son visibles. </li><li> Multiplicar el número de placas contadas por la dilución empleada y multiplicar el número resultante por 2 para dar un título en PFU / ml. Por ejemplo, si se cuentan 25 placas en el pozo donde se utilizó una dilución de un millón de veces, el título de la muestra sin diluir inicial es de 25 multiplicado por 1 millón de multiplicar por 2 o 50 millones de PFU / ml. Además dividimos este número por el peso inicialmente medida de la muestra para informar de los títulos de UFP / g </li></ol> 6. Los resultados representativos: Con el fin de determinar con exactitud si una muestra de tejido obtenida quirúrgicamente normal / tumor es o no es infectables con el virus, primero debe asegurarse de que la muestra de tejido es menos viable. Fig. 1A muestra que la viabilidad se evaluó mediante un tinte metabólico (Alamar azul) y que el tejido normal y tumoral pueden permanecer metabólicamente activo durante un periodo de al menos 72 horas. Esto sugiere que los tejidos ex vivo cultivadas pueden apoyar la replicación viral. Una ventaja significativa de virus oncolíticos es que pueden ser modificados para expresar transgenes terapéuticos o de imagen. Fig. 2D-E demuestra que las buenas prácticas agrarias o de luciferasa se puede detectar a partir de tejidos infectados ex vivo, más el apoyo que estos tejidos son viables y infectables también. A pesar de una mayor expresión del transgen se asocia generalmente con la replicación viral, no es necesariamente equivalente a un ciclo de vida productiva viral que conduce a la auto-amplificación y la propagación, que se cree que es importante para la actividad terapéutica. Por esta razón, es necesario determinar si el virus se produce más de lo que se utilizó para infectar inicialmente el tejido. Fig. 2B muestra que en la cuantificación viral por la placa de ensayo, más virus se obtiene después de 72 horas y después la infección de tejido recogidas inmediatamente después de la infección. En general, estos datos muestran que el tejido extirpado quirúrgicamente tumor pueden permanecer viables en cultivo celular por un período de al menos 72 horas, durante el cual la replicación viral tiempo puede ser apoyada. <img src="/files/ftp_upload/2854/2854fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Descripción general de los tejidos de muestreo / seccionamiento protocolo. Muestras de tejido se procesa mediante la eliminación de varios núcleos de 2 mm que posteriormente se divide en cuatro cuartos que se distribuyen al azar en los pozos A1-A4. Los códigos de color indican los reactivos utilizados en cada pocillo. Las casillas sombreadas en los pozos representan cada trimestre desde el 6 núcleos individuo representado. El tejido en el pozo A1 se transfiere a un nuevo pozo (C1), con los medios de comunicación después de la lectura inicial alamar azul. Una segunda lectura se realiza al final de la incubación de 72 horas con el virus. Wells A4 y B4 se complementan con luciferina después de la incubación de 72 horas después de la infección <img src="/files/ftp_upload/2854/2854fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Viabilidad y infectability de muestras de tejido del paciente. A) la viabilidad del tejido, medido por alamar señal azul en 2 horas y 72 horas después de la recolección. Eje Y representa el espacio en blanco de la señal corregida alamar azul. B) título del virus vacciniarecogidos por gramo de muestras de tejidos 2 y 72 horas post-infección. C) Ejemplo de placas de virus vaccinia en células U2OS siguientes tinción con Coomassie. D) de la señal de luminiscencia obtenido de pacientes VV-luciferasa tejido infectado utilizando imágenes IVIS. E) imágenes de microscopía de fluorescencia de muestra de tejido de pacientes infectados con VV-GFP.

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Uno de los pasos críticos de este protocolo es la obtención de muestras de tejido fresco. Si la muestra se pone en cultivo de células después de una larga espera en la sala de operaciones en un medio inadecuado (por ejemplo, PBS), esto puede comprometer la viabilidad del tejido y evitar infectability. Es de destacar que el tejido normal es inherentemente más propensos a estos efectos que los tejidos tumorales. Otro punto crítico es cómo muchos núcleos se utilizan para tomar muestras del tejido y la consistencia de su tamaño. Inconsistencias en el tamaño se producirá una mayor variabilidad entre las muestras del paciente ya que factores como la hipoxia tisular y la superficie infectectable fluctuará en función del tamaño de los núcleos y barrios centrales. Si bien esto puede ser parcialmente resuelto mediante el uso de máquinas de cortar el tejido, una de las ventajas del método que aquí se presenta es que es relativamente fácil y menos propenso a la contaminación, y de aplicación general para una variedad de tipos de tejidos, incluyendo tejidos blandos o viscosos que no son fácilmente susceptibles en el tejido cortado. Cabe destacar que el número de núcleos se puede aumentar con el fin de obtener una mejor representación del tejido. Además, los núcleos se puede cortar en piezas más (por ejemplo, 5-8) para dar cabida a otros ensayos de potencial de hacerse en paralelo, como el ADN, el ARN, o la extracción de proteínas. Sin embargo, el número de piezas en las que los núcleos se puede cortar al tamaño reproducible dependerá del tamaño real de los núcleos, que pueden ser modificados mediante el uso de diferentes sacatestigos tamaño. Opcionalmente, una manera de ayudar a la obtención de piezas de tejido de forma reproducible de tamaño es para igualar la longitud de los núcleos con una regla antes de subdividir aún más en trozos más pequeños. El protocolo, naturalmente, puede ser modificado para dar cabida a otros virus y hemos descubierto que los tejidos pueden ser viables y apoyar la reproducción de hasta 6 días. El protocolo adicional se puede extender a otras mediciones de manera viral-expresado transgenes incluyendo cytrokines. Tras la infección, los tejidos también pueden ser embebidos en parafina para seguir el corte y coloración mediante métodos inmunohistoquímicos, lo que permite un mayor refinamiento de la histología de los tejidos y cómo se relaciona con la infección viral 10-12.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nombre del reactivo </th><th> Empresa </th><th> Número de catálogo </th><th> Comentarios (opcional) </th></tr><tr><td> Elevados de glucosa en DMEM </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.01 </td><td></td></tr><tr><td> De suero fetal bovino </td><td> NorthBio Inc. </td><td> NBSF-701 </td><td></td></tr><tr><td> Anfotericina B solución </td><td> Sigma Aldrich </td><td> A2942 </td><td> Uso en el 0,1% </td></tr><tr><td> Pennicilin-estreptomicina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> P4333 </td><td> Uso en el 1% </td></tr><tr><td> Alamar Blue </td><td> Invitrogen </td><td> DAL1025 </td><td></td></tr><tr><td> D-luciferina de sal de potasio </td><td> Productos de Imagen Molecular </td><td> D-luciferina de sal de potasio 1g </td><td> Volver a suspender en PBS a 10 mg / ml y el filtro de 0,22 micras filtro </td></tr><tr><td> MEM en polvo </td><td> Gibco </td><td> # 41500018 </td><td> Hacer en la mitad del volumen sugiere hacer 2X MEM y el filtro de 0,22 micras filtro antes de su uso </td></tr><tr><td> Carboximetil celulosa (CMC) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C9481 </td><td> Prepare una solución al 3% en agua destilada y autoclave. Tenga en cuenta que el polvo puede tomar algún tiempo para volver a suspender </td></tr><tr><td> Coomassie Brilliant Blue R </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B7920 </td><td></td></tr><tr><td> 2 mm biopsia punch </td><td> Miltex </td><td> MX-33-31 </td><td></td></tr><tr><td> Doble Filospada de preparación </td><td> Personna Medical Care </td><td> 74-0002 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio de disección de fluorescencia </td><td> Leica </td><td> modelo M205 FA </td><td></td></tr><tr><td> Imágenes in vivo del sistema (IVIS) </td><td> Caliper Life Sciences </td><td> IVIS ® serie 200 </td><td></td></tr><tr><td> Tejido Tearor </td><td> Biospec productos </td><td> modelo 985370-395 </td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo infection of live tissue with oncolytic viruses

Los virus oncolíticos (VO) son nuevas terapias que se replican en forma selectiva y eliminar las células tumorales 1. Varios ensayos clínicos que evalúan la efectividad de una variedad de plataformas incluyendo oncolíticos HSV, reovirus, y VO Vaccinia como tratamiento para el cáncer son actualmente 5.2 en marcha. Una característica clave de los virus oncolíticos es que pueden ser modificados genéticamente para expresar transgenes periodista que hace posible visualizar la infección de los tejidos al microscopio o bio-luminiscencia de imagen 6,7. Esto ofrece una ventaja única, ya que es posible infectar los tejidos de los pacientes ex vivo antes de la terapia con el fin de determinar la probabilidad de éxito viroterapia oncolíticos 8. Para ello, es fundamental para la muestra adecuada de tejido para compensar la heterogeneidad del tejido y evaluar la viabilidad del tejido, especialmente antes de la infección 9. También es importante seguir la replicación viral con transgenes periodista si se expresa por la plataforma oncolíticos, así como por la valoración directa de los tejidos después de la homogeneización con el fin de distinguir entre infección abortiva y productiva. El objeto de este protocolo es para tratar estos temas y en este documento se describe una. El muestreo y la preparación del tejido tumoral para el cultivo celular 2. La evaluación de la viabilidad del tejido con el metabolismo tinte azul alamar 3. Infección ex vivo de tejidos cultivados con el virus vaccinia que expresan bien las buenas prácticas agrarias o luciferasa de luciérnaga 4. La detección de la expresión del transgén por microscopía de fluorescencia o el uso de un sistema de imágenes in vivo (IVIS) 5. La cuantificación del virus de la placa de ensayo. Este método integral presenta varias ventajas, incluyendo la facilidad de procesamiento de tejidos, la compensación por la heterogeneidad del tejido, el control de la viabilidad del tejido, y la discriminación entre la infección abortiva y hueso la replicación viral de buena fe.

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Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Virus oncolíticos son prometedores para la terapéutica del cáncer. La capacidad de determinar la infectability de muestras de tejido obtenidas de pacientes vivos antes del tratamiento es una ventaja única de este enfoque terapéutico. Este protocolo describe cómo procesar los tejidos de<em&gt; Ex vivo</em&gt; Infección con el virus oncolíticos y cuantificación viral posterior.

Ex infección in vivo del tejido vivo con virus oncolíticos

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

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JoVE Journal

Medicine

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

12.6K vistas.  Ottawa Hospital Research Institute (OHRI). Virus oncolíticos son prometedores para la terapéutica del cáncer. La capacidad de determinar la infectability de muestras de tejido obtenidas de pacientes vivos antes del tratamiento es una ventaja única de este enfoque terapéutico. Este protocolo describe cómo procesar los tejidos de Ex vivo Infección con el virus oncolíticos y cuantificación viral posterior.

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Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery. Fresh patient tissue obtained at the time of surgery is sliced and maintained in culture. The ex vivo model system allows for the physical delivery of genes into intact patient tissue and gene expression is analysed by bioluminescence imaging using the IVIS detection system. The bioluminescent detection system demonstrates rapid and accurate quantification of gene expression within individual slices without the need for tissue sacrifice. This slice tissue culture system may be used in a variety of tissue types including normal and malignant tissue and allows us to study the effects of the heterogeneous nature of intact tissue and the high degree of variability between individual patients. This model system could be used in certain situations as an alternative to animal models and as a complementary preclinical mode prior to entering clinical trial.

Ex Vivo Culture of Patient Tissue &amp; Examination of Gene Delivery

This article describes the culture of patient tissue slices for gene delivery studies and subsequent analysis of gene expression using IVIS bioluminescence imaging.

Ex Vivo Cultura de tejido del paciente y examen de la entrega de genes

This video describes the use of patient tissue as an ex vivo model for the study of gene delivery.  Fresh patient tissue obtained at the time of surgery ...

Investigación

Medicina

Handling of the Cotton Rat in Studies for the Pre-clinical Evaluation of Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact. For this strategy to be successful, recent studies have shown that involvement of the host immune system is essential. Therefore, oncolytic virotherapy should be evaluated within the context of an immunocompetent model. Furthermore, the study of antitumor therapies in tolerized animal models may better recapitulate results seen in clinical trials. Cotton rats, commonly used to study respiratory viruses, are an attractive model to study oncolytic virotherapy as syngeneic models of mammary carcinoma and osteosarcoma are well established. However, there is a lack of published information on the proper handling procedure for these highly excitable rodents. The handling and capture approach outlined minimizes animal stress to facilitate experimentation. This technique hinges upon the ability of the researcher to keep calm during handling and perform procedures in a timely fashion. Finally, we describe how to prepare cotton rat mammary tumor cells for consistent subcutaneous tumor formation, and how to perform intratumoral and intraperitoneal injections. These methods can be applied to a wide range of studies furthering the development of the cotton rat as a relevant pre-clinical model to study antitumor therapy.

Cotton rats are extremely excitable and have a strong flight-or-fight response. A handling method optimized to reduce the stress of the animals is described which will make cotton rats more accessible as a preclinical model.

Manejo de la rata del algodón en Estudios para la evaluación preclínica de virus oncolíticos

Oncolytic viruses are a novel anticancer therapy with the ability to target tumor cells, while leaving healthy cells intact.  For this strategy to be ...

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular and molecular processes that govern metastatic dissemination and growth are still elusive. Live imaging allows visualization of the dynamic and spatial interactions of cells and their microenvironment. Solid tumors commonly metastasize to the lungs. However, the anatomical location of the lungs poses a challenge to intravital imaging. This protocol provides a relatively simple and quick method for ex vivo live imaging of the dynamic interactions between tumor cells and their surrounding stroma within lung metastasis. Using this method, the motility of cancer cells as well as interactions between cancer cells and stromal cells in their microenvironment can be visualized in real time for several hours. By using transgenic fluorescent reporter mice, a fluorescent cell line, injectable fluorescently labeled molecules and/or antibodies, multiple components of the lung microenvironment can be visualized, such as blood vessels and immune cells. To image the different cell types, a spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid, four-color image acquisition has been used. Time-lapse movies compiled from images collected over multiple positions and focal planes show interactions between live metastatic and immune cells for at least 4 hr. This technique can be further used to test chemotherapy or targeted therapy. Moreover, this method could be adapted for the study of other lung-related pathologies that may affect the lung microenvironment.

Ex vivo Live Imaging of Lung Metastasis and Their Microenvironment

We describe a relatively simple method for ex vivo live imaging of the tumor cell-stroma interactions within lung metastasis, utilizing fluorescent reporters in mice. Using spinning-disk confocal microscopy, this technique enables visualization of live cells for at least 4 hr and could be adapted to study other inflammatory lung conditions.

Ex vivo de imágenes en vivo de metástasis pulmonar y su microambiente

Metastasis is a major cause for cancer-related morbidity and mortality. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular ...

Transarterial Administration of Oncolytic Viruses for Locoregional Therapy of Orthotopic HCC in Rats

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis. In recent years, oncolytic virotherapies have proven themselves to be potentially powerful tools to fight malignancy. Due to the unique dual blood supply in the liver, it is possible to apply therapies locally to orthotopic liver tumors, which are predominantly fed by arterial blood flow. We have previously demonstrated that hepatic arterial delivery of oncolytic viruses results in safe and efficient transduction efficiency of multifocal HCC lesions, resulting in significant prolongation of survival in immune competent rats. This procedure closely mimics the application of transarterial embolization in patients, which is the standard palliative care provided to many HCC patients. The ability to administer tumor therapies through the hepatic artery in rats allows for a highly sophisticated preclinical model for evaluating novel viral vectors under development. Here we describe the detailed protocol for microdissection of the hepatic artery for infusion of oncolytic virus vectors to treat orthotopic HCC.

Oncolytic virotherapies are under development as novel therapeutics for the treatment of hepatocellular carcinoma (HCC). Here we describe a method for locoregional therapy of HCC via hepatic arterial administration of oncolytic virus.

Administración transarterial de virus oncolíticos para locorregional Terapia de HCC ortotópico en ratas

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a disease with limited treatment options and poor prognosis.  In recent years, oncolytic virotherapies have proven ...

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to establish human enteroid ex vivo culture systems are important to model intestinal pathophysiology and to study the particular cellular responses involved. In recent years, enteroids from mice and humans are being cultured, passaged, and banked away for future use in several laboratories across the world. This enteroid platform can be used to test the effects of various treatments and drugs and what effects are exerted on different cell types in the intestine. Here, a protocol for establishing primary stem cell-derived small intestinal enteroids derived from neonatal mice and premature human intestine is provided. Moreover, this enteroid culture system was utilized to test the effects of species-specific breast milk. Mouse breast milk can be obtained efficiently using a modified human breast pump and expressed mouse milk can then be used for further research experiments. We now demonstrate the effects of expressed mouse, human, and donor breast milk on the growth and proliferation of enteroids derived from neonatal mice or premature human small intestine.

Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation

This protocol describes how to establish an enteroid culture system from neonatal mouse or premature human intestine as well as an efficient method to collect milk from mice.

La leche materna mejora el crecimiento de Enteroids: un modelo Ex Vivo de la proliferación celular

Human small intestinal enteroids are derived from the crypts and when grown in a stem cell niche contain all of the epithelial cell types. The ability to ...

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. Therefore, adjuvants with both humoral and cellular immuno-stimulatory capabilities that are able to promote cytotoxic T lymphocytes (CTL) responses are urgently needed. Thus, faithful monitoring of adjuvant candidates that induce cross-priming and subsequently enhance CTL generation represents a crucial step in vaccine development. In here we present an application for a method that uses SIINFEKL-specific (OT-I) T cells to monitor the cross-presentation of the model antigen ovalbumin (OVA) in vivo in the presence of different adjuvant candidates. This method represents a rapid test to select adjuvants with the best cross-priming capabilities. The proliferation of CD8+ T cells is the most valuable indication of cross-priming and it is also regarded as a correlate of adjuvant-induced cross-presentation. This feature can be evaluated in different immune organs like lymph nodes and spleen. The extent of the CTL generation can also be monitored, thereby giving insights on the nature of a local (draining lymph node mainly) or a systemic response (distant lymph nodes and/or spleen). This technique further allows multiple modifications for testing drugs that can inhibit specific cross-presentation pathways and also offers the possibility to be used in different strains of conventional and genetically modified mice. In summary, the application that we present here will be useful for vaccine laboratories in industry or academia that develop or modify chemical adjuvants for vaccine research and development.

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant&#039;s Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

We present here an application for a standard immunological technique (CFSE stained OT-I proliferation) intended to rapidly monitor adjuvant-mediated cytotoxic T lymphocyte (CTL) generation in vivo. This fast estimation of CTL capacities is useful for the development of prophylactic vaccines against intracellular pathogens as well as therapeutic cancer vaccines.

Rápida In Vivo evaluación de las capacidades de generación de linfocitos T citotóxicos de coadyuvante para el desarrollo de una vacuna

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been introduced as a method to evaluate and modify organ function. NEVLP has many advantages in comparison to hypothermic and subnormothermic perfusion including reduced preservation injury, restoration of normal organ function under physiologic conditions, assessment of organ performance, and as a platform for organ repair, remodeling, and modification. Both murine and porcine NEVLP models have been described. We demonstrate a rat model of NEVLP and use this model to show one of its important applications &#8212; the use of a therapeutic molecule added to liver perfusate. Catalase is an endogenous reactive oxygen species (ROS) scavenger and has been demonstrated to decrease ischemia-reperfusion in the eye, brain, and lung. Pegylation has been shown to target catalase to the endothelium. Here, we added pegylated-catalase (PEG-CAT) to the base perfusate and demonstrated its ability to mitigate liver preservation injury. An advantage of our rodent NEVLP model is that it is inexpensive in comparison to larger animal models. A limitation of this study is that it does not currently include post-perfusion liver transplantation. Therefore, prediction of the function of the organ post-transplantation cannot be made with certainty. However, the rat liver transplant model is well established and certainly could be used in conjunction with this model. In conclusion, we have demonstrated an inexpensive, simple, easily replicable NEVLP model using rats. Applications of this model can include testing novel perfusates and perfusate additives, testing software designed for organ evaluation, and experiments designed to repair organs.

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

There is a significant liver donor shortage, and criteria for liver donors have been expanded. Normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) has been developed to evaluate and modify organ function. This study demonstrates a rat model of NEVLP and tests the ability of pegylated-catalase, to mitigate liver preservation injury.

Un pequeño modelo de la perfusión hepática normotérmica Ex Vivo

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No current animal models of diabetes and oxygen-induced retinopathy develop the full-range progressive changes manifested in human proliferative diabetic retinopathy (PDR). Therefore, understanding of the disease pathogenesis and pathophysiology has relied largely on the use of histological sections and vitreous samples in approaches that only provide steady-state information on the involved pathogenic factors. Increasing evidence indicates that dynamic cell-cell and cell-extracellular matrix (ECM) interactions in the context of three-dimensional (3D) microenvironments are essential for the mechanistic and functional studies towards the development of new treatment strategies. Therefore, we hypothesized that the pathological fibrovascular tissue surgically excised from eyes with PDR could be utilized to reliably unravel the cellular and molecular mechanisms of this devastating disease and to test the potential for novel clinical interventions. Towards this end, we developed a novel method for 3D ex vivo culture of surgically-excised patient-derived fibrovascular tissue (FT), which will serve as a relevant model of human PDR pathophysiology. The FTs are dissected into explants and embedded in fibrin matrix for ex vivo culture and 3D characterization. Whole-mount immunofluorescence of the native FTs and end-point cultures allows thorough investigation of tissue composition and multicellular processes, highlighting the importance of 3D tissue-level characterization for uncovering relevant features of PDR pathophysiology. This model will allow the simultaneous assessment of molecular mechanisms, cellular/tissue processes and treatment responses in the complex context of dynamic biochemical and physical interactions within the PDR tissue architecture and microenvironment. Since this model recapitulates PDR pathophysiology, it will also be amenable for testing or developing new treatments.

Here, we present a protocol to study the pathophysiology of proliferative diabetic retinopathy by using patient-derived, surgically-excised, fibrovascular tissues for three-dimensional native tissue characterization and ex vivo culture. This ex vivo culture model is also amenable for testing or developing new treatments.

Un modelo de cultivo de tejidos Ex Vivo para las complicaciones Fibrovascular en la retinopatía diabética proliferativa

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

Etiquetado de inmunofluorescencia de trampas extracelulares de neutrófilos humanos y murinos en tejido incrustado por parafina

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to larger animals. Yet, larger mammals are better suited for translational research questions related to normal cardiac physiology, pathophysiology, and preclinical testing of therapeutic agents. To overcome the technical barriers associated with employing a larger animal model in cardiac research, we describe an approach to measure physiological parameters in an isolated, Langendorff-perfused piglet heart. This approach combines two powerful experimental tools to evaluate the state of the heart: electrophysiology (EP) study and simultaneous optical mapping of transmembrane voltage and intracellular calcium using parameter sensitive dyes (RH237, Rhod2-AM). The described methodologies are well suited for translational studies investigating the cardiac conduction system, alterations in action potential morphology, calcium handling, excitation-contraction coupling and the incidence of cardiac alternans or arrhythmias.

The objective of this study was to establish a method for investigating cardiac dynamics using a translational animal model. The described experimental approach incorporates dual-emission optocardiography in conjunction with an electrophysiological study to assess electrical activity in an isolated, intact porcine heart model.

Estudios de Optocardiografía y Electrofisiología de Corazones Perfundidos Ex Vivo Langendorff

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...