Este trabajo fue apoyado por una Fundación CASS Ciencia y Medicina de subvención; (MB); un Health &amp; Medical National Research Council de Australia Project (KLS, 338516); y por el Programa Operacional de Apoyo a la Infraestructura del Gobierno de Victoria (Australia).

1. Preparación de las células, Medios y Reactivos <ol><li> Preparación del medio que contiene metilcelulosa- <ol><li> Disolver 1,5 g de metilcelulosa en 100 ml de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (sin aditivos) en un matraz de 250 ml. </li><li> Calentar la solución a bajo en el microondas durante 5 min; tener cuidado para evitar hirviendo sobre. </li><li> Una vez que el polvo de metilcelulosa es semi-disueltos, añadir un agitador magnético limpio y los medios de comunicación para tomar el volumen a 125 ml. </li><li> Mezclar, invertido, y se agita a temperatura ambiente durante 1,5 horas, seguido de agitación a 4 ° C durante la noche. </li><li> Dividir la solución en partes iguales en cuatro tubos de 50 ml y centrifugar durante 1,5 horas a 2300 x g. </li><li> Recoger el sobrenadante transparente, de alta viscosidad (aproximadamente el 90-95% de las acciones), alícuota en tubos de 50 ml estériles, y se almacena a 4 ° C durante un máximo de 3 meses. </li></ol></li><li> Cultura y Etiquetado de las células <ol><li> Mantener las líneas celulares de cáncer de ovario en monocapa en un tiincubadora de cultivo ncidencia a 37 ° C, 5% de CO2 en medio de crecimiento apropiado (DMEM para las células KGN 17 y MCBD110: M199 para las líneas celulares OVCA429 y OVCA433 18) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM de L -glutamina, y 1% de penicilina-estreptomicina. </li><li> Mantener las células mesoteliales humanos LP9 en M199: Hams medio F12 que contiene 15% de FBS, 10 ng / ml de Factor de Crecimiento Epidérmico (EGF) y 400 ng / ml de hidrocortisona, en una incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Se siembran las células en el tamaño deseado frasco y crecen hasta aproximadamente el 75% de confluencia. Células de la cosecha por tripsinización utilizando 0,05% de tripsina / EDTA, centrifugado a 186 xg durante 5 min, y lavar sedimento de células dos veces con PBS. </li><li> Contar las células utilizando un hemocitómetro. </li></ol></li><li> Método de etiquetado celular fluorescente opcional <ol><li> Resuspender las células cancerosas a una concentración final de 1 x 10 6 células / ml en 1 ml de precalentado PBS/0.1% de BSA. </li><li> Añadir 2 l de 5 mM de stock célula Trsolución CSFE as (u otra etiqueta celular preferida que está retenido a largo plazo) a las células a una concentración final de 10 mM y se incuba a 37 ° C durante 10-15 min en un baño de agua. </li><li> Se inactiva la reacción con 1 ml de medio frío de hielo que contienen 10% de FBS y de re-sedimento por centrifugación. Resuspender en 10 ml de medio de crecimiento precalentado adecuado (vea Paso 1.2.1). </li><li> Se siembran las células en un 75 cm2 de filtro con tapa el frasco y la cultura a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Compruebe células bajo un microscopio de fluorescencia para verificar que el nivel de fluorescencia de etiquetado es adecuada para la detección. Una vez que las células alcanzan aproximadamente el 75% de confluencia, cosecha y cuentan que en los pasos 1.2.3 y 1.2.4 anteriores. </li></ol></li></ol> 2. Generación de esferoides en metilcelulosa <ol><li> Calcular el volumen de las células de cáncer de ovario de la sección 1 necesarias para la generación de esferoide (se requiere un total de 300.000 células por cada pleno experimento placa de 96 pocillos). Note: si el uso de diferentes líneas celulares que se presenta aquí, pueden necesitar ser optimizado para cada línea de las densidades de células de generación de esferoide uniforme. </li><li> Para calcular la dilución de las células en los medios de comunicación metilcelulosa, en primer lugar restar el volumen de la celda requerida (paso 2.1) a partir de 15 ml. </li><li> Añadir 3 ml de solución de metilcelulosa (para hacer 20% de metilcelulosa final) a un volumen de medio de cultivo apropiado para cada línea celular, igual a 15 ml, menos el volumen de la celda y se mezcla a fondo por inversión suave. </li><li> Añadir 300.000 células al medio que contiene metilcelulosa y mezclado a fondo por inversión suave. </li><li> Pipetear 150 l de la mezcla de células / metilcelulosa / media (para un total de 3000 células / pocillo) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos cóncava cultivo de fondo y de la cultura a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 1-4 días o hasta esferoides uniformes forman (1 esferoide / pocillo se observa por lo general). </li></ol> 3. RTCA celulares Invasión ensayos NOTE: lecturas de impedancia se expresan como el Índice de Células (CI), un parámetro adimensional que es un cambio relativo en la impedancia de la pila medida que representa el estado de las células. Para el análisis, los datos de importación en una hoja de cálculo, como Microsoft Excel. <ol><li> Preparación Plate <ol><li> Trabajando en grupos de 4 pozos a la vez, añadir 50 l de matriz (diluido 1:10 en medio de cultivo libre de suero) a cada pocillo de la cámara superior de una placa de 16 pocillos RTCA CIM para asegurar que el área total de la superficie está cubierta . Retire 30 l de la matriz de inmediato, pero poco a poco, para deshacerse de cualquier exceso de líquido. </li><li> Incubar la placa a 37 ° C durante 4 horas antes de su uso en una incubadora de cultivo de tejidos. </li><li> Añadir 30 l de medio libre de suero (SFM) apropiados para cada línea celular de cáncer a la cámara superior y 160 l de los medios de comunicación con o sin suero (según su diseño experimental) a la cámara inferior. </li><li> Montar la placa CIM haciendo clic en la cámara baja en la cámara superior y equilibrcomió en una incubadora a 37 ° durante 1 hora en una incubadora de cultivo de tejidos. </li></ol></li><li> Programación del instrumento RTCA <ol><li> Abra el programa de RTCA y seleccione la pestaña &quot;Diseño&quot;. Resalte todos los pozos experimentales. </li><li> Haga clic derecho sobre pozos y seleccione &#39;Activar pozos&#39;; luego rellenar condiciones experimentales y nombres de celda si lo deseas. </li><li> Para agregar pasos o pasos secundarios para el programa, seleccione la pestaña &#39;Schedule&#39; y haga clic derecho en &#39;Agregar un paso&#39;. El primer paso es una preprogramada barrido de fondo, que se incorpora automáticamente en el programa una vez &#39;agregar un paso&#39; que se elija. </li><li> Introduzca los detalles del programa que desee para la Etapa 2 del programa de RTCA, que se registrarán las lecturas durante el establecimiento de la monocapa LP9. Agregar los intervalos de tiempo entre lecturas de impedancia seleccionando la pestaña &#39;Intervalo&#39; y entrar &#39;15 minutos &#39;. Agregar duración experimental seleccionando el &#39;Duración&#39; una pestañad entrar en un tiempo de entre 12 a 24 horas. </li><li> Para agregar pasos posteriores, seleccione la pestaña &#39;Schedule&#39; y haga clic derecho en &#39;Agregar un paso &quot;e introduzca los detalles de los pasos adicionales, como el anterior. Paso 3 del programa RTCA dirigirá el instrumento para tomar las lecturas durante la invasión esferoide; introducir min &#39;5 &#39;bajo la&#39; pestaña &#39;y &#39;48 horas&#39; de intervalo en la pestaña &quot;Duración&quot;. </li><li> Seleccione &#39;plato&#39; en la barra de menú y guardar. </li></ol></li><li> Generación de LP9 monocapa y medición del esferoide Invasión <ol><li> Coloque la placa de la CIM en el instrumento RTCA y programa abierto desde el paso 3.2 anterior. Antes de la adición de células, seleccione &#39;Ejecutar&#39; en la barra de menú y luego en &quot;Inicio&quot;. Un barrido de fondo se realizará automáticamente (paso 1 en las instrucciones del software RTCA). </li><li> Retire la placa de la CIM desde el instrumento tras el barrido de fondo y el lugar en una campana de cultivo de tejidos. </li><li> 50,0 Placa00 LP9 células suspendidas en 160 l SFM en la cámara superior de cada placa CIM también. </li><li> Colocar la placa en el instrumento RTCA y tomar lecturas cada 15 minutos, mientras que la monocapa LP9 está estableciendo durante la noche (Paso 2 del programa RTCA). </li><li> Cosecha esferoides cancerosas generan en la etapa 2 &#39;Generación de esferoides en metilcelulosa&#39;, arriba. <ol><li> Asépticamente, corte 1 mm de la parte superior de una punta de pipeta de 1 ml y utilizar para recuperar suavemente el contenido de cada pocillo. Transferir a un tubo estéril. </li><li> Se centrifuga a 120 xg esferoides durante 8 minutos, y retirar medio de metilcelulosa que contiene por aspiración suave. </li><li> Lave esferoides dos veces más con PBS, centrifugar a 120 xg durante 8 minutos para sedimentar esferoides después de cada lavado. </li><li> Para cada pocillo experimental, resuspender un total de 10 esferoides en 160 l de medio sin FBS. </li><li> Pausa el experimento RTCA seleccionando &#39;Ejecutar&#39; desde la barra de menú y la comprobación y# 8216; Pausa &#39;. Retire la placa de la CIM en el instrumento, y colocarlos en una campana de cultivo de tejidos. Aspirar los medios de comunicación de cada pocillo y reemplazar con los medios de comunicación que contiene esferoide (10 esferas en 160 l) o medio fresco para los pocillos de control-LP9 solamente. </li></ol></li><li> Devuelva la placa al instrumento RTCA. Seleccione &#39;Ejecutar&#39; desde la barra de menú y comprobar &#39;Abortar paso&#39;. El programa se desplazará al siguiente paso automáticamente. Para reanudar el experimento, seleccione &#39;Ejecutar&#39; desde la barra de menú y comprobar &#39;Start / Continue&#39;. Paso 3 en el programa RTCA iniciará. </li></ol></li><li> Análisis de Datos <ol><li> Para determinar el nivel de invasividad de las células esferoide, restar los valores obtenidos para la monocapa LP9 sólo a partir de las lecturas individuales obtenidos para las líneas celulares de cáncer de ovario en cada punto de tiempo. </li><li> Para trazar &quot;invasión esferoide &#39;, normalizar todos los valores hasta el punto de tiempo en el que se añadieron los esferoides en la placa, por setting ese punto de tiempo a &#39;0 &#39;. </li></ol></li></ol>

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	<li>Ferlay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimates+of+worldwide+burden+of+cancer+in+2008:+GLOBOCAN.">Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN.</a> Int J Cancer. 127, 2893-2917 (2008).</li><li>Ahmed, N., Stenvers, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+know+ovarian+cancer+ascites:+opportunities+for+targeted+therapy-+based+translational+research.">Getting to know ovarian cancer ascites: opportunities for targeted therapy- based translational research.</a> Frontiers in Oncology. 3, (2013).</li><li>Karst, A. M., Drapkin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+pathogenesis:+a+model+in+evolution.">Ovarian cancer pathogenesis: a model in evolution.</a> J Oncol. 2010, (2010).</li><li>Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+development+and+metastasis.">Ovarian cancer development and metastasis.</a> Am J Pathol. 177, 1053-1064 (2010).</li><li>Shield, K., Ackland, M. L., Ahmed, N., Rice, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+spheroids+in+ovarian+cancer+metastases:+Biology+and+pathology.">Multicellular spheroids in ovarian cancer metastases: Biology and pathology.</a> Gynecol Oncol. 113, 143-148 (2009).</li><li>Hudson, L. G., Zeineldin, R., Stack, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+plasticity+of+neoplastic+ovarian+epithelium:+unique+cadherin+profiles+in+tumor+progression.">Phenotypic plasticity of neoplastic ovarian epithelium: unique cadherin profiles in tumor progression.</a> Clin Exp Metastasis. 25, 643-655 (2008).</li><li>Burleson, K. M., Boente, M. P., Pambuccian, S. E., Skubitz, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disaggregation+and+invasion+of+ovarian+carcinoma+ascites+spheroids.">Disaggregation and invasion of ovarian carcinoma ascites spheroids.</a> J Transl Med. 4, 6 (2006).</li><li>Burleson, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+carcinoma+ascites+spheroids+adhere+to+extracellular+matrix+components+and+mesothelial+cell+monolayers.">Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers.</a> Gynecol Oncol. 93, 170-181 (2004).</li><li>Burleson, K. M., Hansen, L. K., Skubitz, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+carcinoma+spheroids+disaggregate+on+type+I+collagen+and+invade+live+human+mesothelial+cell+monolayers.">Ovarian carcinoma spheroids disaggregate on type I collagen and invade live human mesothelial cell monolayers.</a> Clin Exp Metastasis. 21, 685-697 (2004).</li><li>Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initial+steps+of+ovarian+cancer+cell+metastasis+are+mediated+by+MMP-2+cleavage+of+vitronectin+and+fibronectin.">The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin.</a> J Clin Invest. 118, 1367-1379 (2008).</li><li>Kenny, H. A., Nieman, K. M., Mitra, A. K., Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+First+Line+of+Abdominal+Metastatic+Attack:+Breaching+the+Mesothelial+Cell+Layer.">The First Line of Abdominal Metastatic Attack: Breaching the Mesothelial Cell Layer.</a> Cancer Discov. 1, 100-102 (2011).</li><li>Hattermann, K., Held-Feindt, J., Mentlein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+confrontation+assay:+a+simple+method+to+monitor+the+three-dimensional+migration+of+different+cell+types+in+vitro.">Spheroid confrontation assay: a simple method to monitor the three-dimensional migration of different cell types in vitro.</a> Ann Anat. 193, 181-184 (2011).</li><li>Laib, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid-based+human+endothelial+cell+microvessel+formation+in+vivo.">Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo.</a> Nat Protoc. 4, 1202-1215 (2009).</li><li>Latifi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+tumor+cells+from+the+ascites+of+ovarian+cancer+patients:+molecular+phenotype+of+chemoresistant+ovarian+tumors.">Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Davidowitz, R. A., Iwanicki, M. P., Brugge, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+mesothelial+clearance+assay+that+models+the+early+steps+of+ovarian+cancer+metastasis.">In vitro mesothelial clearance assay that models the early steps of ovarian cancer metastasis.</a> J Vis Exp. (60), (2012).</li><li>Iwanicki, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+spheroids+use+myosin-generated+force+to+clear+the+mesothelium.">Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium.</a> Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).</li><li>Nishi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+characterization+of+a+steroidogenic+human+granulosa-like+tumor+cell+line,+KGN,+that+expresses+functional+follicle-stimulating+hormone+receptor.">Establishment and characterization of a steroidogenic human granulosa-like tumor cell line, KGN, that expresses functional follicle-stimulating hormone receptor.</a> Endocrinology. 142, 437-445 (2001).</li><li>Xu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+outcome+of+heregulin-induced+activation+of+ovarian+cancer+cells+depends+on+the+relative+levels+of+HER-2+and+HER-3+expression.">The outcome of heregulin-induced activation of ovarian cancer cells depends on the relative levels of HER-2 and HER-3 expression.</a> Clin Cancer Res. 5, 3653-3660 (1999).</li></ol>

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Invadir las células de cáncer de ovario interactúan con una variedad de tipos de células en la superficie del peritoneo, incluyendo fibroblastos, adipocitos, y células mesoteliales, y se cree comunicación bidireccional entre las células cancerosas y las células peritoneales para jugar papeles clave en la conducción del proceso metastásico 2. Una vez dominado, el protocolo descrito en el presente documento es fácilmente adaptable para el estudio de estas interacciones dentro del microambiente peritoneal, por ejemplo, a través de la adición de citoquinas exógenas, factores de crecimiento, o inhibidores específicos a las cámaras superiores o inferiores de la placa de la CIM bien o manipulación genética del cáncer o líneas de células peritoneales. Además, este método puede ser utilizado con células de tumor de ovario primarios recién cosechadas a partir de la ascitis maligna y / o células peritoneales primarios para obtener información directa en el señales reguladoras y las interacciones celulares que rigen el establecimiento de una lesión metastásica dentro de la cavidad peritoneal <shasta&gt; 2. El uso del instrumento RTCA para medir la capacidad invasiva de las células individuales o esferoides ofrece varias ventajas con respecto a los ensayos de punto final individuales convencionales y análisis de la imagen de lapso de tiempo. El instrumento RTCA mide la invasión celular a intervalos definidos de forma continua en el transcurso de un ensayo, que puede ser de horas o días. Esto permite la determinación de los cambios en la tasa de invasión a través del tiempo, lo que supera las limitaciones de los ensayos de punto final individuales. Por ejemplo, el examen de los datos de la invasión de las diferentes líneas celulares de cáncer en un solo punto final (Figura 2), por ejemplo, 3 horas, podrían haber llevado a la conclusión errónea de que KGN y OVCA433 células eran mucho más invasivo que OVCA429 células. Otra ventaja de esta tecnología es que el instrumento RTCA mide los cambios en la impedancia eléctrica. Esto significa que los ensayos se pueden ejecutar sin marcar las células con un agente exógeno, lo que podría tener efectos no deseados sobre phen celularotype o función. Esto se convierte en particularmente importante en el estudio de células de cáncer de ovario primarios derivados de ascitis maligna, con las que es imperativo mantener las manipulaciones a un mínimo con el fin de evitar la introducción de cambios moleculares y fenotípicos que no son un reflejo de su naturaleza in vivo 2. Además, el uso del instrumento RTCA permite la recogida de datos cuantitativos en tiempo real, que no sólo evita el tiempo de consumo de análisis asociados con la microscopía de lapso de tiempo sino que también permite la determinación rápida de ventanas experimentales clave para la optimización de ensayo. Esto es particularmente útil cuando se comparan los efectos de una variedad de factores sobre la invasión esferoide, ya que diferentes factores pueden ejercer sus efectos máximos en diferentes puntos de tiempo o con diferentes perfiles en gran medida con el tiempo. Aunque este protocolo puede ser objeto de modificaciones (por ejemplo, el uso de diferentes matrices ECM, diferentes líneas celulares de cáncer, o diferente cel objetivoLS), si al hacerlo, es importante tener en cuenta que las diversas condiciones experimentales primero se deben optimizar. Por ejemplo, antes de comenzar los estudios de invasión esferoide, el número óptimo de células de cáncer / placa de CIM bien debe en primer lugar ser determinado mediante el ensayo de las titulaciones número de células en cultivo en monocapa. El número óptimo de esferoides para usar por pocillo se basa entonces en este análisis. Por ejemplo, en el método actual, esferoides comprenden aproximadamente 3000 células cada uno cuando primero generada. Si titulaciones número de células iniciales indican que 30.000 células en monocapa son óptimas para la detección en la invasión de análisis, a continuación, se añaden 10 esferoides por placa CIM bien. Por otra parte, al llevar a cabo experimentos de co-cultivo, es importante estudiar los comportamientos del &quot;objetivo&quot; monocapa celular por separado con el fin de determinar si estas células son inherentemente invasivo, ya que esto podría confundir los resultados. En el ejemplo demostrado, esferoides cáncer se siembran en placa en la parte superior de un Monola celular LP9yer, con y sin FBS añadido a la parte inferior así como un quimioatrayente. En paralelo, las células se cultivaron LP9 solo, bajo cada condición de tratamiento. Del mismo modo, cuando el estudio de la capacidad invasiva de las células y los esferoides, también es importante examinar sus capacidades migratorias así con el fin de distinguir los dos comportamientos (es decir, la invasión requiere la digestión proteolítica de una barrera de ECM, mientras que la migración no lo hace). Para ello, omita la barrera ECM (Pasos 3.1.1 - 3.1.3) y llevar a cabo el ensayo en paralelo con la barrera de ECM en su lugar. La medida de &quot;invasión&quot; este último se puede corregir a la antigua medida «migración», si se desea. Finalmente, es importante señalar que la información obtenida a partir de medidas de impedancia eléctrica se limita en su alcance: una vez que las células han invadido a la cámara inferior, los cambios en su fijación, la difusión, y la proliferación en la parte inferior de la membrana pueden contribuir a los cambios en rea de impedanciaabolladuras. Por lo tanto, esta metodología es más informativo cuando se utiliza junto con otros ensayos de viabilidad de esferoides de células, la adhesión, la migración, y la morfología con el fin de evaluar globalmente comportamientos celulares esferoides. Por ejemplo, a ser posible, con el fin de comprender plenamente las interacciones esferoides mesoteliales, co-culturas diferentes también deben ser reflejados periódicamente con microscopía de fase estándar, de modo que las evaluaciones cualitativas de la morfología esferoidal y la salud se pueden hacer de forma paralela a los ensayos de RTCA cuantitativos de invasión. Si se realiza la etapa de etiquetado facultativo, a continuación, el comportamiento de las células individuales del cáncer se pueden determinar con microscopía fluorescente, ya que desagregan del esferoide e interactúan con las células mesoteliales sin etiquetar. Un beneficio adicional de etiquetado con fluorescencia de las células cancerosas cuando se co-cultivo con un segundo tipo de célula es que entonces es posible confirmar que sólo las células cancerosas han invadido a través de las barreras celulares y de ECM. <p class="jove_content"&gt; En resumen, este método representa un alto rendimiento de análisis cuantitativo de la invasión esferoide cáncer de ovario de mesoteliales y ECM barreras. A través de la adición de citoquinas exógenas, factores de crecimiento, o inhibidores específicos a las cámaras superiores o inferiores de la placa de la CIM así, este método permite un rápido, la determinación de los factores que regulan las interacciones entre las células de cáncer de ovario esferoides que invaden a través de mesotelial y las barreras de la matriz sobre tiempo.

El cáncer de ovario tiene la tasa más alta de mortalidad de todos los cánceres ginecológicos 1. A nivel mundial, hay ~ 230 000 casos y más de 100.000 muertes debido a la enfermedad cada año 1. La mayoría de los pacientes (&gt; 75%) se diagnostican después de que el cáncer ya se ha extendido por metástasis, cuando el tratamiento se complica aún más por el aumento de la resistencia a la quimioterapia y el pronóstico es pobre 2. Los pacientes en estadio III-IV de la enfermedad metastásica tienen tasas de supervivencia a 5 años de sólo el 30-40% 3. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de una mejor comprensión de los comportamientos celulares que subyacen a la metástasis del cáncer de ovario con el fin de tratar eficazmente la enfermedad avanzada. El modelo actual de la metástasis del cáncer de ovario propone varios pasos en el proceso metastásico, cada uno de los cuales se produce en un microambiente distinto que los impactos en el comportamiento del tumor. Metástasis de células de cáncer de ovario inicialmente se desprenden de la localización del tumor primario y sobreviven en una no adherenciaEstado ENT dentro del fluido peritoneal como células individuales o estructuras multicelulares en tres dimensiones, denominado agregados o esferoides multicelulares 2,4,5. Las células que no forman esferoides en suspensión son más susceptibles a la anoikis 2,4,5. Esferoides también exhiben resistencia a la quimioterapia aumentó, lo que contribuye a la enfermedad residual y posterior recurrencia del cáncer 2,4,5. Un segundo paso crítico en la metástasis del cáncer de ovario es la transición de los agregados de grupos de libre flotación de tumores secundarios establecidos dentro de la pared peritoneal y el omento 5,6. Las interacciones célula-célula y célula-sustrato se han implicado en la formación de agregados, la supervivencia, y la adhesión a la matriz extracelular (ECM) producida por el revestimiento mesotelial del peritoneo 4-11. Como, sin embargo, estos procesos son poco conocidos. Para definir los mecanismos implicados en la diseminación de los cánceres de ovario, esferoides pueden ser generATED a partir de líneas celulares de cáncer establecidas utilizando métodos de cultivo no adherentes, el mantenimiento de las células en suspensión ya sea mediante la adición de metilcelulosa a los medios de cultivo de 12,13 o mediante el cultivo de células en placas de baja fijación 2,14. Cuando cultivadas de esta manera, las células de cáncer de ovario se ensamblan para formar agregados multicelulares o esferoides que presentan propiedades celulares, moleculares, y bioquímicas similares a las de los agregados tumorales encontrado in vivo 2,14. Después de la formación, esferoides pueden ser posteriormente cosechadas a partir del medio no adherentes y se volvieron a sembrar en una variedad de superficies sólidas para más estudios funcionales. Esto representa un avance sobre ensayos en cultivo en monocapa, que no modelar con precisión el comportamiento de células en metástasis de cáncer de ovario en un entorno no adherente tal como el líquido intraperitoneal. La capacidad invasiva de esferoides de cáncer puede ser evaluado en ensayos de punto final tradicional en Boyden cámaras 2 </sup&gt;, pero este enfoque puede ser engañoso, ya que la invasión de células de cáncer de ovario es un proceso dinámico en el tiempo. Un método reciente en tiempo real se ha elaborado utilizando time-lapse microscopía de vídeo del aclaramiento de células mesoteliales invadiendo esferoides con cáncer de ovario 15,16; Sin embargo, el análisis de los datos lapso de tiempo es mucho tiempo y puede ser subjetiva. En la presente memoria, se describe un método rápido, cuantitativo para la evaluación de los comportamientos invasivos de esferoides de cáncer de ovario en tiempo real. En primer lugar, se estableció un modelo de célula-esferoide mesotelial que representa la etapa de la metástasis del cáncer de ovario cuando esferoides multicelulares se unen a e invaden el revestimiento peritoneal para formar tumores secundarios. Entonces metodología para un analizador en tiempo real de la célula (RTCA; ver la tabla Materiales para detalles de la empresa) fue adaptado para llevar a cabo mediciones en tiempo real para la cuantificación de la capacidad invasiva de diferentes líneas celulares de cáncer de ovario cultivadas como esferoides y probados en este modelo. En la RTCA eninstrumento, las respuestas celulares se monitorizan continuamente en el transcurso de un ensayo, sin la necesidad de etiquetas exógenas, mediante la medición de cambios en la impedancia eléctrica. Placas de cultivo especialmente diseñados tienen microelectrodos de oro recubiertas situadas debajo de una membrana microporosa en la interfaz entre las cámaras superior e inferior de un 2 septadas bien (placas &#39;CIM). La ubicación de los electrodos en la cámara inferior permite la medición de cambios en la impedancia eléctrica como células invaden a través de un ECM o ECM barrera / celular. La interfaz de membrana entre las 2 cámaras de cada placa de CIM está recubierto en primer lugar con el componente de ECM de interés. En el sistema modelo de la célula mesotelial-esferoide, la interfaz está recubierta con una capa de Matrigel (ver la tabla Materiales para detalles de la empresa), para imitar el complejo ECM subyacente el revestimiento mesotelial del peritoneo, seguido de una monocapa confluente de mesotelial humana &#39; células diana &#39;. Por último, preformadas esferoides de cáncer de ovario son added. Esferoidal células del cáncer de ovario deben invadir activamente a través de la capa de células diana y la matriz para llegar a la cámara inferior y alterar las lecturas de impedancia eléctrica. Las células diana en su propia también son evaluados para asegurarse de que no invaden a través de la capa de matriz y son adecuados para uso en este ensayo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="734">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">xCELLigence RTCA DP Analyser</td>
			<td style="width:291px;">ACEA biosciences</td>
			<td style="width:87px;">RTCA DP</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">xCELLigence CIM plates&#160;</td>
			<td>ACEA biosciences</td>
			<td>5665817001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell TraceTM CFSE&#160;</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C34554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylcellulose (4000 centipose)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:293px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td>11966-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Medium 199&#160;</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:87px;">11150067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:293px;">Ham&#39;s F-12 Nutrient mix</td>
			<td>Life Technologies&#160;</td>
			<td style="width:87px;">11765062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Epidermal Growth Factor (EGF)</td>
			<td>PeproTech&#160;</td>
			<td>100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrocortisone&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin EDTA</td>
			<td style="width:291px;">Gibco-Invitrogen</td>
			<td style="width:87px;">15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96-well concave culture plate&#160;</td>
			<td>Grenier Bio-One</td>
			<td>650185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LP9 Human mesothelial cell line</td>
			<td>Coriell Institute for Medical Research&#160;</td>
			<td>AG07086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Growth Factor-reduced Matrigel matrix</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>354230</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of ovarian cancer spheroid attachment and invasion of mesothelial cells in real time

Los cánceres ováricos metastatizan al derramar en el líquido peritoneal y dispersando a sitios distantes dentro del peritoneo. Los cultivos monocapa no modelar con precisión el comportamiento de las células cancerosas dentro de un entorno no adherente, como las células cancerosas inherentemente agregan en estructuras multicelulares que contribuyen al proceso metastásico al unirse a y la invasión de la membrana peritoneal para formar tumores secundarios. Para modelar esta importante etapa de la metástasis del cáncer ovárico, agregados multicelulares, o esferoides, se pueden generar a partir de líneas celulares de cáncer de ovario establecidos mantenidos en condiciones no adherentes. Para imitar el microambiente peritoneal encontrado por las células tumorales in vivo, se estableció un modelo de co-cultivo-esferoide mesotelial en el que preformados esferoides se siembran en placa en la parte superior de una monocapa de células mesoteliales humano, formada a través de una barrera de matriz extracelular. Se desarrollaron métodos a continuación, utilizando un analizador de células en tiempo real para llevar a cabo real cuantitativamediciones de tiempo de la capacidad invasiva de diferentes líneas celulares de cáncer de ovario cultivadas como esferoides. Este enfoque permite la medición continua de la invasión durante largos períodos de tiempo, lo cual tiene varias ventajas sobre los ensayos de punto final tradicionales y análisis de imagen de microscopía de tiempo real más laborioso. En resumen, este método permite una rápida, la determinación de los factores que regulan las interacciones entre las células de cáncer de ovario esferoides mesoteliales invasores a través de la matriz y las barreras en el tiempo.

Esferoides de cáncer de ovario puede ser generado a partir de muchos tipos de líneas celulares mediante el cultivo en suspensión o por la recolección de células tumorales primarias de la ascitis maligna 2,14. Aquí dos líneas celulares de cáncer de ovario epitelial, OVCA433 y OVCA429, y una línea de tumor de células de la granulosa del ovario, KGN, se han utilizado para generar esferoides (Figura 1A). En este método, las células son cultivadas en pozos de fondo en U mientras que está suspendido en los medios de comunicación que se ha hecho viscoso por la adición de metilcelulosa. En estas condiciones, muchas células de cáncer de ovario presentan una capacidad inherente a agregarse para formar esferoides 13. Tras el cultivo durante la noche en suspensión en metilcelulosa / medios de comunicación, todas las tres líneas celulares forman estructuras compactas esferoide de aproximadamente 400-500 m de diámetro (Figura 1A). Mientras tanto, se prepara la placa de RTCA CIM, en primer lugar, mediante el recubrimiento de la interfase de la membrana porosa con la matriz y luego una monocapa confluente de mes humanoscélulas othelial (Figura 1B). Una vez formados, los esferoides se transfieren luego a la placa de CIM preparado. Esferoides cáncer cosechadas se siembran en placa en la parte superior de la monocapa LP9 y evaluaron como se describe a continuación. Imágenes bajo microscopía de fase estándar (o bajo microscopía fluorescente, si se siguió el paso marcado de células opcional) de cultivos paralelos se toman periódicamente para ayudar en la interpretación de los datos RTCA (Figura 1C). Es informativo para evaluar tanto el nivel basal de la invasión de una línea celular de cáncer, así como la invasión inducida quimioatrayente-. Típicamente, la invasividad basal se mide por la adición de SFM a ambas las cámaras superior e inferior. Medio completo (10% de FBS), que contiene muchos factores quimiotácticos potenciales, se utiliza en el ejemplo actual para examinar invasión &#39;inducida quimioatrayente-&#39; (Figura 2). Estudios paralelos de células mesoteliales LP9 solos confirmaron que estas células son mínimamente eninvasiva más de 2 días bajo sea basal o &#39;quimioatrayente&#39; condiciones inducidas y por lo tanto eran un buen tipo de células para su uso en ensayos de co-cultivo con células de cáncer de ovario (Figuras 2A y 2B). En contraste, esferoides de cáncer de ovario generados usando cualquiera de las tres líneas celulares exhibieron la capacidad de invadir hacia un quimioatrayente (FBS) (Figuras 2A-2C). La principal ventaja de la utilización de los instrumentos en tiempo real RTCA sobre ensayos de punto final tradicionales es que los cambios en el comportamiento celular / esferoide se pueden cuantificar con el tiempo. Durante el ensayo de 2 días, el KGN, OVCA429 y líneas celulares OVCA433 todos mostraron la capacidad de invadir a un quimioatrayente (indicado mediante el aumento de los índices de glóbulos), pero los bajos niveles basales de la invasión (Figura 2 C). Las líneas celulares mostraron tasas similares de invasión, tal como se indica por las pistas paralelas de las curvas (Figura 2C); Sin embargo, la curva de OVCA429 exhibió una asíntota superior más alta,lo que indica un nivel máximo más alto de invasión en comparación con las otras líneas celulares. Además, las líneas celulares mostraron una diferencia en sus tiempos de inicio de la invasión, con las células KGN invadir rápidamente las barreras celulares y de la matriz y la OVCA433 y OVCA429 células que tienen 3 a 5 veces más largo para invadir, respectivamente (Figura 2D). Es importante destacar que, sus comportamientos en el inicio de la invasión no eran predictivos de su capacidad general para la invasión (Figuras 2C y 2D). Esto sugiere diferentes capacidades inherentes de las líneas celulares de cáncer, pero también puede indicar que diferentes factores pueden regular los comportamientos invasivos tempranos y tardíos de esferoides. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51655/51655fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 generación esferoide y el modelo de juego experimental A:.. Imagos bajo un microscopio de contraste de fase de esferoides se forman en metilcelulosa / media (arriba) y de la línea celular correspondiente crecido como una monocapa (abajo) B:. Esquema que muestra el RTCA 2 recámara placa CIM bien establecido, en el que pre-formado el cáncer de ovario esferoides se colocan en la parte superior de una monocapa de una capa mesotelial barrera LP9 / matriz en la cámara superior y media ± FBS como quimioatrayente se añade a la cámara inferior. Los electrodos debajo de la interfaz de la medida 2 cámaras incrementando la impedancia eléctrica como más células invaden a través de las barreras a la cámara inferior C:. Imágenes de esferoides KGN en la parte superior de la monocapa LP9 bajo microscopía de contraste de fase (izquierda) o la microscopía de fluorescencia (derecha). Las barras de escala = 100 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51655/51655fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> .. Figura 2 los datos de invasión esferoide cáncer de ovario en tiempo real A - B: Los resultados representativos de un ensayo de invasión RTCA llevado a cabo con y sin FBS en la cámara inferior de una placa de CIM bien. La invasión de células KGN se compara con las células mesoteliales LP9. Los resultados se muestran como media ± SD Índice de Células de tres pozos en el punto de tiempo de 24 horas (A) y durante un período de ensayo de dos días todo (B) C - D:. Una comparación de la capacidad invasiva de KGN, OVCA429 y célula OVCA433 líneas representadas en un período de 24 horas (C) y de manera más detallada en un período de tiempo de 2,5 h (d).

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Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

La invasión de células de cáncer de ovario en el revestimiento mesotelial del peritoneo es un proceso dinámico en el tiempo. Utilizando un analizador de tiempo real, la capacidad invasiva de las células de cáncer de ovario en un modelo de esferoide mesotelial co-cultivo de células puede ser cuantificado durante períodos de tiempo prolongados, y proporciona información sobre los factores que regulan el proceso metastásico.

Evaluación de Cáncer de Ovario esferoide El apego y la invasión de células mesoteliales en Tiempo real

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

assessment-ovarian-cancer-spheroid-attachment-invasion-mesothelial

Research

JoVE Journal

Medicine

17.3K vistas.  MIMR-PHI Institute of Medical Research.  La invasión de células de cáncer de ovario en el revestimiento mesotelial del peritoneo es un proceso dinámico en el tiempo. Utilizando un analizador de tiempo real, la capacidad invasiva de las células de cáncer de ovario en un modelo de esferoide mesotelial co-cultivo de células puede ser cuantificado durante períodos de tiempo prolongados, y proporciona información sobre los factores que regulan el proceso metastásico. 

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A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of endothelial junctions and finally invasion and migration of tumor cells through the endothelial layer to enter the bloodstream as a means of transport to distant sites in the host1-3. Once in the circulatory system, cancer cells adhere to capillary walls and extravasate to the surrounding tissue to form metastatic tumors4,5. The various components of tumor cell-endothelial cell interaction can be replicated in vitro by challenging a monolayer of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) with cancer cells. Studies performed with electron and phase-contrast microscopy suggest that the in vitro sequence of events fairly represent the in vivo metastatic process6. Here, we describe an electrical-impedance based technique that monitors and quantifies in real-time the invasion of endothelial cells by malignant tumor cells.
Giaever and Keese first described a technique for measuring fluctuations in impedance when a population of cells grow on the surface of electrodes7,8. The xCELLigence instrument, manufactured by Roche, utilizes a similar technique to measure changes in electrical impedance as cells attach and spread in a culture dish covered with a gold microelectrode array that covers approximately 80% of the area on the bottom of a well. As cells attach and spread on the electrode surface, it leads to an increase in electrical impedance9-12. The impedance is displayed as a dimensionless parameter termed cell-index, which is directly proportional to the total area of tissue-culture well that is covered by cells. Hence, the cell-index can be used to monitor cell adhesion, spreading, morphology and cell density.
The invasion assay described in this article is based on changes in electrical impedance at the electrode/cell interphase, as a population of malignant cells invade through a HUVEC monolayer (Figure 1). The disruption of endothelial junctions, retraction of endothelial monolayer and replacement by tumor cells lead to large changes in impedance. These changes directly correlate with the invasive capacity of tumor cells, i.e., invasion by highly aggressive cells lead to large changes in cell impedance and vice versa. This technique provides a two-fold advantage over existing methods of measuring invasion, such as boyden chamber and matrigel assays: 1) the endothelial cell-tumor cell interaction more closely mimics the in vivo process, and 2) the data is obtained in real-time and is more easily quantifiable, as opposed to end-point analysis for other methods.

This article describes an in vitro technique for monitoring cancer cells invading through a monolayer of endothelial cells. The data is acquired in real-time as a function of changes in impedance on the surface of electrodes at the well bottom.

A tiempo real Técnica de Impedancia Eléctrica base para medir la invasión de monocapa de células endoteliales de las células cancerosas

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of ...

Investigación

Medicina

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Evaluación de la absorción de nanopartículas en los tumores en tiempo real utilizando intravital imagen

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotón imágenes de invasión de células tumorales en un modelo de ratón ortotópico de carcinoma oral de células escamosas

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

Spheroid Assay to Measure TGF-&amp;#946;-induced Invasion

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

Ensayo esferoide para medir TGF-β inducida por invasión

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

Ensayo in vitro Liquidación mesoteliales que modela los pasos iniciales de la metástasis del cáncer ovárico

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

Líquido cefalorraquídeo MicroRNA perfiles utilizando cuantitativa en tiempo real PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

Método para la obtención de las células del cáncer de ovario primarios a partir de muestras sólidas

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

El enriquecimiento de las células madre quimiorresistente cáncer ovárico de líneas celulares humanas

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

En Enriquecimiento vitro de células iniciadoras del tumor del cáncer de ovario

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Tumor Ensayo tridimensional (3D) esferoide Invasion

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...