The authors would like to acknowledge Marcos Di Falco for his expertise and advice with the preparation of the samples for nano-LC MS/MS as well as Dr. Zoran Minic from the University of Regina for the LC MS/MS analysis. This work was supported by NSERC (DG402214-2011) and CRC (950-221184) funding. D.C. was supported by Concordia Institute for Water, Energy, and Sustainable Systems and FQRNT.

1. Prepare Reactivos <ol><li> Preparar la solución de SDS-extracción: M Tris-HCl pH 0,1 7,5, 5% de glicerol, EDTA 10 mM y 1% de SDS. Filtro-esterilizar utilizando un filtro y tienda de 0,22 micras a 4 ° C. </li><li> Preparar reactivos de valores necesarios para el gel de poliacrilamida. <ol><li> Preparar 1,5 M Tris-HCl pH 8,8. Filter-esterilizar utilizando un filtro de 0,22 micras y almacenar a temperatura ambiente. </li><li> 0,5 M Tris-HCl pH 6,8. Filter-esterilizar utilizando un filtro de 0,22 micras y almacenar a temperatura ambiente. </li><li> Preparar 10% de SDS. Filtrar esterilizar utilizando un filtro de 0,22 micras y almacenar a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Preparar soluciones necesarias en gel tripsina digerir y extracción de péptidos. <ol><li> Preparar bicarbonato de amonio 100 mM. Filtro-esterilizar utilizando un filtro y tienda de 0,22 micras a 4 ° C. </li><li> Preparar 1 stocks M de TDT. Suspendido en bicarbonato de amonio 100 mM y se almacena a -80 ° C. </li><li> Preparar 550 mM acciones yodoacetamida. Suspendido en100 mM de bicarbonato de amonio y almacenar a -80 ° C. </li><li> Preparar 100 ng / l existencias tripsina. Alícuota de 60 l en tubos de 1,5 ml de microcentrífuga y se almacena a -80 ° C. </li><li> Preparar la solución de extracción: ácido fórmico 1%, 2% de acetonitrilo. </li><li> Preparar la solución de resuspensión: 5% de acetonitrilo y ácido fórmico al 0,1%. </li></ol></li></ol> 2. Realice lisis celular en la Unidad de filtro de cartucho con células conservadas en el ARN solución Estabilización <ol><li> Expulsar la solución de estabilización de ARN a partir de la unidad de filtro de cartucho (1,5 ml) y en un tubo de microcentrífuga de 2 ml utilizando una jeringa de 60 ml se adjunta al final de cierre luer del filtro. </li><li> Centrifugar el tubo de microcentrífuga de 2 ml durante 10 minutos a 17.000 xg para sedimentar los residuos celulares. Esto se hace para que el filtro en el paso 2.3 no obstruye. </li><li> Transferir el sobrenadante a una unidad de filtro de ultracentrifugación 10 K para capturar cualquier proteínas procedentes de células que han lisadas de la congelación / thaw de la muestra. No deseche el pellet. Será utilizado en el paso 2.5. Realizar la centrifugación de la unidad de filtro de ultracentrifugación a 3.270 xg durante 30 min o hasta que el volumen se ha reducido a alrededor de 600 l. </li><li> Derretir la punta de una punta de p10 y bloquear el lado no Luer de la unidad de filtro de cartucho con el extremo abierto de la punta. Esto asegurará que ningún tampón de extracción y la biomasa se escapa durante los pasos 2.5-2.7. </li><li> Suspender el sedimento en 1 ml de solución de SDS-extracción y la pipeta en la unidad de filtro de cartucho original. La forma más fácil de pipeta en la unidad de filtro de cartucho es apilar una punta p200 en una punta p1000 y utilizar este doble punta para pipetear. </li><li> Añadir 1 ml de solución de extracción SDS a la unidad de filtro de cartucho de modo que el volumen total es de aproximadamente 2 ml y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente rotando en un horno de hibridación. Coloque 3 laboratorio arrugado toallitas en el fondo de un tubo cónico de 50 ml. Parafilm ambos extremos de la unidad de filtro de cartucho cerradasy poner la unidad de filtro de cartucho en el tubo de 50 ml. Cierre la tapa y colocar el tubo en el horno de hibridación. </li><li> Después de 10 min lugar filtrar la Sterivex en un flotador de espuma y seguro en su lugar con una jeringa de 5 ml en el extremo Luer. Flotador y se incuba en un baño de agua 95 ° C durante 15 minutos. </li><li> Deje que la unidad de filtro de cartucho fresco y rotar a temperatura ambiente durante 1 hora (como en el paso 2.6). </li><li> Expulsar el lisado solución de extracción / célula SDS fuera del filtro con una jeringa de 60 ml en la misma unidad de filtro de ultracentrifugación como antes (paso 2.3). Añadir 1 ml de solución fresca de extracción de SDS a la unidad de filtro de cartucho y se mezcla durante 30 seg a mano y luego expulsar en la unidad de filtro de ultracentrifugación utilizando la jeringa 60 ml. Esto es para enjuagar la unidad de filtro de cartucho para asegurar que todas las proteínas se han eliminado. </li><li> Realizar centrifugación en la unidad de filtro de ultracentrifugación durante 45 minutos a 3270 xg o hasta que el volumen en la unidad de filtro es menor que 600 l. </li><li> Deseche el filtrado y la parte superior de la unidad de filtro ultracentrífugo con solución de SDS-extracción fresco. </li><li> Centrifugar la unidad de filtro durante otros 45 min a 3270 x g. </li><li> Repita los pasos 2.11 y 2.12 veces más. Asegúrese de que el volumen final en la unidad de filtro de ultracentrifugación es como máximo de 600 l en el final de la vuelta final. </li><li> En este punto, se dividió el concentrado en dos. Una fracción será utilizado para la precipitación del ADN y el otro para la precipitación de proteínas. Nota: La cantidad de fraccionamiento depende de la cantidad de biomasa que se filtró y los usos previstos de los productos. En nuestro caso, nos dividimos el concentrado con 10% hacia la precipitación de ADN y el 90% hacia la precipitación de proteínas. </li></ol> Precipitación 3. Proteína <ol><li> Añadir 4 volúmenes de metanol: acetona (50:50) a un volumen de concentrado y agitar durante 10 seg. Incubar toda la noche a -20 ° C. </li><li> Centrifugar a 17000 xg durante 30 min. Decantar el sobrenadantey dejar que el pellet (puede ser invisible) seco en un SpeedVac durante 1 hora (o hasta que se seque). Nota: No más de secar el sedimento ya que esto puede hacer que sea difícil para volver a suspender. </li><li> Suspender el precipitado en 25 l de solución de SDS-extracción. Deje reposar durante una hora y luego volver a suspender pipeteando arriba y abajo. </li><li> Cuantificar la proteína usando un kit de ensayo de proteínas y las instrucciones del fabricante. </li></ol> 4. ADN Precipitación <ol><li> Añadir solución de SDS-extracción a la fracción de concentrado para ser utilizado para la precipitación del ADN hasta que la marca 500 l. Este paso es simplemente para aumentar el volumen de la solución, por lo que es más fácil trabajar con. </li><li> Añadir 0.583 volúmenes de un reactivo de precipitación de proteínas (tales como la proteína MPC reactivo de precipitación) y agitar durante 10 seg. Usted debe ver una forma precipitado blanco. Nota: También hemos utilizado fenol: cloroformo métodos de extracción de ADN, pero es más difícil debido a los bajos volúmenes. Se obtuvieron mejores rendimientos de ADN utilizando elMPC Protein Precipitación Reactivo. </li><li> Centrifugar a 17.000 xg y 4 ° C durante 10 min. </li><li> Transferir el sobrenadante a otro tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y añadir 0,95 volúmenes de isopropanol. Invertir 30-40 veces. </li><li> Centrifugar durante 10 min a 4 ° C a la velocidad máxima. </li><li> Decantar con cuidado y desechar el sobrenadante. </li><li> Enjuague dos veces con 750 l de etanol al 70%. </li><li> Retire la mayor cantidad de etanol como sea posible con la pipeta, luego dejar secar al aire. Nota: No más de secar el ADN ya que esto puede hacer que sea difícil para volver a suspender. </li><li> Resuspender en 25 l de tampón TE bajo, pH 8 (10 mM Tris-HCl, EDTA 0,1 mM). </li><li> Cuantificar el ADN utilizando un kit de ensayo de ADN de doble cadena y las instrucciones del fabricante. Realizar gel de agarosa (1%) electroforesis en 3 l de la ADN para comprobar su calidad. </li></ol> 5. SDS-PAGE gel de proteínas <ol><li> Preparar tampón de muestra (950 l de tampón de muestra Laemmli y 50 l β-mercaptoetanol). &lt;/ li&gt; <li> Añadir el volumen correspondiente de 15 g de proteína, o un máximo de 20 l a un volumen igual de tampón de muestra y hervir durante 4 min. Las muestras se pueden almacenar a -80 ° C hasta el SDS-PAGE se puede realizar. </li><li> Preparar 10% de acrilamida gel de resolución con un gel de apilamiento de acrilamida al 5%. </li><li> Cargar el gel con muestras y 4 l de una escalera de proteínas. Correr el gel a 120 V constante hasta que el 250 kDa marcador escalera solo ha alcanzado el gel de resolución. </li><li> Tinción del gel usando una tinción de Coomassie basado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li></ol> 6. En-gel tripsina Digest y Péptido Extracción Nota: Todos los pasos de aquí hasta 6,10 se realizan en una cabina de seguridad biológica para minimizar la contaminación. <ol><li> Corte el exceso de gel bajo la marca de 10 kDa escalera para cada carril. Cada carril se analizará en el MS / MS por separado. Cortar cada carril en 1 mm x 1 mm cuadrados para aumentar la superficie y colocar todos squares de la vía en un tubo de baja unión a micro-centrífuga. Repita esto para todos los carriles. (Ácido acético al 1% se puede utilizar para evitar que el gel se seque y convertirse en difícil de cortar). Nota: Reducir al mínimo la contaminación es crítica en esta etapa, por lo que el corte en lonchas gel se realiza en una cabina de seguridad biológica en el molde de gel SDS-PAGE de vidrio usado para hacer el gel. </li><li> De-mancha <ol><li> Dispensar 50 l de bicarbonato de amonio 100 mM en cada tubo de baja vinculante, cerca de la tapa y se incuba a 37 ° C durante 10 minutos. </li><li> Dispensar 50 l de acetonitrilo, cerca de la tapa y se incuba a 37 ° C durante 5 min. </li><li> Aspirar y desechar de 150 l. </li><li> Repita los pasos 6.2.1 y 6.2.2. </li><li> Aspirar y desechar 95 l. </li></ol></li><li> Deshidratación <ol><li> Dispensar 50 l de acetonitrilo, cerca de la tapa y espere 5 minutos. Aspirar y desechar 45 l y esperar 10 min. </li></ol></li><li> Reducción <ol><li> Dispensar 50 l de DTT (10 mM, diluido en amm 100 mMbicarbonato de onio), cerca de la tapa y espere 30 minutos a 37 ° C. </li></ol></li><li> Alquilación <ol><li> Dispensar 50 l yodoacetamida (55 mM, diluido en bicarbonato de amonio 100 mM), cerca de la tapa y espere 20 minutos a 37 ° C. </li><li> Prescindir de 100 l de acetonitrilo, cerca de la tapa y se incuba durante 5 minutos a 37 ° C. Aspirar y desechar de 195 l. </li></ol></li><li> lavar <ol><li> Prescindir de bicarbonato de amonio 50 l, cerca de la tapa y se incuba durante 10 minutos a 37 ° C. </li><li> Dispensar 50 l de acetonitrilo, cerca de la tapa y se incuba a 37 ° C durante 5 min. Aspirar y desechar de 120 l. </li></ol></li><li> Deshidratación <ol><li> Dispensar 50 l de acetonitrilo, cerca de la tapa y espere 5 minutos. Aspirar y desechar 45 l. </li><li> Dispensar 50 l de acetonitrilo, espere 5 min. </li><li> Aspirar y desechar 75 l y espere 5 minutos. </li></ol></li><li> Digestión <ol><li> Prescindir de 25 a 30 l de 6 ng / l tripsina (uasta todos los fragmentos de gel están cubiertos). Cerrar la tapa y espere 30 minutos a temperatura ambiente. </li><li> Incubar durante la noche (mínimo 4,5 horas) a 37 ° C. </li><li> Deje reposar a temperatura ambiente durante 30 min. </li></ol></li><li> Extracción y Péptido Transferencia <ol><li> Dispensar 30 l de solución de extracción y cubrir con tapa durante 30 min en hielo. </li><li> Aspirar 30 l y dispensar el volumen aspirado en un nuevo tubo de baja unión marcado. </li><li> Dispensar 12 l de solución de extracción y 12 l de acetonitrilo en el tubo original (con gel). Cerrar la tapa y se incuba durante 30 minutos en hielo. </li><li> Aspirar 15 l y depositará en el nuevo tubo. </li><li> Repita los pasos (6.9.3 y 6.9.4). </li></ol></li><li> Coloque nuevos tubos en un SpeedVac hasta que se seque. </li><li> Resuspender en 50 l de solución de resuspensión. Vortex en medio durante 10 min para volver a suspender. </li><li> Solución de péptido Pipetear en cualquiera de nano / viales LC o placas de 96 pocillos adecuados para nano / LCTrabajo MS / MS. </li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEGAN+analysis+of+metagenomic+data.">MEGAN analysis of metagenomic data.</a> Genome research. 17 (3), 377-3786 (2007).</li><li>Huson, D. H., Mitra, S., Ruscheweyh, H. -. J., Weber, N., Schuster, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+analysis+of+environmental+sequences+using+MEGAN4.">Integrative analysis of environmental sequences using MEGAN4.</a> Genome research. 21 (9), 1552-1560 (2011).</li><li>Ea Ottesen, ., Marin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metatranscriptomic+analysis+of+autonomously+collected+and+preserved+marine+bacterioplankton.">Metatranscriptomic analysis of autonomously collected and preserved marine bacterioplankton.</a> The ISME journal. 5 (12), 1881-1895 (2011).</li><li>Feike, J., J&#252;rgens, K., Hollibaugh, J. T., Kr&#252;ger, S., Jost, G., Labrenz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+unbiased+metatranscriptomics+in+suboxic+waters+of+the+central+Baltic+Sea+using+a+new+in+situ+fixation+system.">Measuring unbiased metatranscriptomics in suboxic waters of the central Baltic Sea using a new in situ fixation system.</a> The ISME journal. 6 (2), 461-470 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La preservación de la muestra es clave para estudios metaproteomic y el trabajo previo demostró que una solución de estabilización de ARN es un tampón de almacenamiento útil para almacenar las células antes de la extracción de proteínas 28. Idealmente, las muestras se conservan in situ para negar los cambios en la expresión de la proteína durante la manipulación 33,34. De hecho, in situ se han desarrollado tecnologías de muestreo y fijación, que permiten la colecció...

Los microorganismos son ubicuos y juegan un papel esencial en los ciclos biogeoquímicos de la Tierra 1. Actualmente, existen numerosos enfoques moleculares disponibles para la caracterización de estructura de la comunidad microbiana y función. El más común es el análisis de secuencias de genes de ARNr 16S amplificó por PCR a partir de ADN ambiental 2 - 4 de. Una desventaja de análisis de genes 16S rRNA es que sólo proporciona información sobre la identidad filogenética y estructura de la comunidad, con poca información sobre la función metabólica. En contraste, los enfoques tales como la metagenómica, metatranscriptomics y metaproteomics proporcionan información sobre la estructura de la comunidad y el metabolismo. La metagenómica, o el análisis del contenido de genes de un conjunto de organismos, incluye información sobre la estructura y el potencial funcional de la comunidad 5-8. Aunque potente, este potencial funcional no puede corresponder a la metabólicalas actividades de los organismos. El genotipo de un organismo está representada por sus genes, cada uno de los cuales puede ser transcrito a ARN y traducido además a la proteína, dando como resultado un fenotipo. Por lo tanto, para ayudar en la comprensión de la actividad funcional microbiana en un ambiente, el análisis post-genómica se debe realizar 9. Metatranscriptomics, o el análisis de las transcripciones de ARN es útil porque revela que los genes se transcriben en cualquier ambiente dado. Sin embargo, los niveles de mRNA no siempre coinciden con sus correspondientes niveles de proteína debido a la regulación de la traducción, la vida media del ARN, y el hecho de que varias copias de la proteína se pueden generar para cada mRNA 10. Por estas razones metaproteomics ahora se reconoce como una herramienta importante para la microbiología ambiental. Metaproteomic Común analiza utilizar un enfoque proteómico escopeta donde el complemento completo cerca de las proteínas en una muestra compleja se purifican y analizan simultáneamente, por lo general a través de endigestión zymatic en péptidos y análisis sobre un espectrómetro de masas. Con posterioridad espectrometría de masas en tándem (MS / MS) &quot;huellas dactilares péptido&quot; se utiliza para determinar la secuencia del péptido y el potencial de proteínas de origen por la búsqueda de datos de proteínas (para una revisión ver 11). Trabajo proteómico ha recorrido un largo camino en los últimos 25 años gracias al aumento de la disponibilidad de datos genómica y el aumento de la sensibilidad y la precisión de los espectrómetros de masas que permitan la identificación de proteínas de alto rendimiento y cuantificación 11,12. Dado que las proteínas son el producto final de la expresión génica, los datos metaproteomic pueden ayudar a determinar qué organismos están activos en un entorno determinado y qué proteínas están expresando. Esto es una ventaja cuando se trata de determinar cómo un conjunto particular de variables ambientales afectará el fenotipo de un organismo o comunidad. Desde el principio, se utilizaron estudios metaproteomic basados ​​en MS MS / en el océano para identificar proteínas específicas dirigidaslinajes microbianos, con el primer estudio se centra en la luz impulsado protones bomba proteorhodopsin en bacterias marinas SAR11 13. Más recientemente, los análisis comparativos metaproteomic han dilucidado los patrones de expresión de proteínas diferenciales entre comunidades complejas. Los ejemplos incluyen la identificación de los cambios temporales en el metabolismo de la costa noroeste del Océano Atlántico 14 o la Península Antártica 5. Otros estudios han descrito variaciones en los patrones de expresión de proteínas a través de escalas espaciales, por ejemplo, a lo largo de un transecto geográfico de un giro oceánico bajo de nutrientes a un sistema de surgencia costera altamente productiva 15. Para más críticas del metaproteomics recomendamos Schneider et al. (2010) 9 y Williams et al. (2014) 16. Proteómica dirigidos también se ha empleado en los últimos años para cuantificar la expresión de las vías metabólicas específicas en el entorno 17,18. El Re son tres fases principales en el análisis metaproteomic. La primera fase es la preparación de muestras, que incluye la recogida de muestras, la lisis celular y la concentración de proteína. La recogida de muestras en microbiología marina a menudo implica la filtración de agua de mar a través de un pre-filtro para eliminar las células más grandes eucariotas, partículas y bacterias de partículas asociadas, seguido de filtración para la captura de células microbianas de estar libres, comúnmente con el uso de un cartucho de 0,22 micras unidad de filtro de 19,20. Estos filtros son incased en un cilindro de plástico y una lisis celular y el protocolo de extracción de proteínas que se pueden realizar dentro de la unidad de filtro sería una herramienta valiosa. Una vez que se obtiene la biomasa, las células deben ser lisadas para permitir la extracción de proteínas. Varios métodos pueden ser empleados, incluyendo guanidina-HCl sulfato de lisis 21 y sodio dodecil (SDS) basados ​​en métodos de lisis. Aunque los detergentes como SDS son muy eficientes en la interrupción de las membranas y solubilizar muchos tipos de proteínas, concentrations precio tan bajo como 0.1% puede interferir con la digestión de proteínas aguas abajo y el análisis MS 22. De mayor preocupación es los efectos negativos de la SDS en la eficiencia digestión con tripsina, poder de resolución de la cromatografía líquida en fase inversa y la supresión de iones o la acumulación dentro de la fuente de iones 23. La segunda fase es de fraccionamiento y análisis, donde las proteínas son sometidas a digestión enzimática seguida por análisis LC MS / MS, dando como resultado patrón de fragmentación am / z que se puede utilizar para determinar la secuencia primaria de aminoácidos del péptido tríptico inicial. Varios métodos de digestión se pueden realizar dependiendo de los tipos de detergentes utilizados, así como el flujo de trabajo aguas abajo espectrometría de masas. En nuestro protocolo, electroforesis PAGE 1-D seguido de la eliminación de SDS a partir del gel se utiliza con el fin de eliminar cualquier contaminación de detergente. El análisis de las proteínas que son difíciles de solubilizar, tales como proteínas de la membrana, requiere el uso de alta concentraciones de SDS u otros detergentes. Esto conduce a problemas de compatibilidad con electroforesis en SDS-gel. Si el objetivo de un estudio requiere la solubilización de estos duros para solubilizar las proteínas, el sistema de tubo de gel se puede utilizar 22,24. El método del tubo-gel incorpora proteínas dentro de la matriz de gel sin el uso de electroforesis. Posteriormente los detergentes utilizados para la solubilización se retiran antes de la digestión de proteínas. La tercera fase es la análisis bioinformático. En esta fase los datos de péptidos MS / MS se busca en una base de datos de secuencias de nucleótidos traducidas para determinar que están presentes en la muestra de péptidos y proteínas. La identificación de péptidos depende de la base de datos es buscado en contra. Datos metaproteomic Marinos son comúnmente búsquedas en contra de las bases de datos compuestas de genomas de referencia, datos de metagenómica como el conjunto de datos Global Océano Muestreo 25, así como los genomas celulares amplificadas individuales de li sin cultivarneages 26,27. Identificación de proteínas también se puede aumentar mediante la inclusión de secuencias metagenomic de la misma muestra como los datos metaproteomic se derivó 5. Aquí nos proporcionan un protocolo para la generación de péptidos adecuados para el análisis basado en MS MS / a partir de biomasa microbiana recogió por filtración y almacenados en una solución de estabilización de ARN. El protocolo descrito aquí permite ADN y proteínas para aislar a partir de la misma muestra para que todos los pasos que conducen a la proteína y las precipitaciones de ADN son idénticos. Desde una perspectiva práctica, se requiere menos de filtración ya que sólo se requiere un filtro para proteínas y extracción de ADN. También nos gustaría reconocer que este protocolo fue creado a través de la combinación, la adaptación y modificación de los dos protocolos previamente publicados. Los pasos de lisis celular son una adaptación de Saito et al. (2011) 28 y la tripsina en gel digerir componente se adapta de ShevcheNKO et al. (2007) 29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterivex -GP 0.22 &#956;m filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SVGP01050</td>
			<td>Sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater Stabilization Solution</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>Sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>77-86-1 or TB0196-500G</td>
			<td>Protein Extraction/ SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632-1G</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>15-21-3</td>
			<td>Protein Extraction/ SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10K Amicon Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337-4L</td>
			<td>Protein Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td>Protein Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPC Protein Precipitation reagent</td>
			<td>Epicenter</td>
			<td>mmP03750</td>
			<td>DNA Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td>DNA Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>DNA Quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Protein Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33211</td>
			<td>Protein Quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0158</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0718</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0375EDU</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CABDH6044-4</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4HCO3</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>1066-33-7</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632-1G</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0507-500ML</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270733-4L</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>144-48-9</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tube 1.5ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL ROBO vial 9mm</td>
			<td>Candian Life Science</td>
			<td>VT009/C395SB</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP BM insert, No spring</td>
			<td>Candian Life Science</td>
			<td>4025P-631</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an aquatic microbial metaproteomics workflow: from cells to tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based analysis

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and metabolism. Although powerful, metagenomics alone can only elucidate functional potential. On the other hand, metaproteomics enables the description of the expressed in situ metabolism and function of a community. Here we describe a protocol for cell lysis, protein and DNA isolation, as well as peptide digestion and extraction from marine microbial cells collected on a cartridge filter unit (such as the Sterivex filter unit) and preserved in an RNA stabilization solution (like RNAlater). In mass spectrometry-based proteomics studies, the identification of peptides and proteins is performed by comparing peptide tandem mass spectra to a database of translated nucleotide sequences. Including the metagenome of a sample in the search database increases the number of peptides and proteins that can be identified from the mass spectra. Hence, in this protocol DNA is isolated from the same filter, which can be used subsequently for metagenomic analysis.

Como demostración, se realizó el protocolo en dos muestras de agua de mar recogidas de la superficie y el máximo de clorofila del océano costero en el norte de Canadá. Mientras que en el mar, 6-7 de L de agua de mar se pasó a través de un GF / D prefiltro 3 micras, a continuación, se recogieron las células microbianas en una unidad de filtro de cartucho de 0,22 micras siguiendo el protocolo de Walsh et al. 20. Las células se almacenan inmediatamente en una solución de estabilización de AR...

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An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis

This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

Un Aquatic Microbial metaproteomics Flujo de trabajo: a partir de células a tríptico péptidos adecuados para el análisis basado en la espectrometría de masas en tándem

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and ...

an-aquatic-microbial-metaproteomics-workflow-from-cells-to-tryptic

Research

JoVE Journal

Environment

8.7K vistas.  Concordia University. This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

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Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study provides a protocol for the passive sampler preparation, calibration, extraction method and instrumental analysis. Sampling rates (RS) and passive sampler-water partition coefficients (KPW) were calculated for silicone rubber, polar organic chemical integrative sampler POCIS-A, POCIS-B, SDB-RPS and C18 disk. The uptake of the selected compounds depended on their physicochemical properties, i.e., silicone rubber showed a better uptake for more hydrophobic compounds (log octanol-water partition coefficient (KOW) &#62; 5.3), whereas POCIS-A, POCIS-B and SDB-RPS disk were more suitable for hydrophilic compounds (log KOW &#60; 0.70).

A protocol about the characterization and application of five different passive sampling devices is presented.

Caracterización y Aplicación de muestreadores pasivos para la vigilancia de plaguicidas en el agua

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study ...

Investigación

Medio ambiente

Alternative Method of Removing Otoliths from Sturgeon

Extracting the otoliths (ear bones) from fish that have very thick skulls can be difficult and very time consuming. The common practice of making a transverse vertical incision on the top of the skull with a hand or electrical saw may damage the otolith if not performed correctly. Sturgeons (Acipenseridae) are one family in particular that have a very large and thick skull. A new laboratory method entering the brain cavity from the ventral side of the fish to expose the otoliths was easier than other otolith extraction methods found in the literature. Methods reviewed in the literature are designed for the field and are more efficient at processing large quantities of fish quickly. However, this new technique was designed to be more suited for a laboratory setting when time is not pressing and successful extraction from each specimen is critical. The success of finding and removing otoliths using this technique is very high and does not compromise the structure in any manner. This alternative technique is applicable to other similar fish species for extracting the otoliths.

The goal of the protocol is to show an effective method to extract the otoliths from sturgeon carcasses.

Método alternativo de Extracción de otolitos de esturión

Extracting the otoliths (ear bones) from fish that have very thick skulls can be difficult and very time consuming. The common practice of making a ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about the overall structure of terrestrial microbial communities. PLFA profiling has been extensively used in a range of ecosystems as a biological index of overall soil quality, and as a quantitative indicator of soil response to land management and other environmental stressors.
The standard method presented here outlines four key steps: 1. lipid extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, 2. fractionation using solid phase extraction columns to isolate phospholipids from other extracted lipids, 3. methanolysis of phospholipids to produce fatty acid methyl esters (FAMEs), and 4. FAME analysis by capillary gas chromatography using a flame ionization detector (GC-FID). Two standards are used, including 1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC(19:0/19:0)) to assess the overall recovery of the extraction method, and methyl decanoate (MeC10:0) as an internal standard (ISTD) for the GC analysis.

Phospholipid fatty acids provide information about the structure of soil microbial communities. We present methods for extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, fractionation of extracted lipids using solid phase extraction columns, and methanolysis to produce fatty acid methyl esters, which are analyzed by capillary gas chromatography.

Extracción y análisis de ácidos grasos de fosfolípidos microbiana en suelos

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond quickly to environmental changes and can be thus used as indicators of water quality. Currently, biofilm assessment is mostly based on integrative and functional endpoints, such as photosynthetic or respiratory activity, which do not provide information on the biofilm community structure. Flow cytometry and computational visualization offer an alternative, sensitive, and easy-to-use method for assessment of the community composition, particularly of the photoautotrophic part of freshwater biofilms. It requires only basic sample preparation, after which the entire sample is run through the flow cytometer. The single-cell optical and fluorescent information is used for computational visualization and biological interpretation. Its main advantages over other methods are the speed of analysis and the high-information-content nature. Flow cytometry provides information on several cellular and biofilm traits in a single measurement: particle size, density, pigment content, abiotic content in the biofilm, and coarse taxonomic information. However, it does not provide information on biofilm composition on the species level. We see high potential in the use of the method for environmental monitoring of aquatic ecosystems and as an initial biofilm evaluation step that informs downstream detailed investigations by complementary and more detailed methods.

Flow cytometry in combination with visual clustering offers an easy-to-use and fast method for studying aquatic biofilms. It can be used for biofilm characterization, detection of changes in biofilm community structure, and detection of abiotic particles embedded in the biofilm.

Caracterización de biopelículas acuáticas con citometría de flujo

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The purpose of this manuscript is to provide detail on how to rapidly sample soil, rhizosphere, and endosphere of replicated field trials and analyze changes that may occur in the microbial communities due to sample type, treatment, and plant genotype. The experiment used to demonstrate these methods consists of replicated field plots containing two, pure, warm-season grasses (Panicum virgatum and Andropogon gerardii) and a low-diversity grass mixture (A. gerardii, Sorghastrum nutans, and Bouteloua curtipendula). Briefly, plants are excavated, a variety of roots are cut and placed in phosphate buffer, and then shaken to collect the rhizosphere. Roots are brought to the laboratory on ice and surface sterilized with bleach and ethanol (EtOH). The rhizosphere is filtered and concentrated by centrifugation. Excavated soil from around the root ball is placed into plastic bags and brought to the lab where a small amount of soil is taken for DNA extractions. DNA is extracted from roots, soil, and rhizosphere and then amplified with primers for the V4 region of the 16S rRNA gene. Amplicons are sequenced, then analyzed with open access bioinformatics tools. These methods allow researchers to test how the microbial community diversity and composition varies due to sample type, treatment, and plant genotype. Using these methods along with statistical models, the representative results demonstrate there are significant differences in microbial communities of roots, rhizosphere, and soil. Methods presented here provide a complete set of steps for how to collect field samples, isolate, extract, quantify, amplify, and sequence DNA, and analyze microbial community diversity and composition in replicated field trials.

Excavation of plant roots from the field as well as processing of samples into endosphere, rhizosphere, and soil are described in detail, including DNA extraction and data analysis methods. This paper is designed to enable other laboratories to use these techniques for the study of soil, endosphere, and rhizosphere microbiomes.

Aislamiento y análisis de comunidades microbianas en el suelo, rizosfera y raíces en los experimentos de pastos perennes

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and toxicological studies. Using automated digital tracking platforms, recent efforts in neuropharmacology are leveraging larval fish locomotor behaviors to identify potential therapeutic targets for novel small molecules. Similar to these efforts, research in the environmental sciences and comparative pharmacology and toxicology is examining various behaviors of fish models as diagnostic tools in tiered evaluation of contaminants and real-time monitoring of surface waters for contaminant threats. Whereas the zebrafish is a popular larval fish model in the biomedical sciences, the fathead minnow is a common larval fish model in ecotoxicology. Unfortunately, fathead minnow larvae have received considerably less attention in behavioral studies. Here, we develop and demonstrate a behavioral profile protocol using caffeine as a model neurostimulant. Though photomotor responses of fathead minnows were occasionally affected by caffeine, zebrafish&#160;were markedly more sensitive for photomotor and locomotor endpoints, which responded at environmentally relevant levels. Future studies are needed to understand comparative behavioral sensitivity differences among fish with age and time of day, and to determine whether similar behavioral effects would occur in nature and be indicative of adverse outcomes at the individual or population levels of biological organization.

Here, we present a protocol to examine larval zebrafish and fathead minnow locomotor activities and photomotor responses (PMR) using an automated tracking software. When incorporated in common toxicology bioassays, analyses of these behaviors provide a diagnostic tool to examine chemical bioactivity. This protocol is described using caffeine, a model neurostimulant.

Protocolo experimental para examinar los perfiles de respuesta conductual en peces larvales: aplicación a la Neuro-estimulantes cafeína

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, we described a protocol for multiple analyses of the biological compositions in environmental PM. Five experiments are presented: (1) PM number monitoring by using a laser particle counter; (2) PM collection by using a cyclonic aerosol sampler; (3) PM collection by using a high-volume air sampler with filters; (4) culturable microbes collection by the Andersen six-stage sampler; and (5) detection of biological composition of environmental PM by bacterial 16SrDNA and fungal ITS region sequencing. We selected hazy days and a livestock farm as two typical examples of the application in this protocol. In this study, these two sampling methods, cyclonic aerosol sampler and filter sampler, showed different sampling efficiency. The cyclonic aerosol sampler performed much better in terms of collecting bacteria, while these two methods showed the same efficiency in collecting fungi. Filter samplers can work under low temperature conditions while cyclonic aerosol samplers have a sampling limitation for temperature. A solid impacting sampler, such as an Andersen six-stage sampler, can be used to sample bioaerosols directly into the culture medium, which increases the survival rate of culturable microorganisms. However, this method mainly relies on culture while more than 99% of microbes cannot be cultured. DNA extracted from the culturable bacteria collected by the Andersen six-stage sampler and samples collected by cyclonic aerosol sampler and filter sampler were detected by bacterial 16S rDNA and fungal ITS region sequencing.All the methods above may have wide application in many fields of study, such as environmental monitoring and airborne pathogen detection. From these results, we can conclude that these methods can be used under different conditions and may help other researchers further explore the health impacts of environmental bioaerosols.

Understanding the biological composition of environmental particulate matter is important for the study of its significant impacts on human health and disease spread. Here, we used three types of bioaerosol sampling methods and a biological analysis of airborne microbes to better explore airborne microbial communities under different environmental conditions.

Composición y análisis de la distribución de bioaerosoles bajo diferentes condiciones ambientales

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...

Identifying Per- and Polyfluorinated Chemical Species with a Combined Targeted and Non-Targeted-Screening High-Resolution Mass Spectrometry Workflow

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the local to federal levels. The continuing evolution of PFAS chemistries presents a challenge to the environmental monitoring, where ongoing development of targeted methods necessarily lags the discovery of new chemical compounds. There is a need, therefore, to have forward-looking methodologies that can detect emerging and unexpected compounds, monitor these species over time, and resolve details of their chemical structure to enable future work in human health. To this end, non-targeted analysis by high-resolution mass spectrometry offers a broad base detection approach that can be combined with almost any sample preparation scheme and provides significant capabilities for compound identification after detection. Herein, we describe a solid-phase extraction (SPE) based sample concentration method tuned for shorter chain and more hydrophilic PFAS chemistries, such as per fluorinated ether acids and sulfonates, and describe analysis of samples prepared in this fashion in both targeted and non-targeted modes. Targeted methods provide superior quantification when reference standards are available but are intrinsically limited to expected compounds when performing analysis. In contrast, a non-targeted approach can identify the presence of unexpected compounds and provide some information about their chemical structure. Information about chemical features can be used to correlate compounds across sample locations and track abundance and occurrence over time.

Here, we present a protocol for the sequential targeted quantification and non-targeted analysis of fluorinated compounds in water by mass spectrometry. This methodology provides quantitative levels of known fluorochemical compounds and identifies unknown chemicals in related samples with semi-quantitative estimates of their abundance.

Identificar por-polifluorado química especies y con un flujo de trabajo combinado dirigida y no dirigida-detección de alta resolución espectrometría de masas

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the ...

Fluorescently Labeled Bacteria as a Tracer to Reveal Novel Pathways of Organic Carbon Flow in Aquatic Ecosystems

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial communities has many limitations, and determining a predator, prey, and predatory rates is often difficult. Presented here is an optimized method based on the addition of fluorescently labelled prey as a tracer, which allows for reliable quantitation of the grazing rates in aquatic predatory eukaryotes and estimation of nutrient transfer to higher trophic levels.

Presented here is a protocol for a single-cell, epifluorescence microscopy-based technique to quantify grazing rates in aquatic predatory eukaryotes with high precision and taxonomic resolution.

Bacterias etiquetadas fluorescentes como un rastreador para revelar nuevos caminos de flujo de carbono orgánico en ecosistemas acuáticos

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial ...

A Guide to Concentration Alternating Frequency Response Analysis of Fuel Cells

An experimental setup capable of generating a periodic concentration input perturbation of oxygen was used to perform concentration-alternating frequency response analysis (cFRA) on proton-exchange membrane (PEM) fuel cells. During cFRA experiments, the modulated concentration feed was sent to the cathode of the cell at different frequencies. The electric response, which can be cell potential or current depending on the control applied on the cell, was registered in order to formulate a frequency response transfer function. Unlike traditional electrochemical impedance spectroscopy (EIS), the novel cFRA methodology makes it possible to separate the contribution of different mass transport phenomena from the kinetic charge transfer processes in the frequency response spectra of the cell. Moreover, cFRA is able to differentiate between varying humidification states of the cathode. In this protocol, the focus is on the detailed description of the procedure to perform cFRA experiments. The most critical steps of the measurements and future improvements to the technique are discussed.

We present a protocol for concentration alternating frequency response analysis of fuel cells, a promising new method of studying fuel cell dynamics.

Una guía para la concentración Análisis de respuesta de frecuencia alterna de células de combustible

An experimental setup capable of generating a periodic concentration input perturbation of oxygen was used to perform concentration-alternating frequency ...