Los autores desean agradecer el Centro de Molecular y Genómica de imagen en la UC Davis y el Departamento de Imagen Biomédica de Genentech. Esta labor fue apoyada por los Institutos Nacionales de la subvención número Asociación de Investigación de Bioingeniería de Salud R01 EB00993.

Todo el manejo y procedimientos de los animales descritos en este documento, y de acuerdo a la Investigación Animal: Reporte experimentos in vivo (llegar) directrices, se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos aprobados por la Asociación para la Evaluación de Acreditación de Laboratorio Animal Care (AAALAC) Internacional acreditado Institucional Cuidado de Animales y el empleo Comisión de la Universidad de California, Davis. Cirugía apropiada no debe dar lugar a signos de dolor o malestar en el animal, pero las medidas adecuadas se deben tomar si se observan estos síntomas, incluyendo la administración de analgésicos o en algunos casos, la eutanasia. El lado derecho de los animales fue elegido arbitrariamente por el procedimiento unilateral descrito. 1. Unilateral arteria carótida común (CCA) Ligadura <ol><li> Preparar campo estéril con herramientas quirúrgicas esterilizadas y materiales colocados convenientemente. Asegurar almohadilla térmica se calienta a 37 ° C, con sonda de temperatura colocado de forma segura en la almohadilla. &amp; #160; Asegúrese de usar un paño estéril para cubrir el lugar de la cirugía. </li><li> Anestesiar animales (isoflurano, 1.3% en aire a 0,5-1 L / min), y coloque animal en posición supina con la cola de espaldas. Compruebe anestesia apretando el dedo del pie - esto debería provocar ninguna reacción si el animal está anestesiado correctamente. Aplicar pomada oftálmica para los ojos. </li><li> Aplicar crema de depilación a parte inferior del cuello a la zona superior del pecho de 1-2 hisopos de algodón. Espere 03.01 min y, a continuación, eliminar el vello y la crema usando gasa o alcohol hisopos húmedos. Área de Swab incisión con Betadine en forma circular de dentro a fuera, y luego cambiar en guantes quirúrgicos estériles. </li><li> Con unas tijeras quirúrgicas, hacer una incisión de aproximadamente 1 cm a lo largo de la línea media de la parte inferior del cuello. Separe con cuidado la piel externa de la fascia que rodea el uso de tijeras quirúrgicas. </li><li> El uso de dos McPherson fórceps iris micro de sutura, separar la arteria carótida común derecha desde fascia, teniendo cuidado de evitar dañar las venas o disturBing el nervio vago. </li><li> Usando las pinzas de la derecha, exteriorizar el CCA derecha en una posición estable. Aplique varias gotas de solución salina para prevenir el secado. Pasar una longitud adecuada (2-3 cm) de 6-0 sutura de seda por debajo de la CCA derecha y ligar con un nudo doble cuadrado. Opcionalmente, ligar de nuevo utilizando una segunda longitud de sutura de seda 6-0. </li><li> Vuelva a colocar la derecha CCA y limpiar el exceso de líquido de la apertura con una esponja estéril con punta de algodón. Cierre la incisión con sutura de seda 6-0. Aplicar la lidocaína por vía tópica hasta 7 mg / kg. </li><li> Deje que el animal se recupere de la anestesia hasta ambulatoria (aproximadamente 30 min) y realizar el monitoreo post-quirúrgica, hasta los animales está listo para la imagen. </li></ol> 2. Preparación para la proyección de imagen: Verificaciones del sistema y hardware <ol><li> Configurar el hardware y el software para los sistemas de RM y PET y comprobar su funcionalidad como sigue. Asegúrese de que todas las conexiones físicas son seguras y configuración del software se seleccionan adecuadamente. <ol><li&gt; Asegúrese de que el sistema de PET está a la temperatura de funcionamiento prescrita de 5 ° C utilizando el sistema de refrigeración por aire. </li><li> Sistema de montaje de PET en el interior del agujero de resonancia magnética, la alineación del campo de visión (FOV) centros que utilizan desplazamientos axiales conocidos PET y la RM. Montar la bobina de MRI en el interior del orificio del sistema de PET y el centro de la bobina con el sistema PET y centros de imán de MRI. </li><li> A su vez en la electrónica de PET para el poder y la tensión de polarización (Nota: los pasos variarán por instrumento). Realizar un análisis rápido (5 min) usando un cilindro de 68 Ge y comprobar el sinograma resultante para asegurar que todos los detectores están en funcionamiento. </li><li> Opcionalmente adquirir datos que se utilizarán para una matriz de transformación de PET / RM para fines del co-registro: Llenar un fantasma en tres dimensiones (por ejemplo, tres esferas rellenas) con 200 Ci de 18 solución acuosa F y adquirir durante 15 minutos con PET. Adquirir anatómica datos de resonancia magnética: en la ventana de Scan Control, seleccione la multicorte secuencia multi-eco (MIPYME) (véase el cuadro 1 </strong&gt;). Repita el procedimiento para las tres orientaciones principales: axial, sagital y coronal. </li></ol></li><li> Compruebe los ajustes de la bomba de infusión y operación. Ajuste la bomba al 4,44 l por minuto, que a 45 minutos de infusión constante entrega un volumen total de 200 l, el límite recomendado típico para la inyección intravenosa en un 20 g animal. </li><li> Compruebe el funcionamiento del calentador y confirme que la salida de temperatura es suficiente para mantener el calentamiento de los animales (37 ° C). Compruebe que la temperatura y la monitorización respiratoria es operativa en la preparación para la colocación de los animales en la cama animal. </li><li> Compruebe el funcionamiento de los O 2 y N 2 caudalímetros (para 0,5 L / min: O 2 a 57,2 mg / min y N2 a 0,575 g / min) por encender ambos con la fuente de aire comprimido fuera y O 2 y N 2 fuentes sucesivamente. Para evitar el riesgo de dañar los medidores de flujo, no encenderlos sin la suficiente presión de entrada. </li><li> Asegúrese de que el isoflurano vaporizer está suficientemente llena. Antes de la formación de imágenes, iniciar el flujo de la anestesia con isoflurano al 1-2% y de 0,5 a 1 L / min. </li><li> Preparar la cama de animales, garantizando que los de anestesia, almohadilla respiratoria y sistemas calentadores están colocados de forma segura y funcional. Para PET / MRI exactitud adicional co-registro, marcadores de referencia (por ejemplo, tubos capilares llenos de radiotrazador a una concentración similar a la inyecta para formación de imágenes) se pueden unir a la cama de los animales dentro del campo de visión. </li></ol> Flujo de trabajo 3. Imaging Después de todas las revisiones de los equipos necesarios se hayan completado, proceder a la imagen de la siguiente manera: <ol><li> Anestesiar al animal con isoflurano y insertar catéter de la vena de la cola (28 G aguja, PE-10 tubos de menos de 5 cm) rellena con solución salina heparinizada (0,5 ml de heparina, 1000 USP / ml, en 10 ml de solución salina). Calentando el animal y / o la cola puede mejorar la precisión del catéter de inserción. Opcionalmente colocar una gota de adhesivo de cianoacrilato en el sitio de la inserciónpara asegurar la línea IV. </li><li> Traslado al animal a la cama preparados para animales. Asegúrese de que la cabeza del animal es seguro, con incisivos superiores garantizados por el bar y oído bares de dientes en su lugar si se está utilizando. </li><li> Aplicar pomada oftálmica para los ojos para evitar que se seque. Inserte el termómetro sonda rectal. Asegúrese de que la temperatura y las lecturas de respiración son funcionales. </li><li> Extraer la dosis radiotrazador (alrededor de 600 Ci en 200 l) para ser inyectada en heparinizada PE-10 tubo de longitud apropiada - de aproximadamente 3 m para PE-10 tubos y un volumen de 200 l. Conecte un extremo de este tubo a la jeringa de la bomba de infusión, y el otro a la línea de catéter de vena de la cola, con cuidado de no crear perforaciones en el tubo. </li><li> Deslizar la cama de los animales hacia delante en el orificio del imán, asegurándose de no perturbar el posicionamiento de la bobina de resonancia magnética y las líneas o cables, especialmente el tubo de la anestesia. Asegúrese de que el centro del cerebro está alineado con los centros de la MBobina de RI, sistema PET y la RM imán. </li><li> Realizar la sintonización y la congruencia de la bobina de MRI mediante la rotación de los botones de ajuste en la bobina, lo que minimiza la impedancia (verifique las especificaciones de bobina) y frecuencia (300 MHz durante 1 hora a 7 Tesla) desajustes mediante la observación de la pantalla del preamplificador de alta potencia. </li><li> (RM) Después de ajuste y adaptación, adquirir una imagen del explorador: seleccione una secuencia TriPilot RARO y ejecutar la secuencia de la ventana de Control Scan. Compruebe posicionamiento del animal, pasos 3.5 y 3.6 según sea necesario repetir. Restablecer cuñas de valor cero. </li><li> (RM) Adquirir una exploración localizada punto de resolverse la espectroscopia (PRENSA) en un volumen en el cerebro: Ejecutar una secuencia PRESS (ver Tabla 1) en un volumen rectangular con unas dimensiones de 3,9 mm x 6 mm x 9 mm. Compruebe el ancho de línea de agua utilizando el comando de macro CalcLineWidth. Si la anchura total a la mitad del máximo (FWHM) valor es aceptable (por ejemplo, 0,2 ppm), continúe con el paso 3.10. Si no es así, vaya al paso 3.9. </li><li> (RM) Adquirir un mapa de campo: Ejecutar una secuencia FieldMap (ver Tabla 1). Utilice los datos resultantes de una proyección cuña de múltiples ángulos (MAPSHIM) mediante la ejecución del comando de macro MAPSHIM y seleccionando lineales y de segundo orden (z 2) ajustes locales. Repita el paso 3.8. </li><li> (RM) Coloque el plan de la rebanada para la exploración DWI (ver Tabla 1): mediante el Editor de Geometría, asegúrese de que la adquisición FOV está en condiciones de adquirir el volumen deseado de interés dentro del cerebro. Si el plan rebanada resultante esté alineada lo deseas, copiar este plan rebanada en la ventana Scan Control para todos los análisis posteriores de DWI. Comience adquisición. </li><li> (PET) Con la adquisición PET preparado y listo para comenzar, iniciar la bomba de infusión. Después del retardo de pre-determinado en el que se ha inyectado solución salina desde el catéter, comenzar la adquisición PET (véase la Tabla 1) con el fin de capturar la entrada de radiotrazador. Vigilar la tasa de recuento y buscarse un aumento gradualen el recuento de indicativos de una inyección de éxito. </li><li> Después de 10-15 minutos, iniciar el concurrente simulación hipóxica con el paso 3.12. Para iniciar la simulación hipóxica, apague el flujo de aire médica y de inmediato el poder sobre el O 2 y N 2 caudalímetros con los ajustes predeterminados para entregar 8% de oxígeno y 92% de nitrógeno, y reducir isoflurano al 0,8%. No encienda caudalímetros sin la presión de entrada. </li><li> (MRI) Al mismo tiempo que en la etapa 3.12, comience adquisición DWI preparado en la etapa 3.10 (escanear &quot;H1&quot;). </li><li> (RM) Comience adquisición DWI (scan &quot;H2&quot;), preparado en el paso 3.10, inmediatamente después de la exploración H1 se ha completado. Terminar simulación hipóxica apagando caudalímetros, restaurando el flujo de aire medicinal, y volviendo la concentración de isoflurano a un valor adecuado basado en el monitoreo fisiológico. </li><li> (RM) Adquirir un DWI post-hipoxia scan preparado en el paso 3.10. Apague la bomba de infusión después de esta exploración se ha completado. </li><li> (RM) anat Adquiririmágenes omical en la axial y sagital. En la ventana de Control Scan - seleccionar la secuencia MIPYME (ver Tabla 1). Uso del editor de la geometría, asegúrese de que la adquisición FOV cubre el cerebro. </li><li> Retire animal, volver a la jaula cuando ambulatoria y vigilar los signos de morbilidad, la eutanasia si es necesario con la administración de CO 2 seguido por dislocación cervical como método secundario. </li></ol>

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JM y SW son empleados de Genentech.

RM anatómica simultánea y dinámica [18 F] FDG PET datos DWI-RM y se adquirieron con éxito de los animales de experimentación durante la simulación hipóxica después de la ligadura de la arteria carótida común. Esto representa un poderoso paradigma experimental para formación de imágenes multimodal de la fisiopatología de rápida evolución asociado con lesiones isquémicas en el cerebro y fácilmente podría extenderse a estudiar otros radiotrazadores de PET (por ejemplo, marcadores de la neuroinf...

A nivel mundial, el accidente cerebrovascular es la segunda causa de muerte y una causa importante de discapacidad 1. La cascada de acontecimientos bioquímicos y fisiológicos que se producen durante y después de un evento agudo accidente cerebrovascular se produce rápidamente y con implicaciones para la viabilidad del tejido y en última instancia resultado 2. Cerebral por hipoxia-isquemia (HI), que conduce a la encefalopatía hipóxico-isquémica (EHI), se estima que afecta hasta el 0,3% y el 4% de los a término y prematuros nacidos, respectivamente 3,4. La tasa de mortalidad en recién nacidos con EHI es de aproximadamente 15% a 20%. En el 25% de los sobrevivientes de HIE, complicaciones permanentes surgen como consecuencia de la lesión, incluyendo retraso mental, déficit motor, parálisis cerebral y epilepsia 3,4. Intervenciones terapéuticas anteriores no han demostrado ser dignos de adopción como estándar de atención, y el consenso aún no se ha llegado a que los métodos más avanzados, basados ​​en la hipotermia, están reduciendo efectivamente la morbilidad 3,5. Otras cuestiones of contención incluyen el método de administración de la hipotermia y paciente selección 6. Por lo tanto, las estrategias de neuroprotección y neurorestoration siguen siendo un área fértil para la investigación 7. Modelos de rata de HI cerebral han estado disponibles desde la década de 1960, y posteriormente se adaptaron a los ratones 8,9. Debido a la naturaleza del modelo y la ubicación de la ligadura, hay variabilidad inherente en el resultado debido a la diferencia en el flujo colateral entre los animales 10. Como resultado, estos modelos tienden a ser más variable en comparación con modelos similares, tales como oclusión de la arteria cerebral media (MCAO). Medición en tiempo real de los cambios fisiológicos se ha demostrado con la flujometría láser Doppler, así como de difusión ponderada MRI 11. La variabilidad intra-animal que se observó en el flujo sanguíneo cerebral durante e inmediatamente después de la hipoxia, así como en los resultados agudos tales como el volumen del infarto y neurológicodéficit, sugieren que la adquisición simultánea y correlación de datos multimodales sería beneficioso. Los recientes avances en la tomografía por emisión de positrones simultánea (PET) y la resonancia magnética (MRI) han permitido nuevas posibilidades en la formación de imágenes preclínica 12-14. Las ventajas potenciales de estos sistemas híbridos, combinados para aplicaciones preclínicos se han descrito en la literatura 15,16. Mientras que muchas preguntas preclínicos pueden ser abordadas por imágenes de un secuencialmente animal individual o por imágenes de grupos de animales separados, ciertas situaciones - por ejemplo, cuando cada instancia de un evento como el derrame cerebral se manifiesta de forma única, con la rápida evolución fisiopatología - que sea conveniente e incluso necesario utilizar la medición simultánea. La neuroimagen funcional proporciona un ejemplo de ello, donde simultánea 2-desoxi-2- (18 F) fluoro-ᴅ-glucosa ([18 F] FDG) PET y Blood-nivel de oxígeno dependiente (BOLD) RM ha demostrado recientemente en la estimulación bigote rata estudia 14. Aquí, demostramos simultánea PET / RM de imagen durante el inicio de un derrame cerebral hipóxico-isquémica en la que la fisiología del cerebro no está en estado de equilibrio, pero en cambio, es rápida e irreversiblemente cambiando durante la simulación hipóxica. Los cambios en la difusión del agua, medida por resonancia magnética y cuantificados por el coeficiente de difusión aparente (ADC) derivado de imágenes de difusión ponderada (DWI), ha sido bien caracterizado para el accidente cerebrovascular en los datos clínicos y preclínicos 17,18. En modelos animales, tales como MCAO, la difusión de agua en el tejido cerebral afectado cae rápidamente debido a la cascada de la bioenergética que conduce a edema citotóxico 18. Estos cambios agudos en el ADC se observan también en modelos de roedores de isquemia cerebral por hipoxia 11,19. [18 F] FDG PET se ha utilizado en pacientes con ictus para evaluar los cambios en gl localesmetabolismo ucose 20, y un pequeño número de estudios in vivo en animales también han utilizado [18 F] FDG 21, incluido en el modelo de hipoxia-isquemia cerebral 22. En general, estos estudios muestran una disminución de la utilización de glucosa en las regiones isquémicas, aunque un estudio usando un modelo con reperfusión encontró ninguna correlación de estos cambios metabólicos con el desarrollo de miocardio posterior 23. Esto está en contraste a los cambios de difusión que se han asociado con el núcleo dañado irreversiblemente 21. Por lo tanto, es importante ser capaz de obtener la información complementaria derivada de [18 F] FDG PET y DWI de manera simultánea durante la evolución del accidente cerebrovascular, ya que es probable que el rendimiento información significativa acerca de la progresión de la lesión y el impacto de intervenciones terapéuticas. El método que describimos aquí es fácilmente susceptible de usar con una variedad de trazadores de PET y secuencias de RM. Por ejemplo, [15 O] H 2 O PETimágenes, junto con DWI y las imágenes de perfusión ponderada (PWI) de la RM puede ser utilizado para explorar aún más el desarrollo de la penumbra isquémica y validar las técnicas actuales en el campo de la imagen derrame cerebral.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Surgery</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman mosquito forceps</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>7-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x McPherson suturing forceps, 8.5 cm</td>
			<td>Accurate Surgical &#38; Scientific Instruments</td>
			<td>4473</td>
			<td>It is useful to reduce the opening width with a band on the forceps used to hold the carotid artery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-0 silicone coated braided silk suture with 3/8 C-1 needle</td>
			<td>Covidien Sofsilk</td>
			<td>S-1172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homeothermic blanket system</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>507220F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super glue</td>
			<td>(Generic)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hypoxia</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowmeter for O2</td>
			<td>Alicat Scientific</td>
			<td>MC-500SCCM-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flometer for N2</td>
			<td>Alicat Scientific</td>
			<td>MC-5SLPM-D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 meter</td>
			<td>MSA</td>
			<td>Altair Pro</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.05 Tesla MRI System</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>BioSpec</td>
			<td>20 cm inner bore diameter with gradient set. Paravision 5.1 software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volume Tx/Rx 1H Coil, 35mm ID</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>T8100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PET system</td>
			<td>(In-house)</td>
			<td></td>
			<td>4x24 LSO-PSAPD detectors, 
			10x10 LSO array per detector, 
			1.2mm crystal pitch and 14mm depth. 14 x 14 mm PSAPD. FOV: 60x35mm. 350-650 keV energy window. 16 ns timing window.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vessel cannulation Dumont forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-4991</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-10 polyethylene tubing</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion pump</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>BS-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal monitoring &#38; gating equipment</td>
			<td>Small Animal Instruments Inc.</td>
			<td>Model 1025</td>
			<td>Only respiration monitoring used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal bed with temperature regulation</td>
			<td>(In-house)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous pet/mri imaging during mouse cerebral hypoxia-ischemia

Los cambios dinámicos en la difusión del agua tisular y metabolismo de la glucosa se producen durante y después de la hipoxia cerebral en la hipoxia-isquemia reflejando una perturbación bioenergética en las células afectadas. La resonancia magnética ponderada en difusión (RM) identifica las regiones que están dañados, potencialmente irreversible, por la hipoxia-isquemia. Las alteraciones en la utilización de glucosa en el tejido afectado pueden ser detectables mediante tomografía de emisión de positrones (TEP) de 2-desoxi-2- (18 F) fluoro-ᴅ-glucosa ([18 F] FDG) captación. Debido a la naturaleza rápida y variable de la lesión en este modelo animal, la adquisición de ambos modos de datos debe realizarse simultáneamente con el fin de correlacionar significativamente datos de PET y RM. Además, la variabilidad inter-animal en la lesión hipóxico-isquémica debido a las diferencias vasculares limita la capacidad de analizar los datos multimodales y observar cambios en un enfoque de grupo de sabios si los datos no se adquiere de forma simultánea en los sujetos individuales. El método presintieron aquí le permite a uno adquirir tanto difusión ponderada RM y [18 F] FDG captación de datos en el mismo animal antes, durante y después de la simulación hipóxica con el fin de interrogar a los cambios fisiológicos inmediatos.

La Figura 1 muestra el resultado de una ligadura apropiada de la arteria carótida común, antes de cerrar la herida con sutura de seda 6-0. En este método, los datos obtenidos a partir de imágenes es altamente dependiente de la disposición temporal del experimento, que a su vez dicta y también está dictada por limitaciones experimentales incluidos los sistemas de adquisición de imágenes y la configuración del equipo. Estas y otras consideraciones se exploran más en...

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Simultaneous PET/MRI Imaging During Mouse Cerebral Hypoxia-ischemia

El método presentado aquí utiliza simultánea tomografía por emisión de positrones y la resonancia magnética. En el modelo de hipoxia-isquemia cerebral, cambios dinámicos en el metabolismo de la glucosa y de difusión se producen durante y después de la lesión. El daño en evolución e irreproducible en este modelo requiere la adquisición simultánea si los datos de imágenes multimodales significativas son a adquirir.

Simultánea de imágenes PET / RM Durante cerebral del ratón hipoxia-isquemia

Dynamic changes in tissue water diffusion and glucose metabolism occur during and after hypoxia in cerebral hypoxia-ischemia reflecting a bioenergetics ...

simultaneous-petmri-imaging-during-mouse-cerebral-hypoxia-ischemia

Research

JoVE Journal

Medicine

12.2K vistas.  University of California, Davis.  El método presentado aquí utiliza simultánea tomografía por emisión de positrones y la resonancia magnética. En el modelo de hipoxia-isquemia cerebral, cambios dinámicos en el metabolismo de la glucosa y de difusión se producen durante y después de la lesión. El daño en evolución e irreproducible en este modelo requiere la adquisición simultánea si los datos de imágenes multimodales significativas son a adquirir. 

Video: Simultaneous PET/MRI Imaging During Mouse Cerebral Hypoxia-ischemia

Mouse Model of Middle Cerebral Artery Occlusion

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the brain (ischemic stroke) 2. Since most ischemic strokes (~80%) occur in the territory of middle cerebral artery (MCA) 3, many animal stroke models that have been developed have focused on this artery. The intraluminal monofilament model of middle cerebral artery occlusion (MCAO) involves the insertion of a surgical filament into the external carotid artery and threading it forward into the internal carotid artery (ICA) until the tip occludes the origin of the MCA, resulting in a cessation of blood flow and subsequent brain infarction in the MCA territory 4. The technique can be used to model permanent or transient occlusion 5. If the suture is removed after a certain interval (30 min, 1 h, or 2 h), reperfusion is achieved (transient MCAO); if the filament is left in place (24 h) the procedure is suitable as a model of permanent MCAO. This technique does not require craniectomy, a neurosurgical procedure to remove a portion of skull, which may affect intracranial pressure and temperature 6. It has become the most frequently used method to mimic permanent and transient focal cerebral ischemia in rats and mice 7,8. To evaluate the extent of cerebral infarction, we stain brain slices with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) to identify ischemic brain tissue 9. In this video, we demonstrate the MCAO method and the determination of infarct size by TTC staining.

We demonstrate in the video a method for producing a middle cerebral artery occlusion in adult mice using an intraluminal monofilament. We also show how to evaluate the extent of cerebral infarction by 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining.

Modelo de ratón de la oclusión arteria cerebral media

Stroke is the most common fatal neurological disease in the United States 1. The majority of strokes (88%) result from blockage of blood vessels in the ...

Investigación

Medicina

The Application Of Permanent Middle Cerebral Artery Ligation in the Mouse

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to develop suitable animal models to study the events that unfold during ischemic insult. These techniques include transient or permanent, focal or global ischemia models using many different animal models, with the most common being rodents.
The permanent MCA ligation method which is also referred as pMCAo in the literature is used extensively as a focal ischemia model in rodents 1-6. This method was originally described for rats by Tamura et al. in 1981 7. In this protocol a craniotomy was used to access the MCA and the proximal regions were occluded by electrocoagulation. The infarcts involve mostly cortical and sometimes striatal regions depending on the location of the occlusion. This technique is now well established and used in many laboratories 8-13. Early use of this technique led to the definition and description of &#x201C;infarct core&#x201D; and &#x201C;penumbra&#x201D; 14-16, and it is often used to evaluate potential neuroprotective compounds 10, 12, 13, 17. Although the initial studies were performed in rats, permanent MCA ligation has been used successfully in mice with slight modifications 18-20 .
This model yields reproducible infarcts and increased post-survival rates. Approximately 80% of the ischemic strokes in humans happen in the MCA area 21 and thus this is a very relevant model for stroke studies. Currently, there is a paucity of effective treatments available to stroke patients, and thus there is a need for good models to test potential pharmacological compounds and evaluate physiological outcomes. This method can also be used for studying intracellular hypoxia response mechanisms in vivo. 
Here, we present the MCA ligation surgery in a C57/BL6 mouse. We describe the pre-surgical preparation, MCA ligation surgery and 2,3,5 Triphenyltetrazolium chloride (TTC) staining for quantification of infarct volumes.

Middle cerebral artery (MCA) ligation is a technique to study focal cerebral ischemia in animal models. In this method, the middle cerebral artery is exposed by craniotomy and ligated by cauterization. This method gives highly reproducible infarct volumes and increased post-operative survival rates compared to other methods available.

La aplicación de la Permanente Ligadura arteria cerebral media en el ratón

Focal cerebral ischemia is among the most common type of stroke seen in patients. Due to the clinical significance there has been a prolonged effort to ...

Non-invasive Optical Measurement of Cerebral Metabolism and Hemodynamics in Infants

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can accurately screen for brain injury, monitor injury evolution, or assess response to therapy. The energy used by neurons is derived largely from tissue oxidative metabolism, and neural hyperactivity and cell death are reflected by corresponding changes in cerebral oxygen metabolism (CMRO2). Thus, measures of CMRO2 are reflective of neuronal viability and provide critical diagnostic information, making CMRO2 an ideal target for bedside measurement of brain health.
Brain-imaging techniques such as positron emission tomography (PET) and single-photon emission computed tomography (SPECT) yield measures of cerebral glucose and oxygen metabolism, but these techniques require the administration of radionucleotides, so they are used in only the most acute cases.
Continuous-wave near-infrared spectroscopy (CWNIRS) provides non-invasive and non-ionizing radiation measures of hemoglobin oxygen saturation (SO2) as a surrogate for cerebral oxygen consumption. However, SO2 is less than ideal as a surrogate for cerebral oxygen metabolism as it is influenced by both oxygen delivery and consumption. Furthermore, measurements of SO2 are not sensitive enough to detect brain injury hours after the insult 1,2, because oxygen consumption and delivery reach equilibrium after acute transients 3. We investigated the possibility of using more sophisticated NIRS optical methods to quantify cerebral oxygen metabolism at the bedside in healthy and brain-injured newborns. More specifically, we combined the frequency-domain NIRS (FDNIRS) measure of SO2 with the diffuse correlation spectroscopy (DCS) measure of blood flow index (CBFi) to yield an index of CMRO2 (CMRO2i) 4,5.
With the combined FDNIRS/DCS system we are able to quantify cerebral metabolism and hemodynamics. This represents an improvement over CWNIRS for detecting brain health, brain development, and response to therapy in neonates. Moreover, this method adheres to all neonatal intensive care unit (NICU) policies on infection control and institutional policies on laser safety. Future work will seek to integrate the two instruments to reduce acquisition time at the bedside and to implement real-time feedback on data quality to reduce the rate of data rejection.

We combined frequency-domain near-infrared spectroscopy measures of cerebral hemoglobin oxygenation with diffuse correlation spectroscopy measures of cerebral blood flow index to estimate an index of oxygen metabolism. We tested the utility of this measure as a bedside screening tool to evaluate the health and development of the newborn brain.

No invasiva de medición óptica del metabolismo cerebral en lactantes y Hemodinámica

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality  and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can  accurately ...

Utilizing a Cranial Window to Visualize the Middle Cerebral Artery During Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be performed in many locations overlying the rat cerebrum, but is most easily carried out by creating a craniectomy over the readily accessible frontal or parietal bones. Most frequently, we have used this technique in combination with the endothelin-1 middle cerebral artery occlusion model of ischemic stroke to quantify the changes in middle cerebral artery vessel diameter that occur with injection of endothelin-1 into the brain parenchyma adjacent to the proximal MCA4, 5. In order to visualize the proximal portion of the MCA during endothelin -1 induced MCAO, we use a technique to create a cranial window through the temporal bone on the lateral aspect of the rat skull (Figure 1). Cerebral arteries can be visualized either with the dura intact or with the dura incised and retracted. Most commonly, we leave the dura intact during visualization since endothelin-1 induced MCAO involves delivery of the vasoconstricting peptide into the brain parenchyma. This bypasses the need to incise the dura directly over the visualized vessels for drug delivery. This protocol will describe how to create a cranial window to visualize cerebral arteries in a step-wise fashion, as well as how to avoid many of the potential pitfalls pertaining to this method.

This article describes a method for visualizing rat cerebral arteries through a cranial window using temporal craniectomy in order to view proximal portions of the middle cerebral artery (Figure 1). This versatile method can be combined with various techniques of drug delivery to measure cerebral artery reactivity in vivo.

Utilizando una ventana craneal para visualizar la arteria cerebral media Durante la endotelina-1 inducida por oclusión de la arteria cerebral media

Creation of a cranial window is a method that allows direct visualization of structures on the cortical surface of the brain1-3. This technique can be ...

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with distinct functions and gene expression profiles. The roles of microglial activation in health, injury and disease remain incompletely understood due to their dynamic and complex regulation in response to changes in their microenvironment. Thus, it is critical to non-invasively monitor and analyze changes in microglial activation over time in the intact organism. In vivo studies of microglial activation have been delayed by technical limitations to tracking microglial behavior without altering the CNS environment. This has been particularly challenging during chronic neurodegeneration, where long-term changes must be tracked. The retina, a CNS organ amenable to non-invasive live imaging, offers a powerful system to visualize and characterize the dynamics of microglia activation during chronic disorders.
This protocol outlines methods for long-term, in vivo imaging of retinal microglia, using confocal ophthalmoscopy (cSLO) and CX3CR1GFP/+ reporter mice, to visualize microglia with cellular resolution. Also, we describe methods to quantify monthly changes in cell activation and density in large cell subsets (200-300 cells per retina). We confirm the use of somal area as a useful metric for live tracking of microglial activation in the retina by applying automated threshold-based morphometric analysis of in vivo images. We use these live image acquisition and analyses strategies to monitor the dynamic changes in microglial activation and microgliosis during early stages of retinal neurodegeneration in a mouse model of chronic glaucoma. This approach should be useful to investigate the contributions of microglia to neuronal and axonal decline in chronic CNS disorders that affect the retina and optic nerve.

In Vivo Dynamics of Retinal Microglial Activation During Neurodegeneration: Confocal Ophthalmoscopic Imaging and Cell Morphometry in Mouse Glaucoma

Microglia activation and microgliosis are key responses to chronic neurodegeneration. Here, we present methods for in vivo, long-term visualization of retinal CX3CR1-GFP+ microglial cells by confocal ophthalmoscopy, and for threshold and morphometric analyses to identify and quantify their activation. We monitor microglial changes during early stages of age-related glaucoma.

En Vivo Dinámica de Retina Microglial Activación Durante Neurodegeneración: Confocal oftalmoscópico Imaging y Morfometría celular en el ratón Glaucoma

Microglia, which are CNS-resident neuroimmune cells, transform their morphology and size in response to CNS damage, switching to an activated state with ...

A Thrombotic Stroke Model Based On Transient Cerebral Hypoxia-ischemia

Stroke research has endured many setbacks in translating neuroprotective therapies into clinical practice. In contrast, the real-world therapy (tPA thrombolysis) rarely produces benefits in mechanical occlusion-based experimental models, which dominate preclinical stroke research. This split between the bench and bedside suggests the need to employ tPA-responsive models in preclinical stroke research. To this end, a simple and tPA-reactive thrombotic stroke model is invented and described here. This model consists of transient occlusion of the unilateral common carotid artery and delivery of 7.5% oxygen through a face mask in adult mice for 30 min, while maintaining the animal rectal temperature at 37.5 &#177; 0.5 &#176;C. Although reversible ligation of the unilateral carotid artery or hypoxia each suppressed cerebral blood flow only transiently, the combination of both insults caused lasting reperfusion deficits, fibrin and platelet deposition, and large infarct in the middle cerebral artery-supplied territory. Importantly, tail-vein injection of recombinant tPA at 0.5, 1, or 4 hr post-tHI (10 mg/kg) provided time-dependent reduction of the mortality rate and infarct size. This new stroke model is simple and can be standardized across laboratories to compare experimental results. Further, it induces thrombosis without craniectomy or introducing pre-formed emboli. Given these unique merits, the tHI model is a useful addition to the repertoire of preclinical stroke research.

Thromboembolic stroke models are vital tools for optimizing the recanalization therapy. Here we report a murine thrombotic stroke model based on transient cerebral hypoxic-ischemic (tHI) insult, which triggers thrombosis and infarction, and responds favorably to tissue plasminogen activator (tPA)-mediated fibrinolysis in a therapeutic window similar to those in stroke patients.

Un accidente cerebrovascular trombótico Basado En transitoria cerebral por hipoxia-isquemia Modelo

Stroke research has endured many setbacks in translating neuroprotective therapies into clinical practice. In contrast, the real-world therapy (tPA ...

Modeling Encephalopathy of Prematurity Using Prenatal Hypoxia-ischemia with Intra-amniotic Lipopolysaccharide in Rats

Encephalopathy of prematurity (EoP) is a term that encompasses the central nervous system (CNS) abnormalities associated with preterm birth. To best advance translational objectives and uncover new therapeutic strategies for brain injury associated with preterm birth, preclinical models of EoP must include similar mechanisms of prenatal global injury observed in humans and involve multiple components of the maternal-placental-fetal system. Ideally, models should produce a similar spectrum of functional deficits in the mature animal and recapitulate multiple aspects of the pathophysiology. To mimic human systemic placental perfusion defects, placental underperfusion and/or chorioamnionitis associated with pathogen-induced inflammation in early preterm birth, we developed a model of prenatal transient systemic hypoxia-ischemia (TSHI) combined with intra-amniotic lipopolysaccharide (LPS). In pregnant Sprague Dawley rats, TSHI via uterine artery occlusion on embryonic day 18 (E18) induces a graded placental underperfusion defect associated with increasing CNS damage in the fetus. When combined with intra-amniotic LPS injections, placental inflammation is increased and CNS damage is compounded with associated white matter, gait and imaging abnormalities. Prenatal TSHI and TSHI+LPS prenatal insults meet several of the criteria of an EoP model including recapitulating the intrauterine insult, causing loss of neurons, oligodendrocytes and axons, loss of subplate, and functional deficits in adult animals that mimic those observed in children born extremely preterm. Moreover, this model allows for the dissection of inflammation induced by divergent injury types.

Encephalopathy of prematurity encompasses the central nervous system abnormalities associated with injury from preterm birth. This report describes a clinically relevant rat model of in utero transient systemic hypoxia-ischemia and intra-amniotic lipopolysaccharide administration (LPS) that mimics chorioamnionitis, and the related impact of infectious stimuli and placental underperfusion on CNS development.

Modelado Encefalopatía del Prematuro El uso prenatal hipoxia-isquemia con lipopolisacárido intraamniótica en ratas

Encephalopathy of prematurity (EoP) is a term that encompasses the central nervous system (CNS) abnormalities associated with preterm birth. To best ...

Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of stroke than relying on indirect measurements, and will be a potent and robust vascular research tool. We use an optical imaging approach that labels thrombi with a molecular imaging thrombus marker&#160;&#8212; a Cy5.5 near-infrared fluorescent (NIRF) probe that is covalently linked to the fibrin strands of the thrombus by the fibrin-crosslinking enzymatic action of activated coagulation factor XIIIa during the process of clot maturation. A micro-computed tomography (microCT)-based approach uses thrombus-seeking gold nanoparticles (AuNPs) functionalized to target the major component of the clot: fibrin. This paper describes a detailed protocol for the combined in vivo microCT and ex vivo NIRF imaging of thromboemboli in a mouse model of embolic stroke. We show that in vivo microCT and fibrin-targeted glycol-chitosan AuNPs (fib-GC-AuNPs) can be used for visualizing both in situ thrombi and cerebral embolic thrombi. We also describe the use of in vivo microCT-based direct thrombus imaging to serially monitor the therapeutic effects of tissue plasminogen activator-mediated thrombolysis. After the last imaging session, we demonstrate by ex vivo NIRF imaging the extent and the distribution of residual thromboemboli in the brain. Finally, we describe quantitative image analyses of microCT and NIRF imaging data. The combined technique of direct thrombus imaging allows two independent methods of thrombus visualization to be compared: the area of thrombus-related fluorescent signal on ex vivo NIRF imaging vs. the volume of hyperdense microCT thrombi in vivo.

This protocol describes the application of combined near-infrared fluorescent (NIRF) imaging and micro-computed tomography (microCT) for visualizing cerebral thromboemboli. This technique allows the quantification of thrombus burden and evolution. The NIRF imaging technique visualizes fluorescently labeled thrombus in excised brain, while the microCT technique visualizes thrombus inside living animals using gold-nanoparticles.

Imagen Fluorescente combinado del infrarrojo cercano y la tomografía computarizada-Micro para visualizar de manera directa tromboembolia cerebral

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of ...

Induction and Micro-CT Imaging of Cerebral Cavernous Malformations in Mouse Model

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have been established by tamoxifen induced deletion of Ccm genes in postnatal animals. These mouse models provide invaluable tools to investigate molecular mechanism and therapeutic approaches for CCM disease. An accurate and quantitative method to assess lesion burden and progression is essential to harness the full value of these animal models. Here, we demonstrate the induction of CCM disease in a mouse model and the use of the contrast enhanced X-ray micro computed tomography (micro-CT) method to measure CCM lesion burden in mouse brains. At postnatal day 1 (P1), we used 4-hydroxytamoxifen (4HT) to activate Cre recombinase activity from the Cdh5-CreErt2 transgene to cleave the floxed allele of Ccm2. CCM lesions in mouse brains were analyzed at P8. For micro-CT, iodine based Lugol&#39;s solution was used to enhance contrast in brain tissue. We have optimized the scan parameters and utilized a voxel dimension of 9.5 &#181;m, which lead to a minimum feature size of approximately 25 &#181;m. This resolution is sufficient to measure CCM lesion volume and number globally and accurately, and provide high-quality 3-D mapping of CCM lesions in mouse brains. This method enhances the value of the established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for CCM and other cerebrovascular diseases.

This protocol demonstrates the induction of cerebral cavernous malformation disease in a mouse model and uses contrast enhanced micro computed tomography to measure lesion burden. This method enhances the value of established mouse models to study the molecular basis and potential therapies for cerebral cavernous malformation and other cerebrovascular diseases.

Inducción y Micro-CT en la proyección de imagen de malformaciones cavernosas cerebrales en modelo murino

Mutations in the CCM1 (aka KRIT1), CCM2, or CCM3 (aka PDCD10) gene cause cerebral cavernous malformation (CCM) in humans. Mouse models of CCM disease have ...

Middle Cerebral Artery Occlusion Allowing Reperfusion via Common Carotid Artery Repair in Mice

The ischemic stroke is a major cause of adult long-term disability and death worldwide. The current treatments available are limited, with only tissue plasminogen activator (tPA) as an approved drug treatment to target ischemic strokes. Current research in the field of ischemic stroke focuses on better understanding the pathophysiology of stroke, to develop and investigate novel pharmaceutical targets. Reliable experimental stroke models are crucial for the progression of potential treatments. The middle cerebral artery occlusion (MCAO) model is clinically relevant and the most frequently used surgical model of ischemic stroke in rodents. However, the outcomes of this model, such as lesion volume, are associated with high levels of variability, particularly in mice. The alternative MCAO model described here allows the reperfusion of the common carotid artery (CCA) and the increased perfusion of the middle cerebral artery (MCA) territory, using a tissue pad with fibrinogen-based sealant to repair the vessel, and the improved welfare of the mice by avoiding external carotid artery (ECA) ligation. This reduces the reliance on the Circle of Willis, which is known to be highly anatomically variable in mice. Representative data show that using this alternative surgical approach decreases the variability in lesion volumes between the traditional MCAO approach and the alternative approach described here.

Intraluminal filament occlusion of the middle cerebral artery is the most frequently used in vivo model of experimental stroke in rodents. An alternative surgical approach to allow common carotid artery repair is performed here, which allows the reperfusion of the common carotid artery and a full reperfusion to the middle cerebral artery territory.

Oclusión de la arteria Cerebral Media permitiendo la reperfusión mediante la reparación de la arteria carótida común en ratones

The ischemic stroke is a major cause of adult long-term disability and death worldwide. The current treatments available are limited, with only tissue ...