Agradecemos al Dr. Maiken Nedergaard (Universidad de Rochester Medical Center) para el diseño de la placa de la cabeza. El trabajo ha sido financiado por el NIH premios a SD (R01DA026325 y P30AI078498 y donaciones de fundaciones a KK (DANA cerebro bases y el programa de Immunoimaging, Asociación Americana del Corazón y la Asociación 0635595T ELA [# 1112)]).

1. Preparación del animal para obtener imágenes Nota: Nosotros usamos ratones C57BL adultos. Diferentes cepas transgénicas se pueden utilizar dependiendo de la pregunta de investigación. Cirugías microvasculares y oximetría de pulso se facilitan en los ratones con pelaje blanco (por ejemplo, cepa FVB). <ol><li> Preparar el lugar de la cirugía en el banco. Todos los instrumentos quirúrgicos deben esterilizarse en autoclave o desinfectada con etanol al 70%. </li><li> Insertar una sonda rectal, y medir continuamente la temperatura corporal del animal durante todo el procedimiento </li><li> Se anestesia el ratón usando inicialmente 5% de isoflurano. En 15 a 30 s, cuando el animal no se mueve, colóquelo en una almohadilla térmica (37 ° C), y aplicar una mascarilla para el suministro continuo de aire que contiene 1,3-1,5% de isoflurano). Asegúrese de que el animal no está respondiendo a un estímulo doloroso (por ejemplo, pizca de cola). </li><li> El uso de gel de lágrimas artificiales para cubrir los ojos del ratón, para evitar la exposición al aire seco. </li><li> Utilizando una máquina de afeitar eléctrica, quitar el pelo fesde la cabeza y de ambos muslos. Aplique removedor de pelo (por ejemplo, Nair) en el muslo durante 2 minutos, y luego pase cuidadosamente para eliminar el resto del cabello. Este muslo se utilizará para la oximetría. </li><li> Desinfecte el cuero cabelludo con un 10% de povidona-yodo solución y 70% de etanol. </li></ol> 2. Preparación de la ventana abierta del cráneo del cráneo <ol><li> A partir de 5 mm caudal a la cabeza, hacer una incisión en el cuero cabelludo con unas tijeras, y avanzar un centímetro. Mover la piel a los lados para exponer el cráneo. </li><li> Para quitar las membranas en la parte superior del cráneo se aplican 10% de solución de cloruro férrico a la parte superior del cráneo. Limpie el exceso de solución, y raspar las membranas de distancia con 45 ° de ángulo # 5 pinzas. Es importante para preparar el sitio cuidadosamente, con el fin de asegurar que la placa de cabeza puede estar firmemente sujeto al cráneo (pasos # 4 a 6). </li><li> Utilizando un microscopio de disección, identificar el área de interés. Tenga en cuenta que las suturas del cráneo debe ser evitado debido a que el cráneo de cromper una manera impredecible a lo largo de estas líneas. </li><li> Aplicar una capa delgada de cola rápida (por ejemplo Locktite 454) alrededor de los bordes de la ventana de la placa de cabeza (Figura 1). Colocar la placa de cabeza de tal manera que el área de interés está expuesto en la ventana. Aplique una ligera presión en la placa de la cabeza. Aplicar una pequeña cantidad de cemento dental para polimerizar el pegamento rápidamente. Mantenga esta posición durante 10 segundos, mientras que el pegamento se polimeriza. </li><li> Aplicar una pequeña cantidad de pegamento rápido a los bordes de la ventana para sellar la placa de cabeza y el cráneo. Atornille la placa de la cabeza al titular del animal en el ámbito de disección. </li><li> Con el taladro Microtorque II estableció a 6000 rpm y un IRF 005 broca, retire todo el pegamento extra del cráneo y de la placa de la cabeza. Cualquier pegamento que queda en la placa de cabeza debe ser eliminado, ya que de lo contrario va a interferir con la unión de la cubierta de vidrio. </li><li> Establecer el taladro a 1000 rpm, y comenzar a perforar el cráneo haciendo un círculo dentro de la ventana placa de cabeza, diámetro ~ 5 mm. El uso de luz los movimientos radicales como si estuviera dibujando con un lápiz muy suave. Deje de perforar cada 20-30 segundos para quitar el polvo de huesos con aire comprimido. Nota: La forma de la abertura en la placa del cabezal permite un acceso adicional para la broca (para el cirujano de izquierda y derecha con las manos), lo que hace que sea más fácil para crear una ventana craneal circular. Además, los dos orificios en forma de impares proporcionar el espacio necesario para insertar un electrodo de Clark-o-electrodo de vidrio en el tejido cerebral debajo de la ventana craneal para mediciones adicionales polarográficos o electrofisiológicos. </li><li> A medida que la perforación avanza, una madriguera se forma alrededor del cráneo intacto en el centro. Tenga cuidado de no perforar el cráneo adelgazado, pero para hacer esta madriguera de un grosor uniforme. Tenga cuidado extra alrededor de los vasos sanguíneo grande-que no debe ponerse en peligro y, si es posible, no tocó siquiera. </li><li> Utilizar una &quot;pata&quot; de pinzas # 3 para levantar (&quot;Flick off&quot;) del hueso en el centro de la ventana. Aplique una gota de Artificial del líquido cefalorraquídeo (ACSF) en la ventana. </li><li> Limpie suavemente con aCSF una esquina de un pañuelo de papel suave (por ejemplo, Kimwipe). Por lo general, la duramadre está dañado en uno o más lugares alrededor del borde de la ventana. A partir de uno de estos sitios, levante suavemente y luego retire la duramadre de la superficie del cerebro, utilizando pinzas ángulo de 45 ° N ° 5. Al elegir el sitio donde se va a empezar a eliminar la dura, evitar las zonas adyacentes a los vasos sanguíneos grandes. Si hay sangrado, aplique una gota de aCSF y esperar 2-3 minutos para la sangría de menor importancia que parar. </li><li> Preparar un 0,07% bajo punto de fusión de agarosa disuelta en ACSF) Llevar la agarosa fundida a la temperatura corporal. Limpie el exceso de aCSF desde la superficie del cerebro. Verter la agarosa en la ventana, y se cubre con una lámina de vidrio. Presione el vaso suavemente para hacer un contacto entre el vidrio y la placa de cabeza, y esperar 10-20 segundos hasta que la agarosa es sólido. </li><li> Eliminar el exceso de agarosa de la cubierta de vidrio con unas pinzas y papel de los tejidos blandos. </li><li> Ponga una pequeñacantidad de pegamento rápido alrededor del vaso para pegar el vidrio a la placa de cabeza. Aplicar una pequeña cantidad de cemento dental para solidificar el pegamento (Figura 1). </li></ol> 3. La inyección intravenosa y el control oxigenación de la sangre Nota: Se utiliza rutinariamente la vena femoral para la aplicación intravenosa de Texas rojo en lugar de la vena de la cola. Esto es debido a inyecciones vena femoral proporcionar inyecciones en bolo seguras y reproducibles de la tintura. <ol><li> Gire el animal parcialmente para dejar al descubierto el interior del muslo izquierdo. Use cinta para asegurar el animal en esta posición. </li><li> Aplicar fregado antiséptico, y luego 100% de etanol a la piel. </li><li> Hacer una incisión a lo largo del muslo desde la rodilla hasta la sínfisis del pubis. Separe los tejidos blandos por disección roma utilizando pinzas # 5. </li><li> Llenar jeringa de 1 ml con 130 l de Rojo Texas (2,5 mg / ml). Coloque una nueva aguja (calibre 30), y doble con cuidado a los 30 °, manteniendo el bisel hacia arriba. Llene el wi agujaª Rojo Texas solución. </li><li> Bajo un microscopio de disección, inserte la aguja en la vena femoral e inyectar 100 l de Texas Red. Se retira la aguja y presione suavemente la vena con una gasa para detener el sangrado. </li><li> Cierre la piel con sutura 4-0. </li><li> Para el monitoreo continuo de la sangre de SpO 2 (para asegurar la adecuada oxigenación de la sangre) coloque la sonda del oxímetro en el muslo derecho (de la cual el pelo se retiró previamente). </li></ol> 4. De dos fotones de imágenes Nota: Usamos una Olympus Fluoview1000 multifotónica sistema de imágenes (vertical) con una Spectra-Physics Maitai HP femtosegundo DeepSee Ti: Sa láser como una fuente de excitación. Para imágenes, usamos x 10 NA 0,45 (Zeiss C-Apochromat), o 25 × NA 1,05 (Olympus XLPlan N) los objetivos de inmersión en agua. Tomamos imágenes de 12 bits de profundidad con una resolución de 512 × 512 píxeles con un píxel tiempo de permanencia de 2 mS. El NADH y Texas-Red de dextrano-se al mismo tiempo emocionado a 740 nm, y flúorescencia está separada de la luz de excitación mediante un espejo dicroico / infrarrojo cercano de bloqueo de combinación de filtros (FF665-DI01; FF01-680/SP, Semrock, Rochester, NY, EE.UU.), dividido en dos canales a través de un espejo dicroico (505DCXRU, Chroma , Rockingham, Vermont, EE.UU.), y de paso de banda filtrada (NADH-Semrock FF460/80Texas-Red-dextran-Semrock FF607/36). Potencia láser mide después de que el objetivo era 10-20 mW para formación de imágenes en la capa I y 20-50 mW para formación de imágenes en la capa II. <ol><li> Transferir el ratón preparado quirúrgicamente a la platina del microscopio. Tomar una imagen inicial del sitio ventana craneal uso de la iluminación de campo claro con un aumento de 4x para usar como un mapa de referencia para el registro en un aumento mayor de dos fotones de angiografías. </li><li> Haz zoom en el área de interés utilizando × 10 aumentos. Seleccione un área de interés en las capas corticales I o II (hasta 150 m por debajo de la superficie pial). Si se desea mayor aumento, el uso objetivo × 25 </li><li> Inicio de la serie de tiempo (Figure 2). Le recomendamos que utilice un promedio de 3-5 cuadros para aumentar la calidad de la imagen. </li><li> Inducir la hipoxemia mediante la adición de un 50% de N2 a la atmósfera que el animal está respirando. Esto hará que el nivel de O2 al 10%. Verifique la hipoxemia mediante el control de los datos de oxímetro. </li><li> Continuar para grabar la serie de tiempo a través de la hipoxemia (por ejemplo, durante 30 segundos), y después de nivel normal de O2 es restaurado. </li><li> Recopilar datos para el cálculo de la distribución de oxígeno mediante la detección, medición y cuantificación de la zona de los cilindros de hipoxia tisular y oxigenada alrededor de los vasos sanguíneos. </li></ol> 5. Proceso de datos <ol><li> Determinar la Krogh tejido cilindro radio R. Esto puede hacerse manualmente (Figura 3) mediante la medición de la distancia entre el centro del vaso sanguíneo y el límite en el que se detecta alta fluorescencia de NADH. </li><li> También puede utilizar el cálculo por el investigador independiente de la determinación semi-automático de la investigación del tejido y el radio del cilindro central de blor od buque que ha sido descrito previamente una forma complementaria y se resumen en la sección de discusión de este protocolo. </li><li> Determinar el área de la hipoxia con libre acceso al software de análisis de imagen, por ejemplo, ImageJ. Para ello, utilice la señal de NADH, definir un umbral que delimita el área de alta intensidad de NADH, y luego medir el área con elevada fluorescencia de los tejidos NADH. </li></ol> 6. Los resultados representativos La figura 2 muestra un video de NADH / angiografía imágenes durante la hipoxemia transitoria (para la versión en PDF de esta figura, una selección de imágenes fijas se han utilizado). La concentración de oxígeno inspirado se redujo de 21% a 10% durante un período de 3 minutos. Este nivel de hipoxemia inducida experimentalmente es suficiente para inducir la hipoxia severa en la corteza cerebral. La hipoxia condujo a un aumento de la fluorescencia de NADH, inicialmente en las zonas que estaban más alejado del suministro de sangre arterial. Tenga en cuenta que el tejido NADH agudalímites, que representan los límites observables de tejido de difusión de oxígeno a partir de la microcirculación corticales. La imagen de la Figura 3 se muestra la geometría de los límites de la difusión de oxígeno que rodean los vasos cerebrales. Es posible deducir Krogh diámetros de los cilindros de estos límites, como se ha descrito anteriormente 1. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3466/3466fig1.jpg" /> Figura 1. (A) de ratón con ventana craneal preparado para imágenes. (B) Dimensiones de la placa de la cabeza. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3466/3466fig2.jpg" /> Figura 2. Endógeno NADH fluorescencia verde visualiza con dos fotones de imágenes a través de la ventana del cráneo, de aproximadamente 50 m por debajo de la superficie pial. Los vasos sanguíneos se visualizan con Rojo Texas dextrano. El oxígeno en el aire inhalado se redujo a 10% durante 3 min, y luego restaurado el 21%. Barra de escala: 50 micras. &lt;img alt = &quot;Figura 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3466/3466fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3. Geometría de los límites de NADH fluorescencia. Esquema amarillo muestra el límite de la hipoxia funcional; círculos azules muestran proyectadas oxigenados (Krogh) cilindros. Las líneas azules muestran los radios del cilindro, los números muestran radios en micrómetros.

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	<li>Kasischke, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+NADH+imaging+exposes+boundaries+of+oxygen+diffusion+in+cortical+vascular+supply+regions.">Two-photon NADH imaging exposes boundaries of oxygen diffusion in cortical vascular supply regions.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 31, 68-81 (2011).</li><li>Ndubuizu, O., LaManna, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+tissue+oxygen+concentration+measurements.">Brain tissue oxygen concentration measurements.</a> Antioxid. Redox. Signal. 9, 1207-1219 (2007).</li><li>Sharan, M., Vovenko, E. P., Vadapalli, A., Popel, A. S., Pittman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+and+theoretical+studies+of+oxygen+gradients+in+rat+pial+microvessels.">Experimental and theoretical studies of oxygen gradients in rat pial microvessels.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 28, 1597-1604 (2008).</li><li>Sakadzic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+high-resolution+measurement+of+partial+pressure+of+oxygen+in+cerebral+vasculature+and+tissue.">Two-photon high-resolution measurement of partial pressure of oxygen in cerebral vasculature and tissue.</a> Nat. Methods. 7, 755-759 (2010).</li><li>Vishwasrao, H. D., Heikal, A. A., Kasischke, K. A., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+dependence+of+intracellular+NADH+on+metabolic+state+revealed+by+associated+fluorescence+anisotropy.">Conformational dependence of intracellular NADH on metabolic state revealed by associated fluorescence anisotropy.</a> J. Biol. Chem. 280, 25119-25126 (2005).</li><li>Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+and+stimulus-induced+changes+in+blood+flow+observed+in+individual+capillaries+in+layers+2+through+4+of+rat+neocortex.">Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 95, 15741-15746 (1998).</li><li>Brown, W. R., Thore, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+cerebral+microvascular+pathology+in+ageing+and+neurodegeneration.">Review: cerebral microvascular pathology in ageing and neurodegeneration.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 37, 56-74 (2011).</li><li>de la Torre, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+brain+microcirculation+may+trigger+Alzheimer's+disease.">Impaired brain microcirculation may trigger Alzheimer's disease.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 18, 397-401 (1994).</li><li>Brown, C. E., Boyd, J. D., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longitudinal+in+vivo+imaging+reveals+balanced+and+branch-specific+remodeling+of+mature+cortical+pyramidal+dendritic+arbors+after+stroke.">Longitudinal in vivo imaging reveals balanced and branch-specific remodeling of mature cortical pyramidal dendritic arbors after stroke.</a> J. Cereb. Blood. Flow. Metab. 30, 783-791 (2010).</li><li>Wilson, D. F., Erecinska, M., Drown, C., Silver, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oxygen+dependence+of+cellular+energy+metabolism.">The oxygen dependence of cellular energy metabolism.</a> Arch. Biochem. Biophys. 195, 485-493 (1979).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Información de alta resolución espacial sobre la difusión de oxígeno es importante para entender cómo el flujo sanguíneo en el cerebro se regulan para suministrar oxígeno a las células cerebrales, y para satisfacer la demanda metabólica. Tradicionales mediciones de oxígeno polarográfico con Clark al estilo de los electrodos de vidrio son altamente invasivos y tienen baja resolución espacial de 2-3 y el tiempo de respuesta significativa (segunda serie). Hasta el momento el único método no invasivo para medir la PO 2 en el tejido cerebral es apagar la fosforescencia, donde la tasa de descomposición de la sonda de excitación es proporcional a la concentración de oxígeno 4. Este método proporciona concentraciones exactas de oxígeno, sino que requiere un colorante específico y un técnico sofisticado sistema de vida de la fosforescencia de imagen. Este sentido, demuestran un enfoque directo, más simple que se puede realizar en un sistema de imágenes estándar de dos fotones con dos canales flurescence. Nuestro enfoque tiene la ventaja de una señal intrínseca del tejido 5 aª sólo requiere la visualización de contraste de la microcirculación cortical. Debido a la no-lineal, aumento esencialmente binaria de NADH fluorescencia a funcionalmente limitar las concentraciones de oxígeno 1, el aumento de la fluorescencia intrínseca NADH se observó sólo en áreas con hipoxia significativa, metabólicamente limitante. Una consecuencia importante es que los límites del tejido de la difusión de oxígeno de los microvasos corticales son directamente observables por los cambios de intensidad de forma cilíndrica de la fluorescencia endógena NADH. Nos referimos a estas estructuras como cilindros Krogh, porque el concepto de estructuras de forma cilíndrica que definen el volumen oxigenada del tejido que rodea los vasos sanguíneos fue presentado por August Krogh y ha sido recientemente observado experimentalmente con dos fotones NADH imagen 1. Cilindros Krogh imágenes se pueden recoger en 3D, a una z pila de cuadros de imagen. Son especialmente prominente en la vecindad de las arteriolas penetrantes y son congruentes ingenioh capilar agotadas cilindros periarteriolares tejidos 1,4. Para proporcionar una determinación objetiva de la R tejido Krogh radio del cilindro (véase la sección 5.2) que mide los valores de intensidad de pixel radiales dentro de un segmento bien definido entre el centro del cilindro y el límite exterior mediante la función de Matlab &quot;improfile&quot;. El límite exterior del segmento debe ser elegido para extender con un margen de seguridad más allá del límite visible. Para mejorar el nivel de señal a ruido nos averageed sobre todas las líneas radiales necesarios para cubrir el segmento visible del cilindro en pasos de 1 °. El perfil medio resultante intensidad radial dentro del segmento exhibió un aumento pronunciado que correspondía a la R tejido límite visible. El encajamos una función sigmoidal (por ejemplo, la función de Boltzmann) para el perfil de intensidad radial promediada y se utiliza su punto de inflexión (también conocido como x 0) como una definición de R. El correspondiente dos-pHoton microangiography (Texas-rojo) reveló la sección transversal de un vaso sanguíneo solitario central en el centro del cilindro. El diámetro del vaso sanguíneo central puede aplicarse directamente para determinar r. Dos fotones de NADH imágenes proporciona la misma resolución espacial como la concurrente de alta resolución de imagen de la microangiography cortical. Una característica importante para la aplicación cuantitativa de este método es que p 50 del aumento de fluorescencia de NADH se ha medido a ser de 3,4 ± 0,6 mm de Hg 1 y que la intensidad de fluorescencia de NADH como una función del tejido microrregional PO 2 puede ser matemáticamente descrito con una función sigmoidal. . Se demuestra que esta técnica permite una para identificar las áreas del cerebro que son más vulnerables a la hipoxia (por disminución del contenido de oxígeno en el aire a 10%). También se muestra que la difusión de oxígeno sigue un patrón simple perivascular geométrica. Un críticoiCal paso para este método es la calidad de la preparación ventana craneal. La cirugía debe producir un daño mínimo a fin de no perturbar el flujo sanguíneo a la zona expuesta. Una preocupación es que en una preparación quirúrgicamente comprometida, la corteza debajo de la ventana puede ser hipóxico, para empezar, lo que impide cualquier experimentos significativos. Una ventana craneal bien preparado debe tener intactos los vasos sanguíneos mayores y menores, con el flujo de sangre viva en todos los tipos de buques y no hay hemorragia significativa a lo largo de los bordes. En condiciones normoxic (PaO 2 80-100 mmHg, Sp. O2 97-99%) el parénquima cerebral que presentan fluorescencia uniforme, homogénea y sin NADH parches conspicuos, los tejidos brillantes con fluorescencia de NADH elevado. Una restricción física fundamental de nuestro enfoque se limita la profundidad de penetración. La fluorescencia azul-verde de NADH en el cerebro es rápidamente atenuada por la absorción de la hemoglobina y la dispersión del tejido en estas longitudes de onda. Incluso con apertura numérica alta (por ejemplo 1,05) aguaobjetivos de inmersión de dos fotones NADH imagen se limita actualmente a las capas corticales I y II. Esta limitación es científicamente relevante porque el metabolismo energético en o en la proximidad de la materia blanca es probable que difieren de la materia gris. Sin embargo, la investigación de las estructuras corticales profundas, tales como capas IV-VI o estructuras subcorticales tales como tractos de sustancia blanca o cuerpo estriado del requeriría el uso de microlentes especializados como se describe en la corteza del ratón in vivo 6. NADH basado en la medición de los límites de la difusión de oxígeno puede ser especialmente útil cuando se combina con otras mediciones tales como análisis de hiperemia funcional, y la detección de las tasas de flujo capilar 7. Por ejemplo, esta técnica se puede adaptar para visualizar la hipoxia en el accidente cerebrovascular y la enfermedad de Alzheimer (EA) modelos. La geometría simple de difusión de oxígeno permite predecir el gradiente de oxígeno en los lechos microvasculares en circunstancias donde la densidad capilar es deaumentó 8 (por ejemplo, AD 9) y para examinar si las regiones de tejido cerebral con reducción de la densidad capilar tienen un mayor riesgo de daños debido a la hipoxia microstrokes. La capacidad de imagen microregionally también permite una para examinar la geometría y el tamaño de microstrokes tejido y determinar el volumen de tejido en el que se produce la hipoxia, así como la relación entre la hipoxia del tejido y posterior muerte neuronal o remodelación capilar 10. Por último, dado el aumento de la fluorescencia endógena NADH son la consecuencia directa de la disfunción mitocondrial aguda, este método crea la oportunidad de utilizar imágenes de NADH como un reportero en particular para el metabolismo energético neuronal 11 y un proxy para la disfunción mitocondrial. En conclusión, de dos fotones de imágenes de fluorescencia de NADH endógeno es una herramienta sencilla, poco exigente que se puede utilizar para comprender el aporte de oxígeno y el consumo en el cerebro en tanto normalesy en estados patológicos.

<table border="1"><tbody><tr valign="top"><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> Los cojines de calefacción </td><td> Más allá de calor Bodi </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Oftálmica pomada (lágrimas artificiales) </td><td> Pfizer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> La povidona-yodo solución al 10% </td><td> Betadine </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Solución de cloruro férrico 10% </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cemento </td><td> Stoelting Empresa </td><td> 51456 </td><td></td></tr><tr><td> Cianoacrilato 454 </td><td> Loctite </td><td></td><td></td></tr><tr><td> aCSF </td><td> Aparato de Harvard </td><td> 597316 </td><td></td></tr><tr><td> Microtorque II kit de piezas de mano </td><td> Pearson </td><td> R14-0002 </td><td></td></tr><tr><td> IRF 007 brocas </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 19008-07 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzas # 5 </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11295 </td><td></td></tr><tr><td> Pinzas º 5/45 </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11251-35 </td><td></td></tr><tr><td> # 0 cubreobjetos </td><td> Microscopía Electrónica de Ciencias </td><td> 63750-01 </td><td></td></tr><tr><td> Tubo fotomultiplicador </td><td> Hamamatsu </td><td> HC125-02 </td><td></td></tr><tr><td lang="it-IT" xml:lang="it-IT"> Ti: Zafiro con láser Mai-Tai </td><td> Spectra-Physics </td><td> Ynbsp; </td><td></td></tr></tbody></table>

detection of microregional hypoxia in mouse cerebral cortex by two-photon imaging of endogenous nadh fluorescence

La capacidad del cerebro para funcionar a un alto nivel de la demanda metabólica depende de la oferta continua de oxígeno a través del flujo sanguíneo y la difusión de oxígeno a los tejidos. Aquí se presenta un protocolo experimental, visualizar y metodológicos para visualizar directamente la hipoxia tisular y microrregional para inferir gradientes perivasculares de oxígeno en la corteza del ratón. Se basa en la relación no lineal entre dinucleótido de nicotinamida adenina (NADH) la intensidad de fluorescencia endógena y la presión parcial de oxígeno en el tejido, donde observó tejido NADH fluorescencia aumenta bruscamente en los niveles de oxígeno del tejido por debajo de 10 mmHg 1. Utilizamos dos fotones de excitación a 740 nm que permite la excitación simultánea de fluorescencia intrínseca del tejido NADH y el plasma sanguíneo en contraste con Texas-Red de dextrano. Las ventajas de este método sobre los métodos existentes incluyen los siguientes: toma ventaja de una señal de tejido intrínseco y se puede realizar utilizando el estándar de dos fotones en vivo imenvejecimiento de equipos, sino que permite la vigilancia continua en el campo de la vista con una resolución de profundidad de aproximadamente 50 micras. Se demuestra que las zonas de tejido cerebral más alejados de los vasos sanguíneos cerebrales corresponden a las cuencas hidrográficas vulnerables que son los primeros que se desempeñe con la hipoxia debido a una disminución en el suministro de oxígeno vascular. Este método le permite a uno la imagen cortical oxigenación microrregional y por tanto es útil para examinar el papel de la oferta tisular de oxígeno inadecuada o restringida en las enfermedades neurovasculares y los accidentes cerebrovasculares.

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Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

Aquí se describe un método para visualizar directamente la hipoxia tisular microrregional en la corteza del ratón<em&gt; En vivo</em&gt;. Se basa en simultáneo de dos fotones de imágenes de dinucleótido de nicotinamida adenina (NADH) y la microcirculación cortical. Este método es útil para el análisis de alta resolución de suministro de oxígeno del tejido.

La detección de la hipoxia Microrregional en corteza cerebral de ratón por la imagen de dos fotones de fluorescencia endógena NADH

The brain's ability to function at high levels of metabolic demand depends on continuous oxygen supply through blood flow and tissue oxygen diffusion. ...

detection-microregional-hypoxia-mouse-cerebral-cortex-two-photon

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.0K vistas.  University of Rochester Medical Center. Aquí se describe un método para visualizar directamente la hipoxia tisular microrregional en la corteza del ratón En vivo. Se basa en simultáneo de dos fotones de imágenes de dinucleótido de nicotinamida adenina (NADH) y la microcirculación cortical. Este método es útil para el análisis de alta resolución de suministro de oxígeno del tejido.

Video: Detection of Microregional Hypoxia in Mouse Cerebral Cortex by Two-photon Imaging of Endogenous NADH Fluorescence

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has significantly broadened our knowledge of physiological and pathological processes in numerous tissues in vivo 4-7. In studies of the central nervous system (CNS), there has been a broad application of in vivo imaging in the brain, which has produced a plethora of novel and often unexpected findings about the behavior of cells such as neurons, astrocytes, microglia, under physiological or pathological conditions 8-17. However, mostly technical complications have limited the implementation of in vivo imaging in studies of the living mouse spinal cord. In particular, the anatomical proximity of the spinal cord to the lungs and heart generates significant movement artifact that makes imaging the living spinal cord a challenging task.
We developed a novel method that overcomes the inherent limitations of spinal cord imaging by stabilizing the spinal column, reducing respiratory-induced movements and thereby facilitating the use of two-photon microscopy to image the mouse spinal cord in vivo. This is achieved by combining a customized spinal stabilization device with a method of deep anesthesia, resulting in a significant reduction of respiratory-induced movements. This video protocol shows how to expose a small area of the living spinal cord that can be maintained under stable physiological conditions over extended periods of time by keeping tissue injury and bleeding to a minimum. Representative raw images acquired in vivo detail in high resolution the close relationship between microglia and the vasculature. A timelapse sequence shows the dynamic behavior of microglial processes in the living mouse spinal cord. Moreover, a continuous scan of the same z-frame demonstrates the outstanding stability that this method can achieve to generate stacks of images and/or timelapse movies that do not require image alignment post-acquisition. Finally, we show how this method can be used to revisit and reimage the same area of the spinal cord at later timepoints, allowing for longitudinal studies of ongoing physiological or pathological processes in vivo.

In vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord Using Two-photon Microscopy

A minimally invasive protocol to stabilize the mouse spinal column and perform repetitive in vivo spinal cord imaging using two-photon microscopy is described. This method combines a spinal stabilization device and an anesthetic regimen to minimize respiratory-induced movements and produce raw imaging data that require no alignment or other post-processing.

Imágenes in vivo de la médula espinal de ratón Utilizando microscopía de dos fotones

In vivo imaging using two-photon microscopy 1 in mice that have been genetically engineered to express fluorescent proteins in specific cell types 2-3 has ...

Investigación

Neurociencias

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

In vivo de dos fotones de imágenes de dependientes Experience-Los cambios moleculares en las neuronas corticales

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

De dos fotones<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de las espinas dendríticas en la corteza del ratón Usando un Diluido-cráneo Preparación

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

De dos fotones de imágenes de Dinámica Celular en la médula espinal de ratón

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultánea de dos fotones<em&gt; En Vivo</em&gt; Imágenes de entradas sinápticas y Objetivos postsinápticos en la corteza del ratón retroesplenial

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Quantification of Cerebral Vascular Architecture using Two-photon Microscopy in a Mouse Model of HIV-induced Neuroinflammation

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

Cuantificación de Cerebral Vascular Arquitectura utilizando microscopía de dos fotones en un modelo de ratón de la neuroinflamación inducida por el VIH

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Proyección de imagen de calcio de dos fotones en las dendritas neuronales en rebanadas de cerebro

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

En Vivo Proyección de imagen de dos fotones de neuronas corticales en ratones neonatales

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

Imágenes transpupilares de dos fotones in vivo de la retina del ratón

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

Microglia, the only immune cells resident in the brain, actively participate in neural circuit maintenance by modifying synapses and neuronal excitability. Recent studies have revealed the differential gene expression and functional heterogeneity of microglia in different brain regions. The unique functions of the hippocampal neural network in learning and memory may be associated with the active roles of microglia in synapse remodeling. However, inflammatory responses induced by surgical procedures have been problematic in the two-photon microscopic analysis of hippocampal microglia. Here, a method is presented that enables the chronic observation of microglia in all layers of the hippocampal CA1 through an imaging window. This method allows the analysis of morphological changes in microglial processes for more than 1 month. Long-term and high-resolution imaging of the resting microglia requires minimally invasive surgical procedures, appropriate objective lens selection, and optimized imaging techniques. The transient inflammatory response of hippocampal microglia may prevent imaging immediately after surgery, but the microglia restore their quiescent morphology within a few weeks. Furthermore, imaging neurons simultaneously with microglia allows us to analyze the interactions of multiple cell types in the hippocampus. This technique may provide essential information about microglial function in the hippocampus.

In Vivo Chronic Two-Photon Imaging of Microglia in the Mouse Hippocampus

This paper describes a method for chronic in vivo observation of the resting microglia in the mouse hippocampal CA1 using precisely controlled surgery and two-photon microscopy.