Agradecemos Jongmin Kim, Dan Siegal-Gaskins, Anu Thubagere, y Enoc Yeung asistencia racionalización del protocolo, y Clare Chen y Lee Barclay para la ayuda en las primeras etapas del proyecto. Este material está basado en trabajo apoyado en parte por la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa (DARPA / MTO) Programa Living Fundiciones, número de contrato HR0011-12-C-0065 (DARPA / CMO.ZZS está también apoyado por un Científico Médico UCLA / Caltech Programa de becas de formación y de un Departamento de Defensa, la Fuerza Aérea Oficina de Investigación Científica, Defensa Nacional de Ciencia e Ingeniería de Posgrado (NDSEG) Fellowship, 32 CFR 168. Las opiniones y conclusiones contenidas en este documento son las de los autores y no debe interpretarse como la representación de oficialmente las políticas, ya sea expresa o implícita, de la Agencia de Proyectos de Investigación Avanzada de Defensa o el Gobierno de los EE.UU..

<ol>
	<li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cell-free+genetic+circuit+assembly.">Principles of cell-free genetic circuit assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 12672-12677 (2003).</li><li>He, M. Y., He, Y. Z., Luo, Q., Wang, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+DNA+to+protein:+No+living+cells+required.">From DNA to protein: No living cells required.</a> Process Biochem. 46, 615-620 (2011).</li><li>Forster, A. C., Church, G. 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Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of biological engineering. 4, 8 (2010).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat Biotechnol. 19, 751-755 (2001).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox:+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells.">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> Acs Synth Biol. 1, 29-41 (2012).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+messenger+RNA+inactivation+and+protein+degradation+in+an+Escherichia+coli+cell-free+expression+system.">Study of messenger RNA inactivation and protein degradation in an Escherichia coli cell-free expression system.</a> Journal of biological engineering. 4, 9 (2010).</li><li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Replication,+Synthesis,+and+Assembly+of+the+Bacteriophage+T7+in+a+Single+Cell-Free+Reaction.">Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction.</a> Acs Synth Biol. 1, 408-413 (2012).</li><li>Siegal-Gaskins, D., Noireaux, V., Murray, R. M., Pao, L., Abramovitch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+resource+utilization+in+elementary+cell-free+gene+circuits.">Biomolecular resource utilization in elementary cell-free gene circuits.</a> , 1531-1536 (2013).</li><li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coarse-grained+dynamics+of+protein+synthesis+in+a+cell-free+system.">Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system.</a> Physical review letters. 106, 048104 (2011).</li><li>Hoagland, M. B., Stephenson, M. L., Scott, J. F., Hecht, L. I., Zamecnik, P. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Streamlining+Escherichia+coli+S30+extract+preparation+for+economical+cell-free+protein+synthesis.">Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology progress. 21, 460-465 (2005).</li><li>Andrianantoandro, E., Basu, S., Karig, D. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bacteriophage+T7+RNA+polymerase/promoter+system+for+controlled+exclusive+expression+of+specific+genes.">A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression of specific genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 1074-1078 (1985).</li><li>Lewicki, B. T., Margus, T., Remme, J., Nierhaus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+rRNA+transcription+and+ribosomal+assembly+in+vivo.+Formation+of+active+ribosomal+subunits+in+Escherichia+coli+requires+transcription+of+rRNA+genes+by+host+RNA+polymerase+which+cannot+be+replaced+by+bacteriophage+T7+RNA+polymerase.">Coupling of rRNA transcription and ribosomal assembly in vivo. Formation of active ribosomal subunits in Escherichia coli requires transcription of rRNA genes by host RNA polymerase which cannot be replaced by bacteriophage T7 RNA polymerase.</a> Journal of molecular biology. 231, 581-593 (1993).</li><li>Iskakova, M. B., Szaflarski, W., Dreyfus, M., Remme, J., Nierhaus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+coupled+in+vitro+transcription-translation+system+derived+from+Escherichia+coli+cells:+synthesis+of+high-yield+fully+active+proteins.">Troubleshooting coupled in vitro transcription-translation system derived from Escherichia coli cells: synthesis of high-yield fully active proteins.</a> Nucleic acids research. 34, e135 (2006).</li><li>Kigawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Escherichia+coli+cell+extract+for+highly+productive+cell-free+protein+expression.">Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression.</a> Journal of structural and. 5, 63-68 (2004).</li><li>Matsuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cell-free+protein+synthesis+for+stable-isotope+labeling.">Improving cell-free protein synthesis for stable-isotope labeling.</a> Journal of biomolecular. NMR. 37, 225-229 (2007).</li><li>Sitaraman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+cell-free+protein+synthesis+system.">A novel cell-free protein synthesis system.</a> Journal of biotechnology. 110, 257-263 (2004).</li><li>Becskei, A., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+stability+in+gene+networks+by+autoregulation.">Engineering stability in gene networks by autoregulation.</a> Nature. 405, 590-593 (2000).</li><li>Maeda, H., Fujita, N., Ishihama, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Competition+among+seven+Escherichia+coli+sigma+subunits:+relative+binding+affinities+to+the+core+RNA+polymerase.">Competition among seven Escherichia coli sigma subunits: relative binding affinities to the core RNA polymerase.</a> Nucleic acids research. 28, 3497-3503 (2000).</li><li>Caschera, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coping+with+complexity:+machine+learning+optimization+of+cell-free+protein+synthesis.">Coping with complexity: machine learning optimization of cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology and bioengineering. 108, 2218-2228 (2011).</li><li>Hodgman, C. E., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+synthetic+biology:+thinking+outside+the+cell.">Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell.</a> Metabolic engineering. 14, 261-269 (2012).</li><li>Elowitz, M. B., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+synthetic+oscillatory+network+of+transcriptional+regulators.">A synthetic oscillatory network of transcriptional regulators.</a> Nature. 403, 335-338 (2000).</li><li>Tsuruta, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-level+production+of+amorpha-4,11-diene,+a+precursor+of+the+antimalarial+agent+artemisinin,+in+Escherichia+coli.">High-level production of amorpha-4,11-diene, a precursor of the antimalarial agent artemisinin, in Escherichia coli.</a> Plos One. 4, e4489 (2009).</li><li>Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+of+a+genetic+toggle+switch+in+Escherichia+coli.">Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli.</a> Nature. 403, 339-342 (2000).</li><li>Jewett, M. C., Forster, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+designing+and+building+minimal+cells.">Update on designing and building minimal cells.</a> Current opinion in biotechnology. 21, 697-703 (2010).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17669-17674 (2004).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Sistema de expresión libre de células TX-TL basado La Escherichia coli endógeno descrito aquí es una reacción simple-to-run de tres tubos que pueden tener menos de ocho horas de creado para la recopilación de datos. El proceso de creación de todos los reactivos requiere un total de cinco días de tiempo (con requisitos laborales importantes en un solo día), pero produce extracto crudo de 3.000 reacciones y el tampón de decisiones reactivos para 10.000 reacciones (Figura 1). Por otra parte, el extracto crudo y amortiguan de decisiones reactivos son estables durante al menos 1 año a -80 ° C, lo que permite múltiples usos de una preparación de 4. A $ 0,11 por 10 l de reacción (0,26 dólares incluyendo mano de obra), los costos son 98% más bajo que comparables sistemas comerciales (Figura 2). Hay algunas limitaciones sin resolver, sin embargo, para el sistema. La eficiencia final de cada preparación de extracto celular crudo puede variar en función de la aptitud del usuario y de las condiciones ambientales, aunque tla variación del rendimiento RUEBAS es entre 5-10% (Figura 4b). Como resultado, la variabilidad de lote a lote en tanto la expresión de punto final y en la dinámica de la expresión son de esperar. Estas variaciones probablemente se mantendrá hasta que el extracto está completamente caracterizado, o hasta que la creación de extracto está totalmente automatizado. Si el sistema de expresión libre de células se utiliza para llevar a cabo experimentos cuantitativos sensibles, es aconsejable ejecutar todos los experimentos con el mismo lote de extracto celular crudo. El rendimiento de un solo lote extracto celular crudo, unos 3.000 reacciones, debe ser suficiente para los cursos típicas experimentales. Aunque sospechamos variación puede ser removido por la ampliación y la automatización del procedimiento, tales intentos implicarían una inversión sustancial de recursos. Además, si bien los niveles de punto final de expresión son razonablemente fáciles de determinar, aún queda trabajo por hacer en la dinámica de la comprensión intrínsecas al sistema libre de células. Se sabe que tanto COMPETENCIA recursosn de recursos y limitación puede afectar la dinámica de expresión. Por ejemplo, limitada Sigma endógeno 70 puede dar lugar a un régimen de saturar con el aumento de la plantilla de ADN que produce un perfil de expresión análoga a la de nucleótidos o aminoácidos agotamiento. 9,27 Sin embargo, la dinámica no tienen que ser entendidos completamente para utilizar el sistema. Para los aumentos puros de rendimiento, optimización se puede hacer mediante métodos de aprendizaje automático. 28 Cuestiones de competencia por los recursos y la limitación pueden ser abordadas por los modelos matemáticos verificó utilizando datos experimentales. El protocolo que se presenta aquí está optimizado para una cepa BL21-Rosetta2, pero es generalizable a otras E. cepas de E. coli. Modificaciones en BL21-Rosetta2, tales como la eliminación del gen que codifica la proteasa lon y la adición de genes que codifican los ARNt raros, permiten para la producción máxima de proteínas. Hemos tratado el protocolo con otras dos cepas de extracto - sólo BL21 y un golpe de gracia-una BL21 trxAd encontraron 50% menos de producción de proteína. Nuestra hipótesis es que los rendimientos disminuyen de manera similar cuando se utilizan otras cepas. Otros cambios en los parámetros, tales como la conmutación de medio de crecimiento 2xYT para LB y otros caldos ricos, han dado lugar a la producción de proteína disminuido. Sistemas de expresión sin células utilizando tanto la maquinaria de transcripción-traducción endógeno y exógeno y los mecanismos de regulación tienen amplias aplicaciones en proteínas y expresión metabolito y de la biología sintética. 3,29 En vez de estar limitado a los circuitos T7-regulada, se puede imaginar la producción de biomoléculas complejas en un entorno controlable por el usuario usando una mezcla de E. nativa promotores coli y mecanismos de transcripción y regulación suministrados exógenamente. Sin limitaciones de la división celular y el metabolismo, la variabilidad en los circuitos sintéticos tales como el Represilador o en las vías metabólicas de ingeniería tales como los que producen artemisinina se puede reducir o mejor entendida. 30,31 Have utilizado estas ventajas para implementar interruptores genéticos, así como para entender sigma factor de secuestro de 9,32 Dicha tecnología también puede formar la columna vertebral de la &quot;mínima&quot; o células &quot;artificiales&quot; -. pequeño, bien caracterizado y unidades encarnados autosuficientes de extracto de 33,34. En última instancia, esperamos usos inmediatos de este sistema de expresión libre de células endógenas como un entorno de creación de prototipos para la biología sintética. Apodado el &quot;TX-TL breadboard biomolecular&quot;, el sistema de expresión libre de células proporciona un entorno controlable donde los circuitos sintéticos cuyo destino final es la expresión in vivo pueden someterse a rondas de prototipos - ciclos de pruebas en el plásmido básico, lineal, o ADN sintetizado químicamente, seguido por el análisis y la modificación rápida. Rondas prototipos pueden ser ayudados por los modelos matemáticos predictivos que se están desarrollando actualmente. Mediante la eliminación de la clonación y la manipulación en vivo para circuitos no finales, anticipamos ingenieríatiempos de ciclo niería para ser reducidos a 1-3 días en lugar de los estándar actuales semana.

A correction to Figure 5's legend has been made for the article <a href="http://www.jove.com/video/50762/protocols-for-implementing-an-escherichia-coli-based-tx-tl-cell-free">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology</a>. Method 1 and method 2 have been switched.Z
The figure legend was update from:
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1 nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 1) or post-processed with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 2).
to
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1
nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 2) or post-processed
with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 1).

A correction to Figure 5's legend has been made for the article Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Method 1 and method 2 have been switched.

Erratum: Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Tecnología de expresión libre de células se inició en la década de 1950 como puramente traslacional, avanzando año más tarde para incluir mecanismos de transcripción-traducción acopladas utilizando el ADN del bacteriófago T7. 11,12 Desde entonces, se han realizado numerosos esfuerzos para optimizar la creación de extracto celular crudo (o E . extracto coli S30). 13,14 Estas optimizaciones incluyen la prolongación de la síntesis de proteínas libre de células a través de la regeneración de ATP o modificaciones de tensión y reduciendo el tiempo de protocolo y el costo. existen 15-17 sistemas de expresión de células libres alternativos que uso reconstituido componentes en lugar de crudo extracto de células para la expresión. 5 Tanto extracto celular crudo y métodos de reconstitución se han desarrollado para uso comercial. Con el advenimiento de la biología sintética, existe una mayor necesidad de una plataforma bien caracterizado para probar y expresar módulos y circuitos biológicos de ingeniería. 18,19 Esta plataforma debe serversátil, bien caracterizado, fácil de manipular, y se centró en los componentes suministrados por el usuario. A pesar de haber desarrollado la mitad de un siglo antes, los sistemas libres de células basadas en E. coli intrínsecamente compartir estos requisitos, ya que son una representación simplificada en vitro de procesos celulares sin la complejidad de crecimiento y el metabolismo. Además, todos los conocimientos básicos de trabajo en vivo en E. coli se aplica fácilmente a E. sistemas libres de células de E. coli. Aunque los sistemas de expresión de células libres pueden tener aplicaciones en la biología sintética, hasta la fecha el objetivo de la mayoría de los sistemas de expresión de células libres ha sido la maximización de la proteína y la producción de metabolitos. Esto se logra mediante el uso de bacteriófago T7 transcripción de secuencias conducidos por promotores T7. 20 Aunque la expresión es eficiente y robusta, estos sistemas sirven a un propósito altamente especializado. Métodos de regulación de la célula son limitados, las plantillas de ADN de destino deben serrediseñados para incluir promotores T7, y ciertas secuencias tales como complejos ribosómicos no se pueden transcribir y ensamblados. 21,22 sistemas de expresión libres de células existentes son incapaces de mantener altos rendimientos preservando al mismo tiempo los mecanismos de regulación endógenos, una versatilidad necesaria para la biología sintética. Hemos desarrollado una E. endógena sistema de expresión libre de células coli que conserva la eficiencia de la expresión de la proteína demostrado por los sistemas anteriores pero añade versatilidad adicional al permitir la expresión y la regulación sobre la base de ambos mecanismos (T7 u otros) endógeno y exógeno. El protocolo descrito aquí está basada originalmente en Kigawa et al. (2004) y Liu et al. (2005), pero tiene importantes modificaciones. Se utiliza Mg y K-glutamato sobre Mg-y K-acetato de etilo para aumentar la eficiencia, quita 2-mercaptoetanol, y la lisis de las células usando un cordón-batidor. 17,23,24 bolas-latidos se elige sobre la homogeneización,métodos basados ​​en la presión, o sonicación debido a su menor coste y rendimientos comparables a los sistemas de la competencia. 23 ácido 3-fosfoglicérico (3-PGA) se utiliza como la fuente de energía ya que se encontró para dar rendimientos de proteínas superiores en comparación con el fosfato de creatina y fosfoenolpiruvato. 4,25 Nuestro sistema puede producir hasta 0,75 mg / ml de proteína indicadora utilizando un promotor con sede en sigma70 con los operadores-fago lambda o un promotor T7 impulsado, de forma similar a los rendimientos procedentes de otros sistemas comerciales. 4,6 Cinco días son necesarias para producir todos los reactivos necesarios (Figura 1). Además, proporciona una reducción de costes del 98% en comparación con los sistemas comparables de células libres de comerciales - costes de material son de $ 0.11 por 10 l de reacción, que se eleva a 0,26 dólares, con mano de obra incluida (Figura 2).

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2xYT</td>
 <td>MP biomedicals</td>
 <td>3012-032</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>3-PGA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8877</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ATP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A8937</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bacto-agar</td>
 <td>BD Diagnostics</td>
 <td>214010</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bead-beating tubes (polypropylene microvials)</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>522S</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Beads, 0.1mm dia.</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>11079101</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>BL21 Rosetta 2 E. coli strain</td>
 <td>Novagen</td>
 <td>71402</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bradford BSA Protein Assay Kit</td>
 <td>Bio-rad</td>
 <td>500-0201</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>cAMP</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>A9501</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chloramphenicol</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C1919</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CoA</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>C4282</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>14121</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cuvettes, 1.5ml</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>14-955-127</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>D0632</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Folinic acid</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>F7878</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>16800</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HEPES</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>H6147</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>K-glutamate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>G1149</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mg-glutamate</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>49605</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Micro Bio-Spin Chromatography Columns</td>
 <td>Bio-Rad</td>
 <td>732-6204</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NAD</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>N6522</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nunc 384-well optical bottom plates</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>142761</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nunc sealing tape</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>232701</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PEG-8000</td>
 <td>Promega</td>
 <td>V3011</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate dibasic solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8584</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Potassium phosphate monobasic solution</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>P8709</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RTS Amino Acid Sampler</td>
 <td>5 Prime</td>
 <td>2401530</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes, 10k MWCO (Kit)</td>
 <td>Thermo-Scientific</td>
 <td>66382</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Spermidine</td>
 <td>Sigma-Aldrich</td>
 <td>85558</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tris base</td>
 <td>Fischer</td>
 <td>BP1521</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>tRNA (from E. coli)</td>
 <td>Roche Applied Science</td>
 <td>MRE600</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>UTP</td>
 <td>USB</td>
 <td>23160</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1L Centrifuge Bottle</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>A98813</td>
 <td>This is specific for Avanti J-series; obtain equivalent size for centrifuge in use.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4L Erlenmeyer Flask</td>
 <td>Kimble Chase</td>
 <td>26500-4000</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Avanti J-26XP Centrifuge</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>393127</td>
 <td>Or 1L-capable centrifuge equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Forma 480 Orbital Shaker</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>480</td>
 <td>Or chest-size 6x4L shaker equivalent.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>JLA-8.1000 Rotor</td>
 <td>Beckman-Coulter</td>
 <td>363688</td>
 <td>Or 1L-capable, 5000 x g rotor equivalent for centrifuge.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mini-Beadbeater-1</td>
 <td>BioSpec</td>
 <td>3110BX</td>
 <td>&nbsp;</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>
Supplemental Material 1. Recipes for Items. 
Chloramphenicol, 34 mg/ml: Prepare 0.51 g chloramphenicol and add ethanol to 15 ml. Filter sterilize (0.22 &mu;M), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 &deg;C for later use. 
2xYT+P+Cm agar plate: Prepare 1.24 g 2xYT, 1.6 ml potassium phosphate dibasic solution @ 1 M, 0.88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, 0.6 g agar, and water to 40 ml. Autoclave. Let cool to 50 &deg;C and add 40 &mu;l Cm. Aliquot 25 ml into a 100x15 mm petri dish, and let cool for an hour. 
2xYT+P media: Prepare 124 g 2xYT, 160 ml potassium phosphate dibasic solution @1 M, 88 ml potassium phosphate monobasic solution @ 1 M, and water to 4 L. Aliquot out into 2x1.88 L and 0.24 L. Autoclave. 
Tris base, 2 M: Prepare 60.57 g Tris base and water to 250 ml. Sterilize, store at RT for later use. 
DTT, 1 M: Prepare 2.31 g DTT and water to 15 ml. Filter sterilize (0.22 &mu;M), aliquot to 1 ml tubes, store at -20 &deg;C for later use. 
S30A buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, 50 ml Tris at 2M, acetic acid (to pH 7.7), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 &deg;C, add 4 ml 1 M DTT before use. 
S30B buffer: Prepare 10.88 g Mg-glutamate and 24.39 g K-glutamate, Tris at 2 M (to pH 8.2), and water to 2 L. Autoclave, store at 4 &deg;C, add 2 ml 1 M DTT before use. 
HEPES: Prepare 1.91 g HEPES (MW 238.21), KOH (to pH 8), and water to 4 ml. 
tRNA: Prepare 30 mg of tRNA and water to 600 &mu;l. 
CoA: Prepare 30 mg of CoA (MW 767.53) and water to 600 &mu;l. 
NAD: Add 34.83 mg of NAD (MW 663.43), Tris at 2 M (to pH 7.5-8), and water to 300 &mu;l. (Add 27 &mu;l of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5-8). 
cAMP: Add 42.80 mg of cAMP (MW 329.22), Tris at 2 M (to pH 8), and water to 200 &mu;l. (Add 73 &mu;l of Tris at 2 M to bring the solution to pH 8). 
Folinic Acid (33.9 mM): To 20 mg of solid folinic acid calcium salt (MW 511.5), add 1.15 ml water. 
Spermidine: Prepare 23.55 &mu;l of spermidine (MW 145.25) and water to 150 &mu;l. Prepare at room temperature after melting briefly at 37 &deg;C. 
3-PGA: Add 1.03 g of 3-PGA (MW 230.02), Tris at 2 M (to pH 7.5), and water to 3.2 ml. (Add 1.73 ml of Tris at 2 M to bring the solution to pH 7.5). 
Nucleotide Mix: Add 145 mg of ATP dipotassium salt dihydrate (MW 619.4), 133 mg of GTP disodium salt (MW 567.14), 79.4 mg of CTP disodium salt dihydrate (MW 563.16), 82.6 mg of UTP trisodium salt dihydrate (MW 586.12), KOH at 15% dilution (to pH 7.5), and water to 1.5 ml. (Add 353 &mu;l of KOH at 15% dilution to bring the solution to pH 7.5). 
Supplemental Material 2. Bradford Assay.
<ol>
<li>Remove Bradford agent from 4 &deg;C and set at room temperature.</li>
<li>Prepare 50 &mu;l BSA Standard at 1 mg/ml and at 0.1 mg/ml.</li>
<li>Prepare 40 &mu;l 20x dilution of extract from step 1.47.</li>
<li>Add 800 &mu;l water to 7 cuvettes. </li>
<li>Prepare standard cuvettes for 0 mg/ml, 1 mg/ml (10 &mu;l 0.1 mg/ml BSA), 2 mg/ml (20 &mu;l 0.1 mg/ml BSA), 4 mg/ml (4 &mu;l 1 mg/ml BSA), 6 mg/ml (6 &mu;l 1 mg/ml BSA).</li>
<li>Prepare experimental cuvettes for 2 &mu;l of sample and 4 &mu;l of sample.</li>
<li>Add 200 &mu;l of Bradford agent to each cuvette and mix well by pipetting. Incubate at room temperature for at least 10 min.</li>
<li>Produce standard curve at OD 595nm using cuvettes from step 6.5. Reject standard curve if r2 &lt; 0.95.</li>
<li> Determine extract concentration at OD 595nm using cuvettes froms tep 6.6.</li>
</ol>
Supplemental Material 3. Buffer calibration spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank">See TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx</a>.
 
Supplemental Material 4. Cell-free expression run spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">See TXTL _JoVE.xlsx</a>.
 </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

protocols for implementing an escherichia coli based tx-tl cell-free expression system for synthetic biology

Sistemas de expresión de ideales sin células pueden emular teóricamente un entorno celular in vivo en un control en la plataforma vitro. 1 Esto es útil para expresar las proteínas y los circuitos genéticos de una manera controlada, así como para proporcionar un entorno de creación de prototipos para la biología sintética. 2,3 Para lograr este último objetivo, los sistemas de expresión de células libres que preservan mecanismos de transcripción-traducción Escherichia coli endógenas son capaces de reflejar con mayor precisión la dinámica celular in vivo que los basados ​​en T7 RNA polimerasa de transcripción. Se describe la preparación y ejecución de un desarrollo endógeno E. eficiente la transcripción-traducción basada coli (TX-TL) sistema de expresión libre de células que pueden producir cantidades equivalentes de proteína como los sistemas basados ​​en T7 en una reducción de costes del 98% a los sistemas comerciales similares. 4,5 La preparación de tampones y extracto celular en bruto se descrito, así como la ejecución de untres tubos de reacción TX-TL. El protocolo completo dura cinco días para preparar y produce material suficiente para un máximo de 3.000 reacciones individuales en una preparación. Una vez preparado, cada reacción tiene menos de 8 horas desde la configuración hasta la recolección y análisis de datos. Mecanismos de regulación de la transcripción y exógena a la E. coli, tales como represores lac / tet y ARN polimerasa de T7, se puede complementar. 6 propiedades endógenos, tales como ARNm y las tasas de degradación de ADN, también se puede ajustar. 7 El sistema de expresión libre de células TX-TL se ha demostrado para gran ensamblaje escala del circuito, la exploración de los fenómenos biológicos, y la expresión de proteínas bajo las dos promotores T7 y endógenos. 6,8 modelos matemáticos de acompañamiento están disponibles. 9,10 El sistema resultante tiene aplicaciones únicas en la biología sintética como un entorno de creación de prototipos, o &quot;TX- protoboard biomolecular TL &quot;.

Hemos presentado un protocolo de cinco días para la preparación de una Escherichia coli endógena sistema de expresión libre de células TX-TL basado. Una línea de tiempo de la muestra para la creación de los reactivos - extracto celular en bruto y de amortiguamiento - se puede encontrar en la Figura 1. Una vez creado, éstos se pueden almacenar a -80 ° C durante hasta un año. Una vez creados los reactivos, la configuración experimental y ejecución se puede hacer en menos de 8 horas. Además, hemos optimizado las condiciones de expresión del sistema de expresión libre de células TX-TL. Otras adiciones proporcionadas por el usuario, tales como tampones o soluciones de ADN, deben ser calibrados para la toxicidad de antemano. Por ejemplo, diferentes métodos de procesamiento de los resultados en plásmidos de expresión diferente debido al contenido de sal. También hemos probado el efecto de tampón de elución Tris-Cl en la eficiencia de reacción (Figura 5). Un ejemplo de calibración extracto celular crudo, refiriéndose paso 04.01 a 04.09, se muestraen la Figura 4a. En general, nuestros experimentos muestran que el extracto celular en bruto es más sensible a los niveles de Mg-glutamato, seguido de niveles K-glutamato. Para demostrar el sistema de expresión libre de células, construimos y probamos un circuito de retroalimentación negativa basada en tet represión. 26 (Figura 6). En el sistema de expresión libre de células, el mismo recorrido del circuito con y sin ATC muestra un punto final cambia la expresión de 7 veces de reportero deGFP después de ocho horas de expresión. Aunque este experimento no requiere inductores o represores globales, si es necesario se pueden añadir en &quot;Maestro Preparación de la mezcla.&quot; <img alt="Figura 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1.jpg" /> Figura 1. Línea de tiempo para el extracto celular en bruto, solución de aminoácidos, y preparación de la solución de energía. Un Timelin de cinco días<html> E para una ejecución típica del protocolo se ha dado anteriormente, optimizado para incubaciones durante la noche y pasos de trabajo durante el día. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2.jpg" /> Figura 2. Costos y análisis de la expresión de competir extractos celulares crudos. a) Desglose de los costos de mano de obra y materiales del sistema de expresión libre de células TX-TL. Sobre la base de los costos de reactivos a partir de diciembre de 2012, y los costos de mano de obra de $ 14 por hora. B) Comparación de la TX-TL costos del sistema de expresión libre de células frente a otros sistemas comerciales. Los costos se dividen por l, aunque los volúmenes de reacción pueden variar según el kit. C) Comparación de la TX-TL libre de células rendimiento sistema de expresión frente a otros sistemas comerciales. Rendimiento de expresión de proteínas determinada por las normas del fabricante./ 50762fig2large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver más grande la figura. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3.jpg" /> Figura 3. La carga y el procesamiento de un tubo de perlas de latir. a) Demostración de la viscosidad correcta de solución célula-perla. Solución Cell-grano tendrá una viscosidad depende de muchos factores, incluyendo la cantidad de tampón S30A añadido, la cantidad de cuentas de agregados, y el tiempo pasado en el hielo. B) Carga de cordón tubo-batir antes de la centrifugación de mesa rápido. La centrifugación elimina las burbujas acumuladas durante la carga. C) de burbujas a la superficie después de la centrifugación tablero de la mesa. El tamaño de las burbujas puede variar, ya que pueden hacer estallar o eliminar con una punta de pipeta d) de tubo de bolas-superando completamente lleno antes de la limitación.. Se forma un menisco en el cordón de-batiendo tube, y la tapa tiene suficiente para cubrir y causar pequeñas cantidades para llenar en exceso. e) Aparato de filtro cargado correctamente. Estos pueden ser reutilizados. F) Comparación de la correcta vs cordón tubo-superando incorrectamente procesada. El tubo de la izquierda es un tubo bien-beat - que cuenta con un pequeño y bien delineada capa superior, y un sobrenadante claro. El tubo de la derecha es subóptima, en base a la, segunda capa nebuloso más grande y el sobrenadante turbio. Tubos que son subóptimas no deben someterse a un procesamiento adicional. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4.jpg" /> Figura 4. Propiedades de preparaciones de extracto crudo. a) parcelas de calibración típicas para extracto celular en bruto. Extracto crudo se calibra para el Mg-glutamato adicional, K-glutamato, y los niveles de TDT, en ese orden. Se muestra fluorescenc punto finale después de 8 horas, así como la tasa máxima de producción de proteína en base a un promedio móvil de 12 minutos. Sobre la base de estas parcelas, un rango aceptable de Mg-glutamato adicional es 4 mM, K-glutamato es 60-80 mM, y DTT es 0-3 mM. Tenga en cuenta que cada extracto en bruto necesita ser calibrado de forma independiente para estas tres variables. B) Variación de preparaciones de extractos. Se muestra de punto final de fluorescencia de dos extractos crudos preparados en fechas diferentes; barras de error son de 1 desviación estándar de tres carreras independientes en diferentes días. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="La figura 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5.jpg" /> Figura 5. Efectos de la solución de ADN en la eficacia de la expresión. a) Comparación de dos purificación diferentemétodos para el procesamiento de plásmidos. 1 nM de pbest-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 se prepara usando solamente un kit de Spin Miniprep Qiaprep (método de purificación 1) o post-procesado con un kit de purificación de PCR QIAquick (método de purificación 2). Se muestra la fluorescencia de punto final después de 8 horas, así como la tasa máxima de producción de proteína en base a un promedio móvil de 12 minutos. Las barras de error son de 1 desviación estándar de cuatro carreras independientes en diferentes días. B) Efecto del tampón de elución (Tris-Cl). Diferentes concentraciones de Tris-Cl se comparan en una reacción de expresión libre de células basado en la expresión de 1 nM de pbest-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500. Las concentraciones dadas son concentraciones finales de Tris-Cl en la reacción; tampón de elución utilizado es 10 mM de Tris-Cl. Las barras de error son de 1 desviación estándar de tres carreras independientes en diferentes días. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <p class="jove_content" fo:páginas together.within-keep = &quot;always&quot;&gt; <img alt="La figura 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig6.jpg" /> Figura 6. Muestra de ejecución TX-TL de un bucle de retroalimentación negativa. a) Ejemplo de configuración de una reacción de ejecución libre de células. Tests &quot;en&quot; contra &quot;de&quot; estado de la curva de retroalimentación negativa, con controles positivos y negativos. B) El plásmido mapa de bucle de retroalimentación negativa. C) Los resultados representativos. Los datos reflejan experimento en a) y b), con el control negativo se resta de la señal. Circuito genético muestra en la inserción. Las barras de error son de 1 desviación estándar de tres carreras independientes en diferentes días. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Concentración </td><td> Cantidad </td><td> Esterilización </td><td> Notas </td></tr><tr><td> El cloranfenicol (Cm) </td><td> 34 mg / ml en etanol </td><td> 1 ml </td><td> Se esteriliza con filtro (0.22 M) </td><td> Puede ser hecho en volúmenes más grandes almacenados a -20 ° C para su uso posterior. </td></tr><tr><td> 2xYT + P + placa de agar Cm </td><td> 31 g / L 2xYT, 40 mM de fosfato de potasio dibásico, 22 mM de fosfato de potasio monobásico, 34 mg / ml de cloranfenicol </td><td> 1 placa </td><td> Autoclave </td><td></td></tr><tr><td> 2xYT + P multimedia </td><td> 31 g / L 2xYT, 40 mM de fosfato de potasio dibásico, 22 mM de fosfato de potasio monobásico </td><td> 4 L </td><td> Autoclave </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1. Reactivos para el día 1 del protocolo de extracto crudo de la célula. <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Concentración </strong&gt; </td><td> Cantidad </td><td> Esterilización </td><td> Notas </td></tr><tr><td> Tris base </td><td> 2 M </td><td> 250 ml </td><td> Se esteriliza con filtro (0.22 M) o en autoclave </td><td> Se puede almacenar a temperatura ambiente. </td></tr><tr><td> TDT </td><td> 1 M </td><td> 6 ml </td><td> Se esteriliza con filtro (0.22 M) </td><td> Puede ser hecho en volúmenes más grandes y se almacenó a -20 ° C para su uso posterior. </td></tr><tr><td> Búfer S30A </td><td> 14 mM de Mg-glutamato, 60 mM de K-glutamato, mM de Tris, pH 7,7 50 </td><td> 2 L </td><td> Autoclave </td><td> Para llegar a pH 7,7, valorar con ácido acético. Añadir TDT a 2 mM de concentración final, justo antes de su uso. Almacenar a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Búfer S30B </td><td> 14 mM de Mg-glutamato, 60 mM de K-glutamato, ~ 5 mM de Tris, pH 8,2 </td><td> 2 L </td><td> Autoclave </td><td> Para llegar a pH 8,2, se valora con 2 MTris. Añadir TDT a 1 mM concentración final justo antes de su uso. Almacenar a 4 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabla 2. Reactivos para el día 2 del protocolo de extracto crudo de la célula. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> Halcón </td></tr><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Vacío 50 ml Falcon (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 ml Falcon con pellet (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Masa de pellets (50 ml Falcon con pellet - vacío 50 ml Falcon) (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Volumen de tampón S30A añadir (masa de pellets * 0.9) (ml) </td><td></td&gt; <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Masa total de cuentas para agregar (masa de pellets * 5.0) (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 3. Búfer S30A y calculadora de masa del grano, para el día 3 de protocolo de extracto crudo de la célula. <table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Concentración </td><td> Cantidad </td><td> Esterilización </td><td> Notas </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 2 M, pH 8 </td><td> 4 ml </td><td> Ninguno </td><td> Para llegar a un pH de 8, titule con KOH. </td></tr><tr><td> Nucleotide Mix </td><td> 156 mM de ATP y GTP, CTP y UTP mM, de pH 7,5 94 </td><td> 1,5 ml </td><td> Ninguno </td><td> Para llegar a un pH de 7,5, titule con KOH. </td></tr><tr><td> tRNA </td><td> 50 mg / ml </td><td> 600 l </td><td> Ninguno </td><td></td></tr><tr><td> CoA </td><td> 65 mM </td><td> 600 l </td><td> Ninguno </td><td></td></tr><tr><td> NAD </td><td> 175 mM, pH 7.5-8 </td><td> 300 l </td><td> Ninguno </td><td> Para llegar a pH 7,5-8, titule con Tris 2 M. </td></tr><tr><td> cAMP </td><td> 650 mM, pH 8 </td><td> 200 l </td><td> Ninguno </td><td> Para llegar a un pH de 8, titule con Tris 2 M. </td></tr><tr><td> El ácido folínico </td><td> 33,9 mM </td><td> 300 l </td><td> Ninguno </td><td> Aunque se necesitan sólo 300 l, receta en suplementario es de 1,15 ml. </td></tr><tr><td> La espermidina </td><td> 1 M </td><td> 150 l </td><td> Ninguno </td><td> Almacenar a 4 ° C, el calor a 37 ° C para fundir. </td></tr><tr><td> 3-PGA </td><td> 1,4 M, pH 7,5 </td><td> 3,2 ml </td><td> Ninguno </td><td> Para llegar a un pH de 7,5, se valora con Tris 2 M. </td></tr></tbody></table> Tabla 4. Reactivos para prepararse para el protocolo Energy Solution. Material complementario 1. Recetas para los artículos. El cloranfenicol, 34 mg / ml: Preparar 0,51 g de cloranfenicol y añadir etanol a 15 ml. Se esteriliza con filtro (0.22 M), alícuota de 1 ml tubos, almacenar a -20 ° C para su uso posterior. 2xYT + P + placa de agar Cm: Preparar 1,24 g 2xYT, 1,6 ml de fosfato de potasio dibásico @ solución 1 M, 0,88 ml de solución de fosfato monobásico de potasio @ 1 M, 0,6 g de agar, y el agua a 40 ml. Autoclave. Dejar enfriar a 50 ° C y añadir 40 l Cm. Alícuota de 25 ml en una placa de 100 x 15 mm Petri, y deje que se enfríe durante una hora. 2xYT + P los medios de comunicación: Preparar 124 g 2xYT, 160 ml de fosfato de potasio dibásico @ solución 1 M, solución de 88 ml de fosfato de potasio monobásico @ 1 M, y agua a 4 L. Aliquot hacia 2 x 1,88 L y 0,24 L. Autoclave. Tris base, 2 M: Prepare 60,57 g Tris base y agua hasta 250 ml. Esterilizar, almacenar a temperatura ambiente para su uso posterior. TDT, 1 M: Preparar 2,31 g TDT y el agua a 15 ml. Se esteriliza con filtro (0.22 M), alícuota de 1 ml tubos, almacenar a -20 ° C para su uso posterior. Búfer S30A: Prepare 10,88 g Mg-glutamato y 24,39 g K-glutamato, 50 ml de Tris a 2 M, ácido acético (pH 7,7), y el agua a 2 L. Autoclave, se almacenan a 4 ° C, añadir 4 ml 1 M DTT antes de su uso. Búfer S30B: Prepare 10,88 g Mg-glutamato y 24,39 g K-glutamato, Tris 2 M (pH 8,2), y el agua a 2 L. Autoclave, se almacenan a 4 ° C, añadir 2 ml de 1 M DTT antes de su uso. HEPES: Preparar 1,91 g de HEPES (MW 238,21), KOH (a pH 8), y agua a 4 ml. ARNt: Prepare 30 mg de ARNt y agua a 600 l. CoA: Preparar 30 mg de CoA (MW 767,53) y agua a 600 l. NAD: Añadir 34,83 ​​mg de NAD (MW 663,43), Tris a 2 M (a pH 7,5-8), y agua a 300 l. (Añadir 27 l de Tris a 2 M para llevar la solución a pH 7,5-8). cAMP: Agregar 42,80 mg de cAMP (PM 329,22), Tris 2 M (pH 8), y el agua a 200 l. (Añadir 73 l de Tris a 2 M para llevar la solución a pH 8). Ácido folínico (33,9 mM): Para 20 mg de sal de calcio de ácido folínico sólido (MW 511.5), añadir 1,15 ml de agua. La espermidina: Preparar 23,55 l de espermidina (MW 145,25) y agua a 150 l. Preparar a temperatura ambiente después de la fusión brevemente a 37 ° C. 3-PGA: Añadir 1,03 g de 3-PGA (MW 230,02), Tris a 2 M (a pH 7,5), y agua a 3,2 ml. (Añadir 1,73 ml de Tris a 2 M para llevar la solución a pH 7,5). Nucleotide Mix: Añadir 145 mg de ATP dipotásico dihidrato de sal (MW 619.4), 133 mg de sal disódica GTP (MW 567,14), 79,4 mg de sal disódica dihidrato CTP (MW 563,16), 82,6 mg de dihidrato de la sal trisódica UTP (MW 586,12) , KOH a 15% de dilución (a pH 7,5), y agua a 1,5 ml. (Añadir 353 l de KOH a 15% de dilución para llevar la solución a pH 7,5). Material suplementario 2. Ensayo de Bradford. <ol><li> Eliminar los agentes Bradford de 4 ° C y se pondrá a la temperatura ambiente. </li><li> Preparar 50 l de BSA estándar a 1 mg / ml y a 0,1 mg / ml. </li><li> Preparar 40 l de 20x de dilución del extracto de la etapa 1.47. </li><li> Añadir 800 l de agua a 7 cubetas. </li><li> Preparar cubetas estándar para 0 mg / ml, 1 mg / ml (10 l 0,1 mg / ml de BSA), 2 mg / ml (20 l 0,1 mg / ml de BSA), 4 mg / ml (4 l 1 mg / ml de BSA) , 6 mg / ml (6 l 1 mg / ml de BSA). </li><li> Preparar cubetas experimentales para 2 l de muestra y 4 l de muestra. </li><li> Añadir 200 l de agente de Bradford a cada cubeta y mezclar bien bY pipeteado. Incubar a temperatura ambiente durante al menos 10 min. </li><li> Producir curva estándar a una DO de 595 nm usando cubetas de paso 6.5. Rechazar curva estándar si r 2 &lt;0,95. </li><li> Determinar la concentración del extracto a una DO de 595 nm utilizando cubetas desde el paso 6.6. </li></ol> Material complementario 3. Tampón de hoja de cálculo de calibración. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank">Ver TXTL_e (plantilla) _calibration_JoVE.xlsx</a> . Material suplementario 4. Expresión libre de células ejecutar hojas de cálculo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">Ver TXTL _JoVE.xlsx</a> .

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Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Este protocolo de cinco días se esbozan todos los pasos, el equipo y el software complementario necesario para la creación y ejecución de un eficiente Escherichia coli endógeno basado sistema de expresión libre de células TX-TL a partir de cero. Con los reactivos, el protocolo de toma 8 horas o menos a la configuración de una reacción, recopilar y procesar datos.

Los protocolos para la implementación de un<em&gt; Escherichia coli</emSistema&gt; Basado TX-TL-Cell de Libre Expresión de la biología sintética

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

62.7K vistas.  California Institute of Technology.  Este protocolo de cinco días se esbozan todos los pasos, el equipo y el software complementario necesario para la creación y ejecución de un eficiente Escherichia coli endógeno basado sistema de expresión libre de células TX-TL a partir de cero. Con los reactivos, el protocolo de toma 8 horas o menos a la configuración de una reacción, recopilar y procesar datos. 

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An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme acid stresses including passage through the mammalian stomach where the pH can fall to as low as pH 1 - 22. To enable such a broad range of acidic pH survival, E. coli possesses four different inducible amino acid decarboxylases that decarboxylate their substrate amino acids in a proton-dependent manner thus raising the internal pH. The decarboxylases include the glutamic acid decarboxylases GadA and GadB3, the arginine decarboxylase AdiA4, the lysine decarboxylase LdcI5, 6 and the ornithine decarboxylase SpeF7. All of these enzymes utilize pyridoxal-5'-phospate as a co-factor8 and function together with inner-membrane substrate-product antiporters that remove decarboxylation products to the external medium in exchange for fresh substrate2. In the case of LdcI, the lysine-cadaverine antiporter is called CadB. Recently, we determined the X-ray crystal structure of LdcI to 2.0 &#197;, and we discovered a novel small-molecule bound to LdcI the stringent response regulator guanosine 5'-diphosphate,3'-diphosphate (ppGpp) 14. The stringent response occurs when exponentially growing cells experience nutrient deprivation or one of a number of other stresses9. As a result, cells produce ppGpp which leads to a signaling cascade culminating in the shift from exponential growth to stationary phase growth10. We have demonstrated that ppGpp is a specific inhibitor of LdcI 14. Here we describe the lysine decarboxylase assay, modified from the assay developed by Phan et al.11, that we have used to determine the activity of LdcI and the effect of pppGpp/ppGpp on that activity. The LdcI decarboxylation reaction removes the &alpha;-carboxy group of L-lysine and produces carbon dioxide and the polyamine cadaverine (1,5-diaminopentane)5. L-lysine and cadaverine can be reacted with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) at high pH to generate N,N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverine) and N,N&#8242;-bistrinitrophenyllysine (TNP-lysine), respectively11. The TNP-cadaverine can be separated from the TNP-lysine as the former is soluble in organic solvents such as toluene while the latter is not (See Figure 1). The linear range of the assay was determined empirically using purified cadaverine.

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

The activity of the inducible lysine decarboxylase is monitored by reacting the substrate L-lysine and the product cadaverine with 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acid to form adducts that have differential solubility in toluene.

Un ensayo para medir la actividad de Escherichia coli Inducible lisina Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Investigación

Biología

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Mutagénesis y funcional protocolos de selección de la evolución dirigida de proteínas en E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted into fuel alcohols1. The potential for enzymatic hydrolysis of cellulosic biomass to provide renewable energy has intensified efforts to engineer cellulases for economical fuel production2. Of particular interest are fungal cellulases3-8, which are already being used industrially for foods and textiles processing.
Identifying active variants among a library of mutant cellulases is critical to the engineering process; active mutants can be further tested for improved properties and/or subjected to additional mutagenesis. Efficient engineering of fungal cellulases has been hampered by a lack of genetic tools for native organisms and by difficulties in expressing the enzymes in heterologous hosts. Recently, Morikawa and coworkers developed a method for expressing in E. coli the catalytic domains of endoglucanases from H. jecorina3,9, an important industrial fungus with the capacity to secrete cellulases in large quantities. Functional E. coli expression has also been reported for cellulases from other fungi, including Macrophomina phaseolina10 and Phanerochaete chrysosporium11-12. 
We present a method for high throughput screening of fungal endoglucanase activity in E. coli. (Fig 1) This method uses the common microbial dye Congo Red (CR) to visualize enzymatic degradation of carboxymethyl cellulose (CMC) by cells growing on solid medium. The activity assay requires inexpensive reagents, minimal manipulation, and gives unambiguous results as zones of degradation (&#x201C;halos&#x201D;) at the colony site. Although a quantitative measure of enzymatic activity cannot be determined by this method, we have found that halo size correlates with total enzymatic activity in the cell. Further characterization of individual positive clones will determine , relative protein fitness. 
Traditional bacterial whole cell CMC/CR activity assays13 involve pouring agar containing CMC onto colonies, which is subject to cross-contamination, or incubating cultures in CMC agar wells, which is less amenable to large-scale experimentation. Here we report an improved protocol that modifies existing wash methods14 for cellulase activity: cells grown on CMC agar plates are removed prior to CR staining. Our protocol significantly reduces cross-contamination and is highly scalable, allowing the rapid screening of thousands of clones. In addition to H. jecorina enzymes, we have expressed and screened endoglucanase variants from the Thermoascus aurantiacus and Penicillium decumbens (shown in Figure 2), suggesting that this protocol is applicable to enzymes from a range of organisms.

High Throughput Screening of Fungal Endoglucanase Activity in Escherichia coli

We describe a low cost, high throughput method to screen for fungal endoglucanase activity in E. coli. The method relies on a simple visual readout of substrate degradation, does not require enzyme purification, and is highly scalable. This allows for the rapid screening of large libraries of enzyme variants.

Cribado de alto rendimiento de la actividad endoglucanasa por hongos en Escherichia coli</em

Cellulase enzymes (endoglucanases, cellobiohydrolases, and &beta;-glucosidases) hydrolyze cellulose into component sugars, which in turn can be converted ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Mapeo bacterianas redes funcionales y vías en<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Utilizando matrices sintéticas genéticos

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

Protocolo rápido para la preparación de electrocompetentes<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Y<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. coli O157:H7 by targeting ORF Z3276. With this assay, we can detect as low as a few copies of the genome of DNA of E. coli O157:H7. The sensitivity and specificity of the assay were confirmed by intensive validation tests with a large number of E. coli O157:H7 strains (n = 369) and non-O157 strains (n = 112). Furthermore, we have combined propidium monoazide (PMA) procedure with the newly developed qPCR protocol for selective detection of live cells from dead cells. Amplification of DNA from PMA-treated dead cells was almost completely inhibited in contrast to virtually unaffected amplification of DNA from PMA-treated live cells. Additionally, the protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for an easy and consistent handling of a large number of samples. This method is expected to have an impact on accurate microbiological and epidemiological monitoring of food safety and environmental source.

Detection of Live Escherichia coli O157:H7 Cells by PMA-qPCR

A qPCR assay was developed for detection of Escherichia coli O157:H7 targeting a unique genetic marker, Z3276. The qPCR was combined with propidium monoazide (PMA) treatment for live cell detection. This protocol has been modified and adapted to a 96-well plate format for easy and consistent handling of numerous samples

La detección de vivo<em&gt; Escherichia coli</em&gt; O157: H7 células por PMA-qPCR

A unique open reading frame (ORF) Z3276 was identified as a specific genetic marker for E. coli O157:H7. A qPCR assay was developed for detection of E. ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Fluorescente verde a base de proteína Expresión Proyección de proteínas de membrana en<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III &#949; subunit (featuring 3&#8217;-5&#8217; exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the &#945; and &#952; subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing &#949;, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the &#945; subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the &#949; subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type &#949; subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-&#946;-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

The Multifaceted Benefits of Protein Co-expression in Escherichia coli

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Las multifacéticas beneficios de la proteína co-expresión en<em&gt; Escherichia coli</em

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in ...

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is the challenge of identifying suitable vaccine candidates. Malarial proteins expressed using prokaryotic and eukaryotic cell based expression systems are poorly glycosylated, generally insoluble and undergo improper folding leading to reduced immunogenicity. The wheat germ, rabbit reticulocyte lysate and Escherichia coli lysate cell free expression systems are currently used for expression of malarial proteins. However, the length of expression time and improper glycosylation of proteins still remains a challenge. We demonstrate expression of Plasmodium proteins in vitro using HeLa based cell free expression systems, termed &#8220;in vitro human cell free expression systems&#8221;. The 2 HeLa based cell free expression systems transcribe mRNA in 75 min and 3 &#181;l of transcribed mRNA is sufficient to translate proteins in 90 min. The 1-step expression system is a transcription and translation coupled expression system; the transcription and co-translation occurs in 3 hr. The process can also be extended for 6 hr by providing additional energy. In the 2-step expression system, mRNA is first transcribed and then added to the translation mix for protein expression. We describe how to express malaria proteins; a hydrophobic PF3D7_0114100 Maurer&#8217;s Cleft &#8211; 2 transmembrane (PfMC-2TM) protein, a hydrophilic PF3D7_0925900 protein and an armadillo repeats containing protein PF3D7_1361800, using the HeLa based cell free expression system. The proteins are expressed in micro volumes employing 2-step and 1-step expression strategies. An affinity purification method to purify 25 &#181;l of proteins expressed using the in vitro human cell free expression system is also described. Protein yield is determined by Bradford&#8217;s assay and the expressed and purified proteins can be confirmed by western blotting analysis. Expressed recombinant proteins can be used for immunizations, immunoassays and protein sequencing.

HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins

Expression of malarial proteins in cell based systems remains challenging. We demonstrate two step and one step IVT (in vitro translation) cell free expression systems for expressing malarial recombinant rhoptry proteins from HeLa cells. We use a Ni-resin affinity based purification system to purify the rhoptry proteins.

Sistemas basados ​​en células HeLa Expresión Libre de Expresión de<em&gt; Plasmodium</em&gt; rhoptry Proteínas

Malaria causes significant global morbidity and mortality. No routine vaccine is currently available. One of the major reasons for lack of a vaccine is ...

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

The canonical set of amino acids leads to an exceptionally wide range of protein functionality. Nevertheless, the set of residues still imposes limitations on potential protein applications. The incorporation of noncanonical amino acids can enlarge this scope. There are two complementary approaches for the incorporation of noncanonical amino acids. For site-specific incorporation, in addition to the endogenous canonical translational machineries, an orthogonal aminoacyl-tRNA-synthetase-tRNA pair must be provided that does not interact with the canonical ones. Consequently, a codon that is not assigned to a canonical amino acid, usually a stop codon, is also required. This genetic code expansion enables the incorporation of a noncanonical amino acid at a single, given site within the protein. The here presented work describes residue-specific incorporation where the genetic code is reassigned within the endogenous translational system. The translation machinery accepts the noncanonical amino acid as a surrogate to incorporate it at canonically prescribed locations, i.e., all occurrences of a canonical amino acid in the protein are replaced by the noncanonical one. The incorporation of noncanonical amino acids can change the protein structure, causing considerably modified physical and chemical properties. Noncanonical amino acid analogs often act as cell growth inhibitors for expression hosts since they modify endogenous proteins, limiting in vivo protein production. In vivo incorporation of toxic noncanonical amino acids into proteins remains particularly challenging. Here, a cell-free approach for a complete replacement of L-arginine by the noncanonical amino acid L-canavanine is presented. It circumvents the inherent difficulties of in vivo expression. Additionally, a protocol to prepare target proteins for mass spectral analysis is included. It is shown that L-lysine can be replaced by L-hydroxy-lysine, albeit with lower efficiency. In principle, any noncanonical amino acid analog can be incorporated using the presented method as long as the endogenous in vitro translation system recognizes it.

Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System

An easy-to-use, cell-free expression protocol for the residue-specific incorporation of noncanonical amino acid analogs into proteins, including downstream analysis, is presented for medical, pharmaceutic, structural and functional studies.

La incorporación de residuos específicos de no canónicos aminoácidos en las proteínas modelo usando una<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Sistema de transcripción-traducción libre de células