This research was supported by Cleveland State University Faculty Development Funds.

1. Preparación de parásitos Cultivos Celulares, Colección de Parásito Pellets <ol><li> Preparar medios RPMI-1640 con HEPES mediante la adición de 10 g de polvo de RPMI-1640, 66 mg de sulfato de gentamicina, 2 g de bicarbonato de sodio, 5,9 g de tampón HEPES, 50 mg hipoxantina y 3,8 g de dextrosa en 1 L dH estéril 2 O. Mezclar utilizando la tabla agitador magnético hasta que todos los que se disuelva el polvo en 1 L de agua destilada. Realizar micro filtración de medios utilizando 0,22 micras filtro. Almacene el papel en frascos estériles. </li><li> Lávese las no infectadas (fresco) tipo A + eritrocitos utilizando RPMI. Preparar 5% de hematocrito de los eritrocitos (0,5 ml de eritrocitos frescos lavados en 9,5 ml 10% RPMI + suero humano). </li><li> Haz 15% de suero humano + RPMI (15 ml de suero humano y 85 ml de RPMI) para iniciar el cultivo de parásitos. Hacer 10% de suero humano y RPMI (10 ml de suero humano y 90 ml de RPMI) para continuar el cultivo de parásitos en los glóbulos rojos. </li><li> Cultura P. falciparum (3D7 y FCR-3 cepas) en el tipoA + eritrocitos humanos en 5% de hematocrito y 20% de parasitemia en placa de Petri o un frasco de cultivo de 75 cm 3. Mantener el cultivo in vitro de acuerdo con el método de Trager y Jensen vela tarro 26. Alternativamente, mantienen las culturas están en la incubadora a 37 ° C se mantiene 9,5% de CO 2 y el 3,4% de N 2 gas. Cultura P. falciparum en RPMI 1640 con HEPES medio suplementado con 10% de suero humano. </li><li> Sincronizar P. cultura falciparum mediante la adición de 65% de Percoll (65 ml de Percoll + 35 ml de RPMI-1640 sin suero humano) al cultivo concentrado 27. </li><li> Centrifugar el concentrado de cultivo con Percoll a 2.500 xg durante 5 min que se traduce en 3 capas. Con cuidado, usando una pipeta de transferencia aislar esquizontes de la transferencia de capa media en un tubo separado en condiciones asépticas 27. </li><li> Lavar los cultivos aislados con 10% de suero humano + RPMI-1640 dos veces para eliminar el exceso de Percoll por centrifugación a 7500 xg durante 5 min. Discard el sobrenadante cada vez en condiciones asépticas 27. </li><li> Continuar el cultivo de la P. sincronizado esquizontes falciparum en 10% de suero humano RPMI-1640 + 27. </li><li> Recoger esquizontes mediante el tratamiento de los eritrocitos infectados por Plasmodium con 10 mM Tris pH 8,8 y centrifugación a 15.000 xg durante 15 min 23. Gránulos de parásitos tienda a -70 ° C después de la adición de 5 l de inhibidor de la proteasa (aprotinina) a los pellets. Utilice bolitas de parásitos para la extracción de proteínas, el aislamiento de ADN genómico y el aislamiento de ARN. </li></ol> 2. Preparación de plásmido vector <ol><li> Aislar el ADN genómico de P. pellets de esquizontes falciparum preparados a partir de cultivos de aproximadamente el 20% de parasitemia. </li><li> Añadir 600 l de 10 mM Tris-HCl de pH 7,6, 50 mM EDTA pH 8,0, 0,1% SDS y 1 mg / ml de proteinasa K, a gránulos en un tubo de microcentrífuga, homogeneizar pellet utilizando una jeringa de 1 ml unida a una aguja 26 G. Alternate llenado de la jeringacon la mezcla de pellets y vaciado en un tubo de microcentrífuga de 20 veces. Incubar tubo que contiene homogeneizado O / N en un baño de agua a 50 ° C. </li><li> Realizar fenol - cloroformo (P + C) la extracción mediante la adición de 600 l de P + C (300 l de fenol y 300 l de cloroformo) a pellet homogeneizada. Tubo de tapa y agite la mezcla vigorosamente por inversión de extremo a extremo de tubo. Tubo de centrífuga a 14.000 xg durante 2 min y recoger solución acuosa superior utilizando una micropipeta en un nuevo tubo de microcentrífuga. Repita este paso dos veces. </li><li> Añadir 600 l de cloroformo a la capa acuosa en el nuevo tubo de la etapa 2.1.2. Vortex el tubo durante 10 segundos y se centrifuga a 14.000 xg durante 2 min. Medir la capa acuosa superior con una micropipeta y la transfiere a un nuevo tubo de microcentrífuga. </li><li> Añadir 0,1 vol de 5 M de acetato de sodio pH 5,5 y 1 vol de isopropanol (si capa acuosa es de 300 l añaden 30 l de 5 M de acetato de sodio pH 5,5 + 330 l de isopropanol) para la puesta acuosaer desde el paso 2.1.3. Incubar el tubo a TA durante 15 min. </li><li> Centrifugar el tubo a 14.000 xg durante 10 min para precipitar sedimento de ADN. Descartar el sobrenadante y lavar pellet con 100 l de etanol al 70% (70 l de etanol y 30 l de dH 2 O) para eliminar el exceso de sal a partir del ADN. ADN tienda en 50 l de dH2O a -20 ° C. </li><li> Diseño de cebadores directo e inverso usando software o manualmente para la amplificación de P. genes falciparum PF3D7_1361800, PF3D7_0925900, PF3D7_1436300 y PF3D7_0114100 previamente identificadas en los estudios de proteoma 16,18 con sitios de restricción apropiados que permitan la clonación de las secuencias de genes en los sitios de clonación múltiple del plásmido de expresión pT7CFE1-CHIS como se muestra en la Tabla 2. </li><li> Hacer un 50 l mezcla de reacción mediante la adición; 5 l de aislados P. falciparum ADN genómico, 5 l de tampón 10x, 5μl de MgCl2, 1,5 l de cebador directo, 1,5 l decebador inverso, 0,5 l de ADN polimerasa T7 y 31,5 l de dH 2 O y realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a 94 ° C durante 8 minutos para la desnaturalización, 50 ° C durante 1 min 30 seg para la extensión y 72 ° C durante 9 min para el recocido y renaturalización para amplificar genes mostrados en la Tabla 1. </li><li> Productos de PCR separados sobre 1% gel de agarosa (1 g de agarosa y 100 ml de Tris EDTA acetato (TAE) buffer) 32. </li><li> Cortar las bandas de ADN amplificados por PCR a partir del gel de agarosa, colocar las rodajas de gel que contienen ADN en una columna de centrifugación de extracción de gel de ADN y congelar a -20 ° C durante 5 min. Añadir 100 l de isopropanol a las rodajas de gel congelado y centrifugar a 14.000 xg durante 5 min. </li><li> Medir el flujo a través acuosa filtrada en el tubo de recogida de la etapa 2.5, utilizando una micropipeta y transferir a un tubo nuevo. Añadir 0,1 vol de 5 M de acetato de sodio y centrifugar a 14.000 xg durante 5 min. Descartar el sobrenadante y añadir 10 l de dH2O a thsedimento de ADN e. </li><li> Digerir el vector de expresión pT7CFE1-CHIS y fragmentos de ADN purificado (de 2,6) en dos tubos separados mediante la adición de 3 l de plásmido y 5 l de PCR productos génicos a cada tubo. Añadir a cada tubo, 1 l de enzimas de restricción específicas, 2 l de tampón de reacción y 14 l de dH 2 O. </li><li> Añadir 3 l de plásmido digerido, 5 l de fragmentos de ADN digeridos, 2 l de tampón de ligasa 10x, 1 l de ligasa y 9 l de dH 2 O en un tubo de microcentrífuga. Se incuba a 12 ° CO / N. </li><li> Añadir 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3 M a pH 5,5 y 2 volúmenes de etanol (si su volumen de tubos de ligadura es 20 l añadir 2 l de 3 M de acetato de sodio + 44 l de etanol) para el tubo desde el paso 2.14. Mezclar bien e incubar a -20 ° C durante 15 min. </li><li> Centrifugar el tubo a 14.000 xg durante 15 min. Retirar con cuidado el sobrenadante utilizando una pipeta micro sin perturbar el sedimento. </li><li> Añadir 100 l de etanol al 70% to el sedimento de la etapa 2.10. Centrifugar el tubo a 14.000 xg durante 5 min. Retire y deseche el sobrenadante. Añadir 10 l de agua libre de nucleasa con el sedimento de ADN. </li></ol> 3. Proteína Expresión Uso en Vitro Cell Humano Sistema Libre Expresión <ol><li> Preparar 20 l de mezcla de transcripción mediante la medición de 2 l de la pT7CFE1-CHIS plásmido de ADN recombinante, 4 l de 5x tampón de transcripción, 4 l de mezcla NTP, 2 l de T7 RNA polimerasa y 8 l de agua libre de nucleasa para 2 pasos Humano en Vitro Protein Expression utilizando moldes de ADN. Mezclar los componentes en un tubo de microcentrífuga y se incuba durante 75 min a 30 ° C en un baño de agua. </li><li> Tome 2 l de la mezcla de transcripción y añadirlo a 23 l de mezcla de traducción que contiene 12,5 l de lisado de células HeLa, 2,5 l de proteínas accesorias, 1 l de solución de sal A, 0,5 l de aminoácidos Met, 0,5 l de aminoácidos Leu, 181; l de inhibidor de RNasa, 1,25 l de mezcla de energía y 3,75 l de agua libre de nucleasa. </li><li> Incubar la mezcla de traducción de la etapa 3.2 a 30 ° C durante 90 min. Tienda traducida productos a -20 ° C. </li><li> Preparar 25 l de transcripción y traducción mezcla añadiendo 3 l de la pT7CFE1-Chis plásmido de ADN recombinante, 2 l de agua libre de nucleasa, 5 l de mezcla de reacción, 12,5 l de lisado de HeLa y 2,5 l de proteínas accesorias durante 1 a paso Junto Expresión IVT proteína humana para las plantillas de ADN. </li><li> Incubar la mezcla de reacción de la etapa 3.4 para 90 min a 6 horas a 30 ° C. Guarde los productos de traducción a -20 ° C. </li></ol> 4. Purificación de proteínas recombinantes expresadas <ol><li> Añadir 75 l de tampón de purificación 1x a 25 l de producto de traducción para hacer 100 l de mezcla de purificación. </li><li> Añadir 100 l de resina quelante de níquel de 100 l de mixto de purificaciónUre. Lavar Ni-resina dos veces añadiendo 300 l de dH 2 O y 300 l de tampón de unión. Vuelva a suspender la resina y se centrifuga a 14.000 xg durante 1 min para eliminar el exceso de etanol. </li><li> Añadir 100 l de mezcla de purificación de la etapa 4,2 a 100 l de resina quelante de níquel e incubar la mezcla durante 60 min a TA. </li><li> Centrifugar la mezcla a 14.000 xg durante 1 min y recoger el sobrenadante en un tubo nuevo etiquetado como &quot;flujo a través&quot;. </li><li> Resina Lavar con 100 l de tampón de lavado 1x (imidazol 20 mM, NaH 2 PO 4 a pH 8, NaCl 2,5 M y dH 2 O 250). Se centrifuga a 14.000 xg durante 1 min y recoger el sobrenadante en un tubo nuevo etiquetado &quot;lavado&quot;. Repita el paso 4.5 en dos ocasiones. </li><li> Añadir 100 l de tampón de elución 1x (100 mM de imidazol, 250 mM Na 2 PO 4 a pH 8,0, 2,5 M NaCl y dH 2 O) a la resina y se incuba durante 15 min. Se centrifuga a 14.000 xg durante 1 min. Hacer el paso de elución dos veces. Cadatiempo de recoger el sobrenadante en tubos de microcentrífuga frescas y etiqueta como &quot;eluato&quot;. </li><li> Después de la elución, se lava la resina dos veces como se describe en el paso 4.5. Tienda fluya a través, lavados y muestras de elución a -20 ° C o inferior. Resina debe almacenarse a 4 ° C. Utilice 30 l de cada muestra para SDS-PAGE y análisis de inmunotransferencia. </li></ol> 5. Coomassie (Bradford) de ensayo de proteínas 34 <ol><li> Preparar soluciones de albúmina de suero bovino (BSA) estándar con la concentración de 20 mg / ml (mezcla de 10 l de BSA (2 mg / ml) y 90 l de dH 2 O), 40 mg / ml (mezcla de 20 l de BSA (2 mg / ml) y 80 l de dH 2 O), 60 mg / ml (mezclar 30 l de BSA (2 mg / ml) y 70 l de dH 2 O), 80 mg / ml (mezcla de 40 l de BSA (2 mg / ml) y 60 l de dH 2 O), 100 g / ml (mezclar 50 l de BSA (2 mg / ml) y 50 l de dH 2 O), 160 g / ml (mezcla de 80 l de BSA (2 mg / ml) y 20 l de dH2 O) y 200 g / ml (100 l de BSA (2 mg / ml). </li><li> Medida 5 l de flujo a través, lavados y muestras de eluato de la etapa 4.7. Añadir 95 l de dH 2 O. </li><li> Añadir 5 ml de reactivo de azul de Coomassie a las mezclas de los pasos 5.1 y 5.2. Cubrir los tubos con parafilm y se vórtice durante 10 segundos y luego se incuba durante 20 min a TA. </li><li> El uso de un espectrofotómetro, medir la densidad óptica (DO) a longitud de onda de 650 nm para los tubos de proteínas de paso 5.3. Concentración Parcela vs. lectura de DO para determinar las concentraciones de proteínas 34. </li></ol> 6. Western Blotting <ol><li> Añadir 5 l de extractos de esquizontes de P. falciparum, 2 l de Escherichia coli expresó rhOP-3 proteínas recombinantes 31, 5 l de proteínas recombinantes expresadas usando 2-paso 1 y paso en sistemas de expresión in vitro humanos y 10 l de productos de proteína purificada utilizando el método de afinidad para separar los tubos. </li&gt; <li> Añadir tampón de muestra de electroforesis que contiene mercaptoetanol a cada tubo para un volumen final de 20 l para hacer muestras de proteínas solubilizadas. Hervir tubos durante 2 min. </li><li> Cargar muestras de proteínas solubilizadas en 10% en geles de SDS-PAGE para separar las proteínas. </li><li> Traslado proteínas separadas a partir de geles de SDS-PAGE a papel de nitrocelulosa (PNC) por electroforesis a 35 mA por gel en una cámara de Western Blot semi-seco durante 2 horas. </li><li> Bloquear PNC después de la transferencia con 2% de leche sin grasa. </li><li> Incubar bloqueado PCN con los siguientes anticuerpos policlonales diluidos 1: 100 en 2% de leche para realizar el Western Blot; anticuerpo de conejo # 676 21 específico para P. rhoptries merozoitos falciparum, anticuerpos de ratón 20 específicos para P. yoelii y P. rhoptries merozoitos berghei, antisueros # 685 específicos para el P. falciparum proteína vacuola parasitófora, SERA (rico antígeno serina) 22 y los anticuerpos específicos para el Maurer217; s de proteínas leporino PFMC-2 ™ 28. </li><li> Incubar los PNC también en 1: 100 ratones y suero de conejo y de sobrenadante de cultivo gastado (SCS) a partir de células de mieloma SP2 como controles negativos normales diluidas. </li><li> Incubar los PNC con anticuerpos y controles a 4 ºC O / N. </li><li> Wash PCN 4x con tampón Blot e incubar PCN con especies anticuerpos secundarios específicos conjugados con peroxidasa de rábano (HRP) diluido 1: 1.000 en 2% de leche. </li><li> Lavar PNC 4x con tampón Blot. Incubar lavó PCN con la solución de desarrollo de color A + B (Solución A: añadir 50 ml de 1x Blot tampón y 30 l de H 2 O 2; Solución B: añadir 10 ml de metanol y 30 mg de 3-cloro-naftol) para 30 min en la oscuridad. Analizar los resultados de Western blot colorimétricamente. </li></ol>

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Y., Shio, H., Perkins, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretion+of+Plasmodium+falciparum.+rhoptry+protein+into+plasma+membrane+of+host+erythrocytes.">Secretion of Plasmodium falciparum. rhoptry protein into plasma membrane of host erythrocytes.</a> J Cell Biol. 106 (5), 1507-1513 (1988).</li><li>Sundaresh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+humoral+immune+responses+in+protein+microarrays+using+DNA+microarray+data+analysis+techniques.">Identification of humoral immune responses in protein microarrays using DNA microarray data analysis techniques.</a> Bioinformatics. 22 (14), 1760-1766 (2006).</li><li>Terpe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+bacterial+expression+systems+for+heterologous+protein+production:+from+molecular+and+biochemical+fundamentals+to+commercial+systems.">Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).</li><li>Trager, W., Jensen, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+malaria+parasites+in+continuous+culture.">Human malaria parasites in continuous culture.</a> Science. 193 (4254), 673-675 (1976).</li><li>Tsarukyanova, I., Drazba, J. A., Fujioka, H., Yadav, S., Sam-Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteins+of+the+Plasmodium+falciparum.+two+transmembrane+Maurer&#8217;s+cleft+protein+family,+PfMC-2TM+and+the+130+kDa+Maurer&#8217;s+cleft+protein+define+different+domains+of+the+infected+erythrocyte+intramembranous+network.">Proteins of the Plasmodium falciparum. two transmembrane Maurer&#8217;s cleft protein family, PfMC-2TM and the 130 kDa Maurer&#8217;s cleft protein define different domains of the infected erythrocyte intramembranous network.</a> Parasitol Res. 104 (4), 875-891 (2009).</li><li>Tsuboi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wheat+germ+cell-free+system-based+production+of+malaria+proteins+for+discovery+of+novel+vaccine+candidates.">Wheat germ cell-free system-based production of malaria proteins for discovery of novel vaccine candidates.</a> Infect. Immun. 76 (4), 1702-1708 (2008).</li><li>Tsuboi, T., Takeo, S., Sawasaki, T., Torii, M., Endo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+efficient+approach+to+the+production+of+vaccines+against+the+malaria+parasite.">An efficient approach to the production of vaccines against the malaria parasite.</a> Methods in Mol. Biol. 607, 73-83 (2010).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+protein+microarray+platform+enabling+antibody+profiling+against+denatured+proteins.">A versatile protein microarray platform enabling antibody profiling against denatured proteins.</a> Proteomics Clin. Appl. 7 (5-6), 378-383 (2013).</li><li>Wang, T., Fujioka, H., Drazba, J. A., Sam-Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhop-3+protein+conservation+among+Plasmodium.">Rhop-3 protein conservation among Plasmodium.</a> species and induced protection against lethal. 99 (3), 238-252 (2006).</li><li>Yadavalli, R., Ledger, C., Sam Yellowe, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+human+cell+free+expression+for+synthesis+of+malaria+proteins.">In vitro human cell free expression for synthesis of malaria proteins.</a> Parasitol Res. 111 (6), 2461-2465 (2012).</li><li>Machida, K., Masutan, M., Imataka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Synthesis+in+vitro.:+Cell-Free+Systems+Derived+from+Human+Cells.">Protein Synthesis in vitro.: Cell-Free Systems Derived from Human Cells.</a> Intech. , (2012).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantification+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li></ol>

We do not have any competing financial interests in this study.

Los pasos importantes para la expresión con éxito de proteínas usando dos etapas en el sistema libre de células humanas in vitro la expresión y purificación son: 1) la amplificación y clonación de genes en pT7CFE-CHIS plásmido vector éxito; 2) la transcripción de ARN a 30 ° C; 3) la traducción de proteína a 30 ° C en presencia de inhibidor de RNasa; 4) el desarrollo del protocolo de purificación de afinidad basada usando perlas de resina recubiertas con Ni y 5) el análisis de resultados en we...

En la investigación de la malaria, la expresión de proteínas inmunogénicas utilizando sistemas basados ​​en células procariotas o eucariotas sigue siendo un reto. La riqueza AT del genoma de Plasmodium y los mecanismos de post traduccionales desconocidos 14,7, contribuyen a las dificultades asociadas a la obtención de proteínas correctamente plegadas y inmunogénicas para los estudios de producción de anticuerpos y vacunas. Sistemas procariotas tales como Escherichia coli se han utilizado para la expresión de proteína recombinante. Sistemas procariotas son de bajo costo, eficaces, producen altos rendimientos de proteína recombinante y tienen múltiples vectores de clonación. Anfitrión E. coli células son fáciles de transformar y células crecen rápidamente. Sin embargo, los sistemas procariotas tienen limitaciones tales como la falta de sustitución de aminoácidos, modificación post-traduccional, riesgo de contaminación, productos heterogéneos y acumulación de proteínas recombinantes dentro de cuerpos de inclusión 24. En unestudio de Mehlin et al (2006)., 1000 marcos de lectura abierta (ORF) se expresaron. Aproximadamente el 7% de las proteínas expresadas eran soluble 14. La insolubilidad observado es debido a la naturaleza sesgada de los genes y la alta frecuencia de los codones que se utilizan idealmente por el Plasmodium rica en AT del genoma 14. Una estrategia alternativa para superar este problema se ha desarrollado mediante el uso de plásmidos o células huésped que contienen tRNAs que reconocen codones o codones que coincidan con las frecuencias 3 raras. Incluso después de realizar estas optimizaciones, porciones muy pequeñas de proteínas se expresan como soluble, activo e inmunogénica 14. Los sistemas de expresión sin células contienen todos los componentes necesarios para la transcripción y la traducción, tales como ribosomas, factores de iniciación, factores de elongación (traducciones factores), tRNA y aminoacil-tRNA sintetasas. Ambas reacciones de transcripción y traducción se acoplan en el procedimiento de un solo paso 11,29. El transcription reacción se realiza en un tubo antes de cantidad apropiada de mRNA se incuba con maquinaria de traducción en un 11,29 tubo diferente. Aunque estos métodos tienen éxito en Plasmodium sp. Expresión de proteínas, un inconveniente importante es la longitud de tiempo para la expresión de la proteína, que es aproximadamente 22 hr 29. Además, el alto costo de los suministros para su inclusión en los protocolos 29, los preparativos de trabajo intensivo del lisado celular e inconsistencias en los preparativos de los componentes, hacen de estos sistemas inalcanzable. El objetivo principal de los investigadores para el desarrollo de un sistema de expresión libre de células depende de factores tales como la modificación genética rápida, los rendimientos rápidos con altas concentraciones y preparaciones de lisado adelante rectas 1. Sistemas eucariotas como las levaduras, las líneas celulares de mamíferos, baculovirus sistema de expresión mediada, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum y sistemas de expresión parasitarias Doch como Leishmania se han utilizado para la expresión de proteína recombinante 7. Sistemas eucariotas comparten relación filogenética y por lo tanto también comparten características como la glicosilación, acilación, la formación de enlaces disulfuro, la interacción chaperona, la proteolisis y la compartimentación subcelular. Eventos secreción de proteínas en eucariotas evitar la acumulación y disminuye la toxicidad para los sistemas de expresión 13. Se prefiere el uso de sistemas de levadura, ya que son adecuados para la expresión de proteínas en gran escala y para la obtención de altos rendimientos 4. Dos P. proteínas falciparum PFCP-29 y Pvs25 se produjeron utilizando el sistema de levadura 4. Sin embargo, un inconveniente importante en la síntesis de la mayoría de las proteínas era patrones irregulares de N y O-glicosilación, plegado y truncamiento de proteínas a partir de su forma nativa 4 inadecuada. El uso de células de mamíferos para la síntesis de proteínas recombinantes es un trabajo intensivo y se Expensive para mantener las líneas celulares recombinantes estables 4. Por lo tanto, las células de mamíferos se han limitado para el análisis de señalización de la proteína, interacciones proteína y las interacciones parásito-huésped y también para el ensayo de vacunas de ADN 4. El ADN humano y vitro sistema libre de células mRNA en la expresión de proteínas se describe en el presente documento es un sistema de base de mamífero derivado de células HeLa que expresa las proteínas en 3 hr. Las proteínas expresadas utilizando vector de expresión pT7CFE1-Chis haber una etiqueta C-terminal de facilitar la identificación y purificación. El sistema basado en HeLa se complementa con factores de iniciación de la traducción y un regulador de la traducción, mejorando así la eficiencia del sistema de traducción. Las proteínas se pueden traducir rápidamente, examinados, verificados y procesados ​​para su uso en diversas aplicaciones inmunológicas y estructurales 15. Los sistemas de expresión libres de células eucariotas tales como germen de trigo y de reticulocitos de conejo se utilizan actualmente para la expresión de varproteínas eucariotas pagarés incluyendo proteínas de Plasmodium 11,29. Además, E. sistemas libres de células basados ​​coli también se emplean para la expresión de la proteína eucariota 11. La Tabla 1 resume los diferentes sistemas de expresión libre de células mediante la comparación de características de los sistemas, así como la facilidad de uso de los sistemas para la expresión de proteínas. El sistema libre de células humana en comparación con los otros tiene la capacidad de realizar modificaciones post y co-traduccional y es menos costoso. La optimización de codones es posible y todas las reacciones se puede realizar en 3 hr. El sistema de HeLa es un sistema de traducción ideal para la síntesis de proteínas en el entorno de laboratorio. Una ventaja importante de los sistemas de expresión libre de células humanas sobre otros sistemas libres de células es la disponibilidad de varias líneas celulares diferentes derivadas de diferentes órganos y tejidos. Varias variedades de sistemas libres de células pueden ser diseñados dependiendo de la línea celular. El extracto des derivados de células de mamíferos tienen una mayor eficiencia para sintetizar proteínas grandes que cualquier otro sistema de expresión libre de células. Estos sistemas de expresión de células libres también se pueden utilizar en aplicaciones de diagnóstico y caracterización de proteínas tales como micro matrices 30. Los populares líneas celulares HeLa son los más ampliamente utilizados para llevar a cabo la expresión de proteínas 33. El retículo endoplasmático en las líneas celulares HeLa es subdesarrollado, que conduce a la ausencia de actividad de modificación de la glicosilación post-traduccional 33. Sin embargo, se cree que este sistema a ser ventajoso para la síntesis de proteínas Plasmodium como Plasmodium también carece de modificación posterior a la traducción de glicosilación 29. El protocolo libre de transcripción-traducción de células HeLa es fácil de realizar, de bajo costo y las proteínas se puede expresar en 90 min, listo para la purificación y otras aplicaciones posteriores.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Two-step in vitro human cell free expression system</td>
			<td>Thermo fischer</td>
			<td>88856</td>
			<td>Discontinued. Always store at -80oC. Do not thaw in warm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>One-step in vitro coupled translation system</td>
			<td>Thermo fischer</td>
			<td>88860</td>
			<td>Always store at -80oC. Do not thaw in warm water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProBond Purification system</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>K850-01</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probond Nickel-Chelating Resin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R801-01</td>
			<td>Store at 4oC.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;A+ Human Blood</td>
			<td>Interstate Blood Bank</td>
			<td></td>
			<td>Store at 4oC.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

hela based cell free expression systems for expression of plasmodium rhoptry proteins

La malaria causa de morbilidad y mortalidad global significativo. Ninguna vacuna rutinaria está disponible actualmente. Una de las principales razones de la falta de una vacuna es el reto de identificar candidatos vacunales adecuados. Proteínas palúdicas expresan utilizando sistemas de expresión procariotas y eucariotas basados ​​en células están mal glicosilados, generalmente insolubles y se someten plegado inadecuada conduce a una inmunogenicidad reducida. Los sistemas de expresión libres de germen de trigo, lisado de reticulocitos de conejo y Escherichia coli lisado de células se utilizan actualmente para la expresión de las proteínas de la malaria. Sin embargo, la longitud de tiempo expresión y glicosilación inadecuada de proteínas sigue siendo un desafío. Demostramos la expresión de proteínas de Plasmodium in vitro utilizando sistemas de libre expresión basados ​​en células HeLa, denominados &quot;sistemas de expresión in vitro de células humanas libres&quot;. Los sistemas de la libre expresión basados ​​en células HeLa 2 transcriben mRNA en 75 min y 3 l de transcribed mRNA es suficiente para traducir proteínas en 90 min. El sistema de expresión 1-paso es una transcripción y traducción acoplada sistema de expresión; la transcripción y co-traducción se produce en 3 horas. El proceso también se puede extender durante 6 horas al proporcionar energía adicional. En el sistema de expresión de 2 a paso, el ARNm se transcribe primero y después se añadió a la mezcla de traducción de la expresión de la proteína. Describimos cómo expresar proteínas de la malaria; un hidrófobo Acantilado de PF3D7_0114100 Maurer - 2 proteína transmembrana (PFMC-2 ™), una proteína PF3D7_0925900 hidrófilo y un repeticiones armadillo que contienen proteínas PF3D7_1361800, utilizando el sistema de expresión libre de células HeLa basado. Las proteínas se expresan en micro volúmenes que emplean estrategias de expresión de 2 pasos y 1 pasos. Un método de purificación de afinidad para purificar 25 l de proteínas expresadas mediante el sistema de libre expresión in vitro de células humanas también se describe. Rendimiento de proteína se determina mediante el ensayo de Bradford y la expresóy proteínas purificadas se pueden confirmar por análisis de Western Blot. Proteínas recombinantes expresadas se pueden utilizar para inmunizaciones, inmunoensayos y secuenciación de proteínas.

Validación de las proteínas recombinantes expresadas a través de reactividad con anticuerpos específicos es un primer paso importante para confirmar el correcto plegamiento de las proteínas expresadas. Proteínas recombinantes malaria se expresaron mediante el paso y dos pasos en sistemas de expresión libre de células humanas in vitro. Las proteínas recombinantes son método de afinidad Ni-quelante purificada. A continuación, utiliza antisueros contra rhoptries merozoitos enteros en el Western Blot de SDS-PAGE ...

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HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

La expresión de proteínas de la malaria en sistemas basados ​​en células sigue siendo un reto. Demostramos dos sistemas de libre expresión de células de paso y un paso IVT (en la traducción in vitro) para expresar proteínas recombinantes rhoptry malaria a partir de células HeLa. Utilizamos un sistema de purificación basado en la afinidad de Ni-resina para purificar las proteínas rhoptry.

Sistemas basados ​​en células HeLa Expresión Libre de Expresión de<em&gt; Plasmodium</em&gt; rhoptry Proteínas

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

hela-based-cell-free-expression-systems-for-expression-plasmodium

Research

JoVE Journal

Biology

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

12.0K vistas.  Cleveland State University.  La expresión de proteínas de la malaria en sistemas basados ​​en células sigue siendo un reto. Demostramos dos sistemas de libre expresión de células de paso y un paso IVT (en la traducción in vitro) para expresar proteínas recombinantes rhoptry malaria a partir de células HeLa. Utilizamos un sistema de purificación basado en la afinidad de Ni-resina para purificar las proteínas rhoptry. 

Video: HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparación de cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina por electroporación

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Investigación

Biología

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Tinción de las proteínas en geles con Coomassie G-250, sin ácido disolvente orgánico y el acético

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizando el sistema de electroporación Gene Emisores MXcell para transfectar células primarias con alta eficiencia

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

El uso de un contador de células automatizado para simplificar estudios de expresión génica: siRNA Derribo de IL-4 la expresión génica en células dependientes Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Las secciones incluidas en parafina y congeladas de Drosophila Los músculos de Adultos

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

En la reconstitución in vitro de los activos T. castaneum telomerasa

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide different information. Flow cytometry gives quantitative multi-parametric information about physical characteristics and staining or expression, but doesn't allow for visualization. Stand-alone fluorescence microscopy provides visual data, but doesn't allow for straightforward quantitative measurements1.
Image-based cytometry bridges the gap between these two methods, enabling the quick visualization and simultaneous quantitative analysis of thousands of cells in heterogeneous populations2. Here, we present a method for performing cell viability and green fluorescent protein (GFP) expression assays using the Tali Image-Based Cytometer3. The Tali instrument is a 3-channel (bright field, green fluorescence, red fluorescence) benchtop assay platform that offers several advantages over flow cytometry and fluorescence microscopy. The Tali cytometer is less expensive, takes up less bench space, requires less maintenance, and the work flow has been simplified so that the operation and analysis is much simpler and quicker. The Tali cytometer is capable of performing a range of suspension cell-based assays, including GFP and red fluorescent protein (RFP) expression, apoptosis4-6 and cell viability analysis with propidium iodide (PI)7-11.
Here, we demonstrate the use of the Tali instrument in performing a cell viability assay in cells expressing GFP. GFP-transduced cells are stained using the Tali Viability Kit - Dead Cell Red. The cells are then pipetted into a Tali Cellular Analysis Slide and loaded into the cytometer. Bright field, red fluorescence and green fluorescence images are captured and analyzed using assay specific algorithms. Histograms are then generated to display cell size, PI fluorescence intensity, and GFP fluorescence intensity. These parameters can then be thresholded to home in on a specific cell population.
A side-by side comparison of the Tali Image-Based Cytometer and traditional flow cytometry demonstrates that the two methods provide comparable data regarding cell viability and protein expression. However, the Tali instrument provides additional visual information about the cell population that cannot be obtained using a flow cytometer.

This protocol describes how to perform cell viability and fluorescence expression assays using the Tali Image-Based Cytometer.

Evaluación de la expresión de GFP y viabilidad mediante el Tali basada en imágenes citómetro

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

Small-scale Nuclear Extracts for Functional Assays of Gene-expression Machineries

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems. For most studies, functional assays are carried out using extracts that are prepared in bulk from 10-50 or more liters of cells grown in suspension. However, these large-scale preparations are not amenable to rapidly testing in vitro effects that result from a variety of in vivo cellular treatments or conditions. This journal video article shows a method for preparing functional small-scale nuclear extracts, using HeLa cells as an example. This method is carried out using as few as three 150 mm plates of cells grown as adherent monolayers. To illustrate the efficiency of the small-scale extracts, we show that they are as active as bulk nuclear extracts for coupled RNA Polymerase II transcription/splicing reactions. To demonstrate the utility of the extract protocol, we show that splicing is abolished in extracts prepared from HeLa cells treated with the splicing inhibitor drug E7107. The small-scale protocol should be generally applicable to any process or cell type that can be investigated in vitro using cellular extracts. These include patient cells that are only available in limited quantities or cells exposed to numerous agents such as drugs, DNA damaging agents, RNAi, or transfection, which require the use of small cell populations. In addition, small amounts of freshly grown cells are convenient and/or required for some applications.

A protocol for preparation of robust, small-scale HeLa nuclear extracts is described. This protocol is valuable for assays that require use of small populations of cells, such as cells treated with drugs or RNAi. The method should be applicable to a wide variety of gene expression assays and other cell types, including patient cells.

Los pequeños extractos nucleares para ensayos funcionales de los mecanismos de expresión de genes

A great deal of progress in understanding gene expression has been made using in vitro systems.  For most studies, functional assays are carried out using ...

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for expressing proteins and genetic circuits in a controlled manner as well as for providing a prototyping environment for synthetic biology.2,3 To achieve the latter goal, cell-free expression systems that preserve endogenous Escherichia coli transcription-translation mechanisms are able to more accurately reflect in vivo cellular dynamics than those based on T7 RNA polymerase transcription. We describe the preparation and execution of an efficient endogenous E. coli based transcription-translation (TX-TL) cell-free expression system that can produce equivalent amounts of protein as T7-based systems at a 98% cost reduction to similar commercial systems.4,5 The preparation of buffers and crude cell extract are described, as well as the execution of a three tube TX-TL reaction. The entire protocol takes five days to prepare and yields enough material for up to 3000 single reactions in one preparation. Once prepared, each reaction takes under 8 hr from setup to data collection and analysis. Mechanisms of regulation and transcription exogenous to E. coli, such as lac/tet repressors and T7 RNA polymerase, can be supplemented.6 Endogenous properties, such as mRNA and DNA degradation rates, can also be adjusted.7 The TX-TL cell-free expression system has been demonstrated for large-scale circuit assembly, exploring biological phenomena, and expression of proteins under both T7- and endogenous promoters.6,8 Accompanying mathematical models are available.9,10 The resulting system has unique applications in synthetic biology as a prototyping environment, or "TX-TL biomolecular breadboard."

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

This five-day protocol outlines all steps, equipment, and supplemental software necessary for creating and running an efficient endogenous Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system from scratch. With reagents, the protocol takes 8 hours or less to setup a reaction, collect, and process data.

Los protocolos para la implementación de un<em&gt; Escherichia coli</emSistema&gt; Basado TX-TL-Cell de Libre Expresión de la biología sintética

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análisis de RNA Global Síntesis en el nivel de células individuales siguiente Hipoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Sistemas basados ​​en células HeLa Expresión Libre de Expresión de

Sistemas basados en células HeLa Expresión Libre de Expresión de