Nuestros métodos crean un modelo confiable de carcinoma hepatocelular hipóxico para imágenes no invasivas de hipoxia tumoral para estudiar la biología del CHC in vivo, lo que puede recapitular mejor el desarrollo del cáncer en humanos. Nuestro modelo confiable de HCC junto con un método de imagen altamente producible sirve como una plataforma importante para la investigación traslacional en la fisiopatología del HCC humano. El monitoreo en tiempo real de la hipoxia tumoral proporciona información sobre los cambios moleculares que conducen a la agresividad del tumor, lo que permite determinar las áreas de hipoxia y predecir la respuesta al tratamiento.
Aunque la cirugía intraabdominal puede ser técnicamente desafiante, la planificación adecuada y el cuidado de los animales mejorarán la tasa general de éxito de la cirugía y el bienestar de los animales pequeños. Para comenzar, esterilice la región dorsal de un ratón anestesiado de 6 a 8 semanas de edad, ya sea en el lado izquierdo o derecho del flanco inferior con etanol al 70%. Luego, use fórceps para levantar la piel e inserte suavemente la aguja de inyección debajo.
Para evitar fugas accidentales de la suspensión celular inyectada durante la extracción de la aguja, avance la aguja de 4 a 5 milímetros desde el sitio de punción a lo largo del plano subcutáneo. Después de soltar los fórceps, descargue cuidadosamente el contenido de la jeringa sin penetrar en el lado opuesto. Después de sacrificar al ratón subcutáneo portador de tumor, haga una incisión en la piel del sitio del tumor con una hoja de bisturí.
Luego, extirpe el bloqueo tumoral y transfiéralo inmediatamente a los medios de cultivo. Luego, usando tijeras quirúrgicas afiladas, corte el bloque tumoral en pequeños cubos de 1 milímetro cúbico, evitando la región central del bloque tumoral. Mantenga todos los cubos en los medios de cultivo.
Para la implantación hepática ortotópica, extienda las extremidades de un ratón anestesiado y asegúrelas con cinta adhesiva para exponer al máximo el abdomen ventral y el tórax. Luego, esterilice toda la piel abdominal con una solución de povidona yodada al 10% seguida de etanol al 70%. A continuación, realice una laparotomía haciendo primero una incisión en la línea media de 10 milímetros utilizando tijeras afiladas para acceder al peritoneo.
Luego, sujete y tire del proceso xifoide hacia la cabeza con fórceps y abra el campo quirúrgico con retractores subcostales. Con un hisopo de gasa húmedo, retraiga los lóbulos mediano e izquierdo del hígado hacia arriba. Luego, mueva los intestinos fuera del abdomen hacia el lado izquierdo del ratón y cúbralos con un hisopo de gasa húmedo.
A continuación, bajo una lámpara de aumento para una visualización óptima, realice la ligadura de la arteria hepática en la arteria hepática común, que se origina desde la cabeza pancreática hasta su raíz en el pedículo hepático. Exponga el lóbulo izquierdo retrayendo la mediana y la espalda del lóbulo izquierdo con un hisopo de gasa húmedo. Luego, usando una cuchilla de bisturí estéril, haga una incisión de aproximadamente 2 milímetros de largo y profunda en el lóbulo izquierdo, e inserte inmediatamente un fragmento de tumor en la incisión hepática con fórceps estériles.
Entierre el tumor de forma segura en el hígado antes de aplicar una sutura en forma de ocho, con una sutura de nylon 6-0 sobre el sitio de la incisión para garantizar la implantación adecuada del tumor y la hemostasia. Luego, cierre la incisión abdominal con suturas 5-0 interrumpidas. Dispensar una alícuota de 18-FMISO a un tubo y diluirlo con solución salina estéril para asegurar una concentración de actividad total de 18 a 20 megabecquerelios en 100 microlitros.
A continuación, extraiga la solución con una jeringa de 1 mililitro y registre la radiactividad y el tiempo que se muestran en el calibrador de dosis. Después de registrar el peso corporal del ratón sujeto, inyecte cuidadosamente la radiosonda preparada a través de la vena de la cola. Para tener en cuenta la corrección de caries, registre el tiempo de inyección y la actividad residual en la jeringa.
Para comenzar la adquisición de PET, localice la posición del ratón en el escáner realizando una vista de explorador. Ajuste la posición de la cama del ratón para asegurarse de que todo el cuerpo del ratón con la región del torso esté en el centro del campo de visión de la RM. A continuación, seleccione Adquisición de PET en la ventana de la lista de estudios. Para usar las posiciones predeterminadas de la cama del ratón desde la vista de explorador, elija Rango de escaneo en adquisición anterior.
Luego, haga clic en Preparar para mover automáticamente la cama del mouse de MR a PET, seguido de Ir para comenzar la adquisición. Seleccione el radionucleótido apropiado en el Editor de radiofármacos e introduzca los detalles de la dosis y el tiempo de inyección. Además, en el menú Información del asunto, introduzca el peso del ratón.
Una vez completada la exploración PET, seleccione Preparar para mover el mouse de PET a MR y haga clic en Ir para realizar la adquisición de MR. Una vez finalizadas todas las exploraciones, vuelva a colocar la cama de imágenes a la posición predeterminada seleccionando Table Out. Las imágenes PET utilizadas en este estudio revelaron un aumento en la captación tumoral de 18-FMISO en ratones con ligadura de la arteria hepática, pero no en ratones control.
Sin embargo, la captación tumoral del marcador glucolítico 18F-FDG fue similar en ratones con y sin ligadura de la arteria hepática. La cuantificación utilizando este enfoque estandarizado basado en el valor de captación reveló una captación 2,3 veces mayor de 18-FMISO por tumores en ratones con ligadura de la arteria hepática que en ratones de control. Del mismo modo, la captación de 18-FMISO fue mayor en los hígados de ratones con ligadura de la arteria hepática que en los hígados de ratones control.
La ligadura de la arteria hepática también resultó en una hipoxia tumoral mejorada, como lo demuestra un nivel más alto de expresión del factor 1-alfa inducible por hipoxia en las secreciones tumorales de ratones con ligadura de la arteria hepática que en los ratones control. Después de las imágenes PET 18-FMISO, nuestra secuenciación se puede realizar para identificar los roles de los genes metabólicos inducidos bajo hipoxia, lo que lleva a nuevas estrategias de tratamiento. Esta técnica se puede utilizar para controlar la hipoxia tumoral con precisión, lo que permite una evaluación rápida de la eficacia del tratamiento y también la creación de una nueva estrategia terapéutica dirigida a la vía de hipoxia en el CHC.
