1. La preparación y contar las células Namalwa <ol><li> Extraer células del frasco de cultivo y centrifugación de las células de pellets. Eliminar las células sobrenadante y resuspender en un volumen conocido de PBS. Las células utilizadas en este protocolo son las células en suspensión. Si está utilizando las células adherentes tendrá que trypsinize antes de la recogida. </li><li> Para determinar el número de células vivas, la mancha de una alícuota de la suspensión celular mediante la mezcla de 1:1 con una solución 0,4% azul de tripano y pipeta 10 ul de la mezcla en un portaobjetos de contar, y luego insertar la diapositiva en la célula automatizada TC10 contador (Bio-Rad Laboratories, Inc). </li><li> El contador de células TC10 se enfoque automático para asegurar los resultados más exactos, y luego proceder con el conteo. Se determina automáticamente la densidad de las células vivas y células totales en la muestra. </li><li> Seleccione ver la imagen para mostrar las celdas en la pantalla de visión. A continuación, seleccione la calculadora de dilución para que el contador de células TC10 calcula automáticamente la cantidad de mezcla de células que se necesitarán. </li><li> Este experimento se utiliza un total de tres siRNAs: un siRNA control y dos diferentes siRNAs dirigidos al gen STAT6, además de los controles no transfectadas. Esto requiere de 3,6 ml a una concentración final de 5 x 10 6 células por ml. </li><li> Entrar en la concentración deseada y los valores finales de volumen en la calculadora de dilución, y se calcula el volumen de suspensión celular necesario en función del recuento de células vivas para esa muestra. Por otra parte, realizar el cálculo manualmente. Luego transferir el volumen necesario de mezcla de células de estos experimentos en un nuevo tubo. </li><li> Haga girar la mezcla de células para que sedimenten las células y eliminar todas las PBS. Volver a suspender en 3,6 ml de solución tampón de electroporación Gene impulsos (Bio-Rad Laboratories). Transferencia de 800 alícuotas en tubos que contienen el siRNAs apropiado y mezcle suavemente. Las células están listas para la electroporación. </li></ol> 2. Electroporating las células en placas de 96 pozos <ol><li> La placa de 96 pozos de electroporación permite la replica de los cuatro tratamientos que se electroporated juntos. </li><li> Transferencia de 150 ml de la suspensión de células en los pocillos correspondientes de una placa de 96 pozos de electroporación. </li><li> Inserte la placa en la cámara de placa MXcell electroporación y cierre la tapa. </li><li> Electroporar con los ajustes optimizados para la línea celular y el tampón utilizado. Estas células se someten a electroporación con una ola de decaimiento exponencial con la configuración de instrumento de 250 V, 350 mF, y 1000 Ω de resistencia. </li><li> Después de la electroporación es completa, una pipeta de arriba a abajo con suavidad en cada bien para mezclar y luego transferir las células en una placa de cultivo de tejidos que contienen pre-calentado los medios de comunicación. Namalwa células son cultivadas en RPMI (Life Technologies) suplementado con 7,5% de FCS y 1% de piruvato. </li><li> Las muestras de control que no han sido electroporated se han tomado de la suspensión de células restantes y se añaden a placas de cultivo de medio de cultivo pre-calentado de forma idéntica a las células por electroporación. </li><li> Las células se incuban durante la noche a 37 º C con CO2 al 5%. </li><li> Después de 24 horas, un grupo de células se indujo con 10 concentración final ng / ml recombinante de IL-4 (R &amp; D Systems). El segundo grupo de control de las células sólo reciben los medios de comunicación adicionales. Todas las células se incuban otras 24 horas a 37 ° C y 5% CO 2. </li></ol> 3. Extraer y verificar el ARN <ol><li> Después de un total de 48 horas de crecimiento, el recuento de las células en cada pocillo, y la transferencia de una parte alícuota de cada pocillo a un tubo de microcentrífuga para la extracción de ARN, y la congelación de una alícuota para el análisis de Western Blot de proteínas u otros. </li><li> Centrifugar las muestras para que sedimenten las células, y luego retirar y desechar el sobrenadante de cada tubo. </li><li> Proceder a la extracción de RNA. Por lo general el uso de la Aurum ARN total kit (Bio-Rad) según el protocolo incluido. </li><li> Al supervisar caída génica mediada por siRNA es particularmente importante para verificar la calidad del ARN porque el ARN se degrada dar resultados engañosos. El ratio de 260/280 no indica la integridad del RNA por lo tanto, es importante para ejecutar las muestras en un gel o un dispositivo de microfluidos para confirmar el ARN no se degradan. </li><li> Para evaluar la calidad y cantidad en un solo paso, estas muestras serán analizadas mediante el sistema automatizado de electroforesis Experion (Bio-Rad). </li><li> Las primeras muestras, el calor. Entonces, el primer, de carga, y el vórtice de chips Experion ARN. Insertar el chip en la estación de electroforesis Experion y empezar a correr. </li><li> Después de la corrida se ha completado, el software Experion mostrará los resultados de forma automática en la forma de un electroferograma, tabla de resultados (que muestra la concentración de ARN, la relación ribosomal, y el número indicador de la calidad del ARN), y el gel virtual (que es similar a una tradicional ARN gel). Muestras de alta calidad total de ARN suele tener un RQI de 8-10. </li&gt; </ol> 4. PCR en tiempo real <ol><li> Después de verificar la calidad del ARN, proceda con las reacciones de cDNA. Este experimento se utilizó el iScript un paso RT-PCR mix (Bio-Rad) para combinar síntesis de cDNA y PCR en tiempo real en una sola reacción. </li><li> Haga una mezcla maestra contiene todos los componentes de la reacción que no sea las plantillas de ARN para cada conjunto de cebadores, y distribuir dicho en la placa de PCR. </li><li> Después de diluir el RNA a una concentración uniforme, añadir el RNA de muestras en los pocillos adecuados. Cada reacción está configurado por triplicado. </li><li> Sellar la placa, y colóquelo en el CFX384 sistema en tiempo real PCR (Bio-Rad). Seleccione el protocolo apropiado y comenzar la carrera. </li><li> Una vez que la carrera se ha completado, la expresión del gen se determina mediante la comparación de la expresión genética del gen de interés normalizado a una referencia de genes en las células por electroporación con siRNA experimental para la normalización de las mismas células por electroporación con un control de siRNA. </li></ol> 5. Análisis de la caída del siRNA <ol><li> La expresión de CCL17 se monitorizó utilizando cuantitativa en tiempo real PCR para investigar el papel del activador de la transcripción STAT6 en la inducción de IL-4 dependiente de CCL17. Para este experimento, se utilizó GAPDH como gen de referencia. Genes alternativos de referencia o varios genes de referencia se pueden utilizar de la misma manera. </li><li> El software de gestión CFX normalizado automáticamente CCL17 expresión a la expresión del gen de referencia de la misma muestra y automáticamente comparado los valores resultantes normalizado a los tratamientos de control mediante la simple selección GAPDH como &quot;referencia&quot; y el tratamiento control (siRNA control sin inducción de IL-4) como &quot;control&quot; en la ventana de configuración del experimento del software de gestión de CFX. </li><li> Sin la inducción de IL-4, la transcripción de CCL17 se mantuvo en niveles bajos, comparables a los constitutivos del tratamiento de control. </li><li> Inducida por las células con IL-4 y mantener una vía normal de STAT6 (es decir, el control de siRNA o tratamientos de control no transfectadas) demostró la inducción de 8.10 veces de CCL17 expresión. </li><li> Inducida por las células con IL-4, pero con STAT6 expresión inhibida por la introducción de cualquiera de siRNA STAT6 mostraron expresión sólo 2 veces mayor que el CCL17 células no inducidas, confirmando el papel de STAT6 en la IL-4 inducida por la expresión de CCL17. </li></ol> 6. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/1904/1904fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Descripción general de la vía de señalización de IL-4. Un enlace) de la IL-4 a su receptor conduce a la dimerización y activación de STAT6. STAT6 activado transloca al núcleo y activa la transcripción de sus genes diana, como el CC17. B) Sin inducción de IL-4, la transcripción de CCL17 se mantendrá en niveles bajos, constitutiva. C) Después de silenciar siRNA mediada por el gen STAT6, el tratamiento con IL-4 debe dar lugar a poco o ningún aumento en CCL17 expresión. <img src="/files/ftp_upload/1904/1904fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. La inducción de IL-4 por CCL17 medida por las diferentes condiciones de PCR cuantitativa en tiempo real. A) Las muestras cultivadas en ausencia de IL-4 tenía un bajo nivel constitutivo de expresión, independientemente de la expresión génica. B) Como se muestra en verde y azul, las muestras de control respondieron normalmente al tratamiento con IL-4, con una inducción de 8-10 veces CCL17. Sin embargo, las células transfectadas con siRNAs dirigidos STAT6, que se muestra en rojo y rosa, había disminuido CCL17 expresión en respuesta a IL-4, el apoyo a la idea de que STAT6 juega un papel en la IL-4 inducida por la expresión de CCL17.

El autor es empleado por Bio-Rad Laboratories, que produce los reactivos y los instrumentos utilizados en este artículo.

Este artículo ha demostrado cómo electroporar siRNAs en un difícil transfectar la línea de suspensión de células y cómo seguir la expresión génica en estas células. Al hacer este procedimiento s importante tener en cuenta para mantener las cosas lo más coherente posible en todas las muestras.

using an automated cell counter to simplify gene expression studies: sirna knockdown of il-4 dependent gene expression in namalwa cells

El uso de la caída de genes mediada por siRNA continúa siendo una herramienta importante en los estudios de la expresión génica. estudios de siRNA se llevan a cabo no sólo para estudiar los efectos de la regulación negativa de un solo gen, sino también para interrogar a las vías de señalización y otras redes de interacción compleja. Estos análisis vía requiere tanto el uso de modelos celulares relevantes y los métodos que causen menos perturbaciones a la fisiología celular. La electroporación es cada vez más como una manera eficaz de introducir siRNA y otros ácidos nucleicos en las difíciles de transfectar líneas celulares y células primarias sin alterar la vía de señalización bajo investigación. Hay varios pasos fundamentales para un experimento de siRNA con éxito, y hay maneras de simplificar el trabajo, mientras que la mejora de la calidad de los datos en varias etapas experimentales. Para ayudarle a empezar con su proyecto mediada siRNA caída gen, vamos a demostrar cómo llevar a cabo un estudio completo de la vía de la recolección y conteo de las células antes de la electroporación mediante transfección análisis de PCR en tiempo real de la expresión génica. El presente estudio investiga el papel de activador transcripcional STAT6 en IL-4 la expresión de genes dependientes de CCL17 en una línea celular de linfoma de Burkitt (Namalwa). Las técnicas demostradas son útiles para una amplia gama de siRNA basado en experimentos en los dos adherente y células en suspensión. También le mostraremos la manera de agilizar el conteo de células con el contador de células automatizado TC10, cómo electroporar varias muestras al mismo tiempo utilizando el sistema de electroporación MXcell, y la forma de evaluar al mismo tiempo la calidad y la cantidad de ARN con el sistema de electroforesis Experion automatizado.

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Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Este procedimiento describe un flujo de trabajo rápido y fácil de introducir en siRNA difíciles de transfectar líneas celulares y seguir la expresión de genes por PCR en tiempo real. El uso de un contador de células automatizado, multi-así placa electroporación, y la estación de electroforesis automatizados proporcionar resultados rápidos y confiables sin la necesidad de manipulación robótica caro.

El uso de un contador de células automatizado para simplificar estudios de expresión génica: siRNA Derribo de IL-4 la expresión génica en células dependientes Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

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Research

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Biology

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Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Gen bacteriano y Análisis de Expresión El uso de microarrays

Investigación

Biología

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparación de cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina por electroporación

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Spinal Cord Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord dissection and preparation of recording bath artificial cerebrospinal fluid used for locomotor studies. Once dissected, the spinal cord ventral nerve roots can be attached to a recording electrode to record the electrophysiologic signals of the central pattern generating circuitry within the lumbar cord.

A demonstration of the isolation of neonatal mouse spinal cord for electrophysiologic studies.

La médula espinal de Electrofisiología

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizando el sistema de electroporación Gene Emisores MXcell para transfectar células primarias con alta eficiencia

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

Robótica y Análisis de Imagen Dinámica de Estudios de la expresión génica en los tejidos vegetales

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Las secciones incluidas en parafina y congeladas de Drosophila Los músculos de Adultos

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

En la reconstitución in vitro de los activos T. castaneum telomerasa

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Preparation of Cell-lines for Conditional Knockdown of Gene Expression and Measurement of the Knockdown Effects on E4orf4-Induced Cell Death

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various pathways1,2. However, conditional knockdown of gene expression is required in cases when constitutive knockdown is not tolerated by cells for a long period of time3-5. Here we describe a protocol for preparation of cell lines allowing conditional knockdown of subunits of the ACF chromatin remodeling factor. These cell lines facilitate the determination of the contribution of ACF to induction of cell death by the adenovirus E4orf4 protein6. Sequences encoding short hairpin RNAs for the Acf1 and SNF2h subunits of the ACF chromatin remodeling factor were cloned next to a doxycycline-inducible promoter in a plasmid also containing a gene for the neomycin resistance gene. Neomycin-resistant cell clones were selected in the presence of G418 and isolated. The resulting cell lines were induced by doxycycline treatment, and once Acf1 or SNF2h expression levels were reduced, the cells were transfected with a plasmid encoding E4orf4 or an empty vector. To confirm the specific effect of the shRNA constructs, Acf1 or SNF2h protein levels were restored to WT levels by cotransfection with a plasmid expressing Acf1 or SNF2h which were rendered resistant to the shRNA by introduction of silent mutations. The ability of E4orf4 to induce cell death in the various samples was determined by a DAPI assay, in which the frequency of appearance of nuclei with apoptotic morphologies in the transfected cell population was measured7-9.
The protocol described here can be utilized for determination of the functional contribution of various proteins to induction of cell death by their protein partners in cases when constitutive knockdown may be cell lethal.

Contribution of the ACF chromatin remodeling factor to E4orf4-induced cell death was measured. The protocol includes selection of cell clones in which doxycycline treatment induces conditional knockdown of the ACF subunits Acf1 and SNF2h, and use of the DAPI assay to measure E4orf4-induced cell death in the inducible cell lines.

Preparación de líneas celulares de Derribo condicional de la expresión génica y la medición de los efectos desmontables en la muerte celular inducida por E4orf4

Functional inactivation of gene expression in mammalian cells is crucial for the study of the contribution of a protein of interest to various ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análisis de RNA Global Síntesis en el nivel de células individuales siguiente Hipoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Screening siRNA para identificar ubiquitina y reguladores del sistema ubiquitina-como de las vías biológicas en células de mamífero en cultivo

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...