The authors would like to acknowledge Marcos Di Falco for his expertise and advice with the preparation of the samples for nano-LC MS/MS as well as Dr. Zoran Minic from the University of Regina for the LC MS/MS analysis. This work was supported by NSERC (DG402214-2011) and CRC (950-221184) funding. D.C. was supported by Concordia Institute for Water, Energy, and Sustainable Systems and FQRNT.

1. Reaktifler hazırlayın <ol><li> SDS-ekstraksiyon çözeltisi hazırlayın: 0.1 M Tris-HCl pH 7.5, 5% gliserol, 10 mM EDTA ve% 1 SDS. 4 ° C&#39;de 0.22 mikron filtre ve mağaza kullanarak Filtre sterilize. </li><li> Poliakrilamid jeli için ihtiyaç duyulan Stok reaktifleri hazırlayın. <ol><li> 1.5 M Tris-HCl pH 8.8 hazırlanır. Oda sıcaklığında 0.22 mikron filtre ve mağaza kullanarak Filtre sterilize. </li><li> 0.5 M Tris-HCL pH 6.8. Oda sıcaklığında 0.22 mikron filtre ve mağaza kullanarak Filtre sterilize. </li><li> % 10 SDS hazırlayın. Filtre, oda sıcaklığında 0.22 mikron filtre ve mağaza kullanarak sterilize edin. </li></ol></li><li> -Jel tripsin sindirimi ve peptit çıkarılması için gerekli çözümler hazırlayın. <ol><li> 100 mM amonyum bikarbonat hazırlayın. 4 ° C&#39;de 0.22 mikron filtre ve mağaza kullanarak Filtre sterilize. </li><li> 1 M DTT stokları hazırlayın. -80 ° C de 100 mM amonyum bikarbonat ve mağaza içinde süspansiyona alınmıştır. </li><li> 550 mM iyodoasetamit stokları hazırlayın. Içinde askıda100 mM -80 ° C de amonyum bikarbonat ve saklayın. </li><li> 100 ng hazırlayın / tripsin stokları ul. -80 ° C&#39;de 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine 60 ul kısım ve mağaza. </li><li> % 1 formik asit,% 2 asetonitril: ekstraksiyon çözeltisi hazırlayın. </li><li> 5% asetonitril ve% 0.1 formik asit: yeniden süspansiyon haline çözeltisi hazırlayın. </li></ol></li></ol> 2. RNA İstikrar Çözüm Konserve Hücreleri ile Kartuş Filtre Ünitesinde Hücre Lizis gerçekleştirin <ol><li> Kartuş filtre ünitesi (1,5 mi) içinde ve filtrenin luer-lock ucuna monte edilmiş bir 60 ml şırınga kullanılarak bir 2 ml mikrosantrifüj tüpü içine RNA stabilizasyonu çözeltisi boşaltınız. </li><li> Herhangi bir hücre kalıntıları topak haline 17.000 x g&#39;de 10 dakika boyunca 2 ml mikrosantrifüj tüpü santrifüjleyin. Adım 2.3 filtre yapışmasına neden kalmaması bu yapılır. </li><li> Donma / tha parçalanmış olan hücrelerinden kaynaklanan herhangi proteinleri yakalamak için 10 K ultrasentrifugal filtre ünitesine süpernatant aktarınörnek w. Pelet atmayın. Bu adım 2.5 kullanılacaktır. 30 dakika boyunca ya da hacme kadar 3270 x g&#39;de ultrasentrifugal filtre ünitesinin santrifüj uygulayın yaklaşık 600 ul azalttı. </li><li> Bir p10 ucu ucu eritin ve ucu açık ucu ile kartuş filtre ünitesinin olmayan luer-lock tarafını engeller. Bu bir ekstraksiyon tampon ve biyokütle adımlar 2,5-2,7 sırasında kaçar sağlayacaktır. </li><li> 1 ml SDS-ekstraksiyon çözeltisi içinde pelet Askıya ve orijinal kartuş filtre ünitesinin içine pipetle. Kartuş filtre ünitesine pipetle için en kolay yolu P1000 ucuna P200 ucu yığını ve pipetleme için bu çifte uç kullanmaktır. </li><li> Toplam hacim yaklaşık 2 ml olacak şekilde kartuş filtre ünitesine SDS ekstraksiyon çözeltisi 1 ml ilave edilir ve, bir hibridizasyon etüvü içinde dönerken, oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir. 3 buruşuk laboratuvar 50 ml&#39;lik konik tüp dibinde mendil yerleştirin. Kapalı kartuş filtre ünitesinin iki ucunu parafilmve 50 ml tüp içine kartuş filtre ünitesi koydu. Kapağı kapatın ve melezleme fırına tüp koymak. </li><li> 10 dakika sonra yere Sterivex bir köpük şamandıra filtre ve luer-lock ucunda 5 ml şırınga ile yerine sabitleyin. Float ve 15 dakika için 95 ° C su banyosu içinde inkübe edilir. </li><li> Serin kartuş filtre ünitesini Let (adım 2.6 olduğu gibi), 1 saat boyunca oda sıcaklığında döner. </li><li> (Adım 2.3) önceki ile aynı ultrasentrifugal filtre ünitesine 60 ml&#39;lik şırınga ile filtre üzerinden SDS ekstraksiyon çözeltisi / hücre lizat boşaltınız. Kartuş filtre birimi için taze SDS ekstraksiyon çözeltisi 1 ml ilave edilir ve elle 30 saniye boyunca karıştırılır, daha sonra 60 ml şırınga kullanılarak ultrasentrifugal filtre ünitesine kovmak. Bu, tüm proteinler kaldırılmıştır emin olmak için kartuş filtre ünitesi durulama etmektir. </li><li> 3270 xg veya filtre ünitesinde hacme kadar 45 dakika boyunca ultrasentrifugal filtre ünitesinin üzerinde santrifüj uygulayın az 600 ul. </li><li> Iskarta akış ve taze SDS-ekstraksiyon çözeltisi ile kontör ultrasentrifugal filtre ünitesi. </li><li> X g 3.270 başka 45 dakika filtre ünitesini santrifüjleyin. </li><li> Tekrarlayın iki kez daha 2.11 ve 2.12 adımları. Ultrasentrifugal filtre ünitesinde son hacim sağlamak nihai spin sonunda en az 600 ml. </li><li> Bu noktada, iki konsantre ayrıldı. Bir fraksiyon toplandı ve DNA çökeltme için kullanılmaktadır ve bu protein çökelmesi için diğer olacaktır. Not: fraksiyon miktarı süzüldü biyokütle miktarı ve ürünlerin kullanım amaçları bağlıdır. Bizim durumumuzda, DNA çökeltme doğru% 10 ve protein yağış doğru% 90 ile konsantre bölün. </li></ol> 3. Protein Yağış <ol><li> 10 sn için konsantresi ve vorteks bir hacim aseton (50:50): 4 hacim metanol ekleyin. -20 ° C de bir gece inkübe edilir. </li><li> 30 dakika boyunca 17.000 xg aşağı doğru döndürün. Süpernatant Durusuve pelet 1 saat (veya kuru kadar) bir speedvac kuru (görünmez olabilir) olsun. Not: over pelet kurulayın etmeyin bu tekrar süspansiyon zor hale getirebilir olarak. </li><li> SDS-ekstraksiyon çözeltisi 25 ul pelet süspanse edin. Sonra yukarı ve aşağı pipetleme tekrar süspansiyon bir saat boyunca bekletin. </li><li> Bir protein tahlil kiti ve üreticilerin talimatları kullanarak protein niceliğini. </li></ol> 4. DNA Yağış <ol><li> Konsantre fraksiyonu, SDS-ekstraksiyon solüsyonu ilave 500 ul işareti kadar DNA çökeltme için kullanılır. Bu adım, çözümün hacmini artırmak daha kolay çalışmak için yapım için basitçe. </li><li> 10 saniye boyunca ve vorteks (örneğin MPC protein yağış reaktifi gibi) bir protein yağış reaktif 0.583 hacimleri ekleyin. Sen beyaz bir çökelti şeklinde görmelisiniz. Not: Biz de fenol kullandık: kloroform DNA ekstraksiyon yöntemleri, fakat düşük miktarlar daha zordur. Biz kullanarak daha iyi DNA verimi eldeMPC Protein Yağış Reaktif. </li><li> 17.000 x g&#39;de santrifüjleyin ve 10 dakika boyunca 4 ° C. </li><li> Başka bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüp süpernatantı aktarın ve izopropanol 0.95 hacimlerini ekleyin. 30-40 kez ters çevirin. </li><li> Maksimum hızda 4 ° C sıcaklıkta 10 dakika boyunca santrifüj. </li><li> Dikkatle süzün ve supernatant atın. </li><li> % 70 etanol içinde 750 ul iki kez yıkayın. </li><li> Kadar etanol pipetleme mümkün olduğunca kaldırın, ardından hava kurumaya bırakın. Not: over DNA kurutun etmeyin bu tekrar süspansiyon zor hale getirebilir olarak. </li><li> Düşük TE tamponu, pH 8 (10 mM Tris-HCI, 0.1 mM EDTA) 25 ul içinde süspanse. </li><li> Bir dsDNA tahlil kiti ve üreticilerin talimatları kullanarak DNA niceliğini. Kalitesini kontrol etmek için DNA 3 ul agaroz jeli (% 1) elektroforez gerçekleştirin. </li></ol> Proteinlerin 5. SDS-PAGE Jeli <ol><li> Örnek tampon hazırlayın (950 ul Laemmli numune tamponu ve 50 ul β-merkaptoetanol). &lt;/ li&gt; <li> Protein 15 ug tekabül eden hacim veya numune tamponunun eşit hacimde 20 ul bir maksimum ilave edin ve 4 dakika boyunca kaynatılır. SDS-PAGE gerçekleştirilebilir kadar Örnekler hemen -80 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> % 5 akrilamid istifleme jeli ile% 10 akrilamid çözülmesi jel hazırlayın. </li><li> Örnekler ve bir protein merdiveni 4 ul jel yükleyin. 250 kDa merdiven işaretleyici kadar sabit 120 V de jel çalıştırın, sadece çözülmesi jel ulaşmıştır. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak leke göre Coomassie kullanılarak jel leke. </li></ol> 6. In-jel tripsin Digest ve Peptid Ekstraksiyon Not: 6.10 kadar buradan tüm adımlar kontaminasyonu en aza indirmek için bir biyolojik güvenlik kabini yapılmaktadır. <ol><li> Her kulvar için 10 kDa merdiven işaretinin altında aşırı jel kesti. Her kulvar ayrı ayrı MS / MS analiz edilecektir. Yüzey alanını artırmak için 1 mm x 1 mm kare içine her şerit kesin ve squa yerDüşük bağlayıcı mikro santrifüj tüpüne şerit res. Tüm şeritleri için bu işlemi tekrarlayın. (% 1 asetik asit kurutmadan ve kesmek zor hale gelen jel önlemek için kullanılabilir). Not: kirlenmesini en aza indirgeme Bu aşamada önemli olan, bu yüzden kesme jel jel yapmak için kullanılan cam SDS-PAGE jelinin bir kalıp üzerinde bir biyolojik güvenlik kabinine gerçekleştirilir. </li><li> De-leke <ol><li> Her bir düşük bağlanma borusu yakın kapağa 100 mM amonyum bikarbonat, 50 ul koyun ve 10 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Asetonitril, yakın kapağın 50 ul koyun ve 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Aspire ve 150 ul atın. </li><li> Tekrarlayın 6.2.1 ve 6.2.2 numaralı adımları. </li><li> Aspire ve 95 ul atın. </li></ol></li><li> Dehidrasyon <ol><li> 50 ul asetonitril, yakın kapağı koyun ve 5 dakika bekleyin. Aspire ve 45 ul atmak ve 10 dakika bekleyin. </li></ol></li><li> Azaltma <ol><li> 100 mM AMM içinde seyreltilmiş 50 ul DTT (10 mM, koyunonyum bikarbonat) yakın kapak ve 37 ° C&#39;de 30 dakika bekleyin. </li></ol></li><li> Alkilasyon <ol><li> (100 mM amonyum bikarbonat içinde seyreltilmiş 55 mM), 50 ul iodoacetamide yakın kapak dağıtma ve 37 ° C de 20 dakika bekleyin. </li><li> Asetonitril, yakın kapağın 100 ul koyun ve 37 ° C&#39;de 5 dakika inkübe edilir. Aspire ve 195 ul atın. </li></ol></li><li> Yıkama <ol><li> 50 ul, amonyum bikarbonat, yakın kapak dağıtma ve 37 ° C&#39;de 10 dakika inkübe edilir. </li><li> Asetonitril, yakın kapağın 50 ul koyun ve 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Aspire ve 120 ul atın. </li></ol></li><li> Dehidrasyon <ol><li> 50 ul asetonitril, yakın kapağı koyun ve 5 dakika bekleyin. Aspire ve 45 ul atın. </li><li> Asetonitril 50 ul dağıtın, 5 dakika bekleyin. </li><li> Aspire ve 75 ul atmak ve 5 dakika bekleyin. </li></ol></li><li> Hazım <ol><li> 25-30 ul ng 6 dağıtın / u (tripsin ul arasındantil tüm jel fragmanları) kaplıdır. Kapağı kapatın ve oda sıcaklığında 30 dakika bekleyin. </li><li> 37 ° C&#39;de gece boyunca (4,5 saat az) inkübe edin. </li><li> 30 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletin. </li></ol></li><li> Ekstraksiyon ve Peptit Transferi <ol><li> Ekstraksiyon çözeltisinin 30 ul koyun ve buz üzerinde 30 dakika boyunca kapak ile kapatın. </li><li> Aspire 30 ul ve yeni etiketli düşük bağlayıcı tüp içinde aspire hacmini dağıtmak. </li><li> Ekstraksiyon çözeltisi 12 ul ve (jel) ile orijinal tüp içine asetonitril 12 ul koyun. Kapağı kapatın ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edilir. </li><li> Yeni bir tüp içine aspire 15 ul ve mevduat. </li><li> Adımları tekrarlayın (6.9.3 ve 6.9.4). </li></ol></li><li> Kuru kadar SpeedVac yeni tüpler yerleştirin. </li><li> Süspansiyon solüsyonunun 50 ul içinde süspanse. 10 dakika boyunca ortam üzerinde Vortex tekrar süspansiyon. </li><li> Nano / LC uygun nano / LC şişeleri veya 96-kuyucuğu ya içine pipet peptid çözümüMS / MS çalışır. </li></ol>

<ol>
	<li>Madsen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microorganisms+and+their+roles+in+fundamental+biogeochemical+cycles.">Microorganisms and their roles in fundamental biogeochemical cycles.</a> Current opinion in biotechnology. 22 (3), 456-464 (2011).</li><li>El-Swais, H., Dunn, K. A., Bielawski, J. P., Li, W. K. W., Walsh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+assemblages+and+short-lived+blooms+in+coastal+northwest+Atlantic+Ocean+bacterioplankton.">Seasonal assemblages and short-lived blooms in coastal northwest Atlantic Ocean bacterioplankton.</a> Environmental microbiology. , (2014).</li><li>Galand, P. E., Potvin, M., Casamayor, E. O., Lovejoy, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrography+shapes+bacterial+biogeography+of+the+deep+Arctic+Ocean.">Hydrography shapes bacterial biogeography of the deep Arctic Ocean.</a> The ISME journal. 4 (4), 564-576 (2010).</li><li>Lane, D. J., Pace, B., Olsen, G. J., Stahlt, D. A., Sogint, M. L., Pace, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+16S+ribosomal+RNA+sequences+for+phylogenetic+analyses.">Rapid determination of 16S ribosomal RNA sequences for phylogenetic analyses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83, 4972 (1986).</li><li>Williams, T. J., Long, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+metaproteomic+assessment+of+winter+and+summer+bacterioplankton+from+Antarctic+Peninsula+coastal+surface+waters.">A metaproteomic assessment of winter and summer bacterioplankton from Antarctic Peninsula coastal surface waters.</a> The ISME journal. 6 (10), (2012).</li><li>Sheik, C. S., Jain, S., Dick, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+flexibility+of+enigmatic+SAR324+revealed+through+metagenomics+and+metatranscriptomics.">Metabolic flexibility of enigmatic SAR324 revealed through metagenomics and metatranscriptomics.</a> Environmental microbiology. 16 (1), 304-317 (2014).</li><li>Venter, J. C., Remington, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+genome+shotgun+sequencing+of+the+Sargasso+Sea.">Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea.</a> Science (New York, N.Y.). 304, 66-74 (2004).</li><li>Tyson, G. W., Chapman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+structure+and+metabolism+through+reconstruction+of+microbial+genomes+from+the+environment.">Community structure and metabolism through reconstruction of microbial genomes from the environment.</a> Nature. 428, 37-43 (2004).</li><li>Schneider, T., Riedel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmental+proteomics:+analysis+of+structure+and+function+of+microbial+communities.">Environmental proteomics: analysis of structure and function of microbial communities.</a> Proteomics. 10 (4), 785-798 (2010).</li><li>Vogel, C., Marcotte, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+regulation+of+protein+abundance+from+proteomic+and+transcriptomic+analyses.">Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses.</a> Nature reviews. Genetics. 13 (4), 227-232 (2012).</li><li>Hettich, R. L., Pan, C., Chourey, K., Giannone, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaproteomics:+harnessing+the+power+of+high+performance+mass+spectrometry+to+identify+the+suite+of+proteins+that+control+metabolic+activities+in+microbial+communities.">Metaproteomics: harnessing the power of high performance mass spectrometry to identify the suite of proteins that control metabolic activities in microbial communities.</a> Analytical chemistry. 85 (9), 4203-4214 (2013).</li><li>Von Bergen, M., Jehmlich, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+quantitative+metaproteomics+and+protein-stable+isotope+probing+into+microbial+ecology.">Insights from quantitative metaproteomics and protein-stable isotope probing into microbial ecology.</a> The ISME journal. 7 (10), 1877-1885 (2013).</li><li>Giovannoni, S. J., Bibbs, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteorhodopsin+in+the+ubiquitous+marine+bacterium+SAR11.">Proteorhodopsin in the ubiquitous marine bacterium SAR11.</a> Nature. 438 (7064), 82-85 (2005).</li><li>Georges, A. A., El-Swais, H., Craig, S. E., Li, W. K., Walsh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metaproteomic+analysis+of+a+winter+to+spring+succession+in+coastal+northwest+Atlantic+Ocean+microbial+plankton.">Metaproteomic analysis of a winter to spring succession in coastal northwest Atlantic Ocean microbial plankton.</a> The ISME journal. , 1-13 (2014).</li><li>Morris, R. M., Nunn, B. L., Frazar, C., Goodlett, D. R., Ting, Y. S., Rocap, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+metaproteomics+reveals+ocean-scale+shifts+in+microbial+nutrient+utilization+and+energy+transduction.">Comparative metaproteomics reveals ocean-scale shifts in microbial nutrient utilization and energy transduction.</a> The ISME journal. 4 (5), 673-685 (2010).</li><li>Williams, T. J., Cavicchioli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marine+metaproteomics:+deciphering+the+microbial+metabolic+food+web.">Marine metaproteomics: deciphering the microbial metabolic food web.</a> Trends in microbiology. 22 (5), 248-260 (2014).</li><li>Saito, M. a., McIlvin, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+nutrient+stresses+at+intersecting+Pacific+Ocean+biomes+detected+by+protein+biomarkers.">Multiple nutrient stresses at intersecting Pacific Ocean biomes detected by protein biomarkers.</a> Science. 345 (6201), 1173-1177 (2014).</li><li>Bertrand, E., Moran, D., McIlvin, M., Hoffman, J., Allen, A., Saito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methionine+synthase+interreplacement+in+diatom+cultures+and+communities:+Implications+for+the+persistence+of+B12+use+by+eukaryotic+phytoplankton.">Methionine synthase interreplacement in diatom cultures and communities: Implications for the persistence of B12 use by eukaryotic phytoplankton.</a> Limnology and Oceanography. 58 (4), 1431-1450 (2013).</li><li>Hawley, A. K., Kheirandish, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+tools+for+investigating+microbial+community+structure+and+function+in+oxygen-deficient+marine+waters.">Molecular tools for investigating microbial community structure and function in oxygen-deficient marine waters.</a> Methods in enzymology. 531, 305-329 (2013).</li><li>Da Walsh, ., Zaikova, E., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+volume+(1-3L)+filtration+of+coastal+seawater+samples.">Small volume (1-3L) filtration of coastal seawater samples.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (28), 1-2 (2009).</li><li>Thompson, M., Chourey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+approach+for+deep+proteome+measurements+from+small-scale+microbial+biomass+samples.">Experimental approach for deep proteome measurements from small-scale microbial biomass samples.</a> Analytical. 80 (24), 9517-9525 (2008).</li><li>Lu, X., Digestion Zhu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tube-Gel. , 1948-1958 (2005).</li><li>Sharma, R., Dill, B. D., Chourey, K., Shah, M., VerBerkmoes, N. C., Hettich, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+a+detergent+lysis/cleanup+methodology+with+intact+protein+fractionation+for+enhanced+proteome+characterization.">Coupling a detergent lysis/cleanup methodology with intact protein fractionation for enhanced proteome characterization.</a> Journal of proteome research. 11 (12), 6008-6018 (2012).</li><li>Santoro, A. E., Dupont, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+proteomic+characterization+of+"Candidatus+Nitrosopelagicus+brevis":+An+ammonia-oxidizing+archaeon+from+the+open+ocean.">Genomic and proteomic characterization of "Candidatus Nitrosopelagicus brevis": An ammonia-oxidizing archaeon from the open ocean.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (4), 1173-1178 (2015).</li><li>Rusch, D. B., Halpern, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sorcerer+II+Global+Ocean+Sampling+expedition:+northwest+Atlantic+through+eastern+tropical+Pacific.">The Sorcerer II Global Ocean Sampling expedition: northwest Atlantic through eastern tropical Pacific.</a> PLoS biology. 5 (3), e77 (2007).</li><li>Swan, B. K., Martinez-Garcia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+for+chemolithoautotrophy+among+ubiquitous+bacteria+lineages+in+the+dark+ocean.">Potential for chemolithoautotrophy among ubiquitous bacteria lineages in the dark ocean.</a> Science (New York, N.Y.). 333 (6047), 1296-1300 (2011).</li><li>Rinke, C., Schwientek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+phylogeny+and+coding+potential+of+microbial+dark+matter.">Insights into the phylogeny and coding potential of microbial dark matter.</a> Nature. 499 (7459), 431-437 (2013).</li><li>Saito, M. A., Bulygin, V. V., Moran, D. M., Taylor, C., Scholin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+microbial+proteome+preservation+techniques+applicable+to+autonomous+environmental+sample+collection.">Examination of microbial proteome preservation techniques applicable to autonomous environmental sample collection.</a> Frontiers in microbiology. 2, 215 (2011).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, J. H., Olsen, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature protocols. 1 (6), 2856-2860 (2007).</li><li>Thomas, T., Gilbert, J., Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomics+-+a+guide+from+sampling+to+data+analysis.">Metagenomics - a guide from sampling to data analysis.</a> Microbial Informatics and Experimentation. 2 (1), 3 (2012).</li><li>Huson, D. H., Auch, A. F., Qi, J., Schuster, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEGAN+analysis+of+metagenomic+data.">MEGAN analysis of metagenomic data.</a> Genome research. 17 (3), 377-3786 (2007).</li><li>Huson, D. H., Mitra, S., Ruscheweyh, H. -. J., Weber, N., Schuster, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+analysis+of+environmental+sequences+using+MEGAN4.">Integrative analysis of environmental sequences using MEGAN4.</a> Genome research. 21 (9), 1552-1560 (2011).</li><li>Ea Ottesen, ., Marin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metatranscriptomic+analysis+of+autonomously+collected+and+preserved+marine+bacterioplankton.">Metatranscriptomic analysis of autonomously collected and preserved marine bacterioplankton.</a> The ISME journal. 5 (12), 1881-1895 (2011).</li><li>Feike, J., J&#252;rgens, K., Hollibaugh, J. T., Kr&#252;ger, S., Jost, G., Labrenz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+unbiased+metatranscriptomics+in+suboxic+waters+of+the+central+Baltic+Sea+using+a+new+in+situ+fixation+system.">Measuring unbiased metatranscriptomics in suboxic waters of the central Baltic Sea using a new in situ fixation system.</a> The ISME journal. 6 (2), 461-470 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Örnek korunması metaproteomic çalışmalara anahtarıdır ve önceki iş bir RNA stabilizasyonu çözümü öncesinde protein ekstraksiyon 28 hücreleri saklamak için kullanışlı bir depolama tampon olduğunu göstermiştir. İdeal olarak, numuneler 33,34 taşıma sırasında protein ifadesindeki vardiya inkâr yerinde korunmuş olacaktır. Aslında, yerinde numune alma ve sabitleme teknolojileri gemi dağıtılan araçlarla özerk toplama ve numunelerin saklanması için iz...

Mikroorganizmalar her yerde ve Dünya&#39;nın biyokimyasal döngüler 1 temel rol oynamaktadır. Şu anda, mikrobiyal topluluk yapısını ve işlevini tanımlamak için kullanılabilir birçok moleküler yaklaşımlar vardır. 4 - En yaygın 16S rRNA geninin analizi, çevre DNA 2 PCR ile amplifiye dizileri. 16S rRNA gen analizi bir dezavantajı sadece bir metabolik fonksiyonu ile ilgili çok az bilgi, filogenetik kimlik ve toplum yapısı hakkında bilgi temin etmesidir. Metagenomik, metatranscriptomics ve metaproteomics toplum yapısı ve metabolizma hakkında bilgi vermek olarak tersine, bu tür yaklaşımları. 8 - Metagenomiks veya organizmaların bir topluluğu gen içeriğinin analizi, toplum 5 yapısı ve fonksiyonel potansiyeli hakkında bilgi sağlar. Güçlü olmasına rağmen, bu fonksiyonel potansiyeli metabolik uygun olmayabilirorganizmaların faaliyetleri. Bir organizmanın genotipi RNA&#39;ya transkribe ve ayrıca bir fenotipe yol açacak şekilde proteine ​​tercüme edilebilir, her biri kendi gen tarafından temsil edilmektedir. Bu nedenle, bir ortamda mikrop fonksiyonel aktivite anlaşılmasına yardım etmek için, post-genomik analizi 9 yapılmalıdır. Bu, herhangi bir ortamda transkripsiyonu hangi genlerin ortaya için Metatranscriptomics ya da RNA transkriptlerinin analizinin yararlıdır. Ancak, mRNA düzeyleri nedeniyle her zaman öteleme yönetmelik, RNA yarılanma ömrü ve birden çok protein kopyaları her mRNA 10 oluşturulabilir gerçeğini bunlara karşılık gelen protein düzeyleri uyuşmuyor. Bu nedenlerle metaproteomics için artık çevre mikrobiyolojisi için önemli bir araç olarak kabul edilmektedir. Ortak metaproteomic karmaşık bir numunede proteinlerin yakın tam tamamlayıcı genellikle tr aracılığıyla, saflaştırılmış ve eş zamanlı olarak analiz edilir bir tüfek proteomik yaklaşım kullanır analizleriBir kütle spektrometresi üzerinde peptitler ve analize Enzimatik sindirim. Daha sonra bir tandem kütle spektrometrisi (MS / MS) &quot;peptit parmak izi&quot; arama protein veritabanı tarafından peptid dizisi ve kaynaklı olası protein (Bir inceleme için bakınız 11) belirlemek için kullanılır. Proteomik iş genomik veri kullanılabilirliği artış ve hassasiyet ve yüksek verimli protein tanımlanması ve ölçümü 11,12 sağlayan kitle spektrometre doğruluğu artışa geçmiş 25 yıl sayesinde uzun bir yol kat etti. Proteinler gen ifadesinin nihai ürün olduğundan, metaproteomic veriler herhangi bir ortamda ve hangi proteinler dile getiriyorlar aktif olan organizmalar belirlemenize yardımcı olabilir. Çevresel değişkenler belirli bir dizi bir organizmanın ya da topluluğun fenotip nasıl etkileyeceğini belirlemek için çalışırken bu avantajlıdır. Erken, okyanusta MS / MS-tabanlı metaproteomic çalışmalarda hedeflenen belirli proteinleri belirlemek için kullanıldıSAR11 deniz bakteri 13 ışık tahrik proton pompa proteorhodopsin odaklanan ilk çalışma ile mikrobiyal soy. Daha yakın zamanlarda, karşılaştırmalı analizler metaproteomic karmaşık topluluklar arasındaki fark protein ekspresyonu aydınlatmıştır. Örnekler kıyı Kuzeybatı Atlantik Okyanusu 14 veya Antarktika Yarımadası&#39;nın 5 metabolizmasında zamansal değişimlerin belirlenmesini içermektedir. Diğer çalışmalar son derece verimli kıyı upwelling sistemine 15 düşük besin okyanus gyre bir coğrafi transekt boyunca, örneğin, mekansal ölçekler arasında protein ekspresyonu varyasyonları nitelendirdiler. Metaproteomics daha değerlendirme için biz Schneider vd., (2010), 9 ve Williams ve ark. (2014) 16 önerilir. Hedeflenen proteomiks ayrıca çevre 17,18 belirli metabolik yollar ifadesini ölçmek için son yıllarda istihdam edilmiştir. Thermetaproteomic analizde üç ana aşamalar e bulunmaktadır. İlk aşama, örnek toplama hücre parçalanması ve protein konsantrasyonu içeren örnek hazırlama vardır. Deniz mikrobiyoloji örnek toplama yaygın haliyle, bir 0.22 mikron kartuş kullanımı ile, serbest yaşayan mikrobiyal hücrelerin yakalanması için, süzme, ardından daha büyük bir ökaryotik hücreler, partikül ve partikül ilişkili bakteriler kaldırmak için bir ön-filtre, geçen deniz filtrasyon gerektirir Filtre ünitesi 19,20. Bu filtreler, plastik bir silindir incased edilmiştir ve filtre birimi içinde yapılabilir, bir hücre parçalama ve protein ekstre protokolü değerli bir araç olabilir. Biyokütle elde edildikten sonra, hücreler, protein ekstraksiyonu sağlamak için lize gerekir. Çeşitli yöntemler guanidin-HCl çözme 21 sodyum dodesil sülfat (SDS) tabanlı parçalama yöntemleri de dahil olmak üzere, kullanılabilir. SDS gibi deterjanlar, dikkat yoğunluğu birçok protein türleri zarları engellemeden ve çözülebilen çok verimli olmasına rağmen% 0.1 aşağı protein sindirimi ve MS analizi 22 ile müdahale gibi düşük ons. Önemli bir endişe iyon kaynağı 23 içindeki ters faz sıvı kromatografisi ve iyon bastırılması veya birikim çözme gücü, tripsin sindirim verimliliği üzerinde SDS olumsuz etkilerdir. İkinci faz proteinleri, ilk triptik peptid primer amino asit dizisini belirlemek için kullanılabilir am / z parçalanma örnekle sonuçlanan, LC MS / MS analizi ile izlenmiştir enzimatik sindirme tabi tutulur fraksiyonasyon ve analizdir. Çeşitli sindirim yöntemleri kullanılmıştır deterjan tipleri, hem de aşağı doğru kütle spektrometrisi akışı bağlı olarak gerçekleştirilebilir. Protokolde, jelden SDS ile uzaklaştırılarak elde edilmiş 1-D PAGE elektroforez herhangi bir deterjan kontaminasyonu ortadan kaldırmak için kullanılmaktadır. , Membran proteinleri gibi, çözündürülmesi zordur proteinlerin analiz, yüksek konsantre ve kullanımını gerektirirSDS veya diğer deterjan yerel yönetim bu. Bu, SDS-jel elektroforezi ile uyumluluk sorunları yol açar. Bir çalışmanın amacı, proteinleri çözmek için bu zor çözünür hale gerektiriyorsa, tüp jel sistemi, 22,24 kullanılabilir. Tüp jel elektroforezi yöntemi kullanılmadan edilmiş jel matrisi içinde protein içerir. Ardından çözünürlük için kullanılan herhangi bir deterjanlar protein sindirimi önce kaldırılır. Üçüncü aşama biyoinformatik analizi. Bu aşamada, MS / MS verileri peptid peptidler ve proteinler numunede mevcut olan belirlemek için çevrilen nükleotid dizilerinin bir veri tabanına karşı araştırılmıştır. Peptidler tanımlanması o karşı aranır veritabanı bağlıdır. Deniz metaproteomic veriler genellikle referans genomları, Küresel Okyanus Örnekleme veri kümesi 25 olarak metagenomic veriler yanı sıra ekilmemiş li gelen tek bir hücre amplifiye genomları oluşan veritabanları karşı aranır26,27 neages. Metaproteomic veriler 5 türetilmiş gibi protein tanımlanması aynı örnekten metagenomic dizilerin dahil edilmesi ile artırılabilir. Burada mikrop biyokütle MS / MS-tabanlı analizi için uygun peptidler, süzme ile toplanmış ve bir RNA stabilizasyonu çözelti içinde depolanan üretimi için bir protokol sağlar. Burada açıklanan protokol DNA ve protein tüm adımları proteine ​​yol açan DNA çökelme aynıdır, böylece aynı numuneden izole edilmesi sağlar. Sadece bir filtre protein ve DNA izolasyonu hem de gerekli olduğundan pratik açıdan bakıldığında, daha az filtrasyon gereklidir. Biz de bu protokol iki önce yayınlanmış protokolleri kombinasyonu, adaptasyon ve modifikasyon yoluyla yaratılmış olduğunu kabul etmek istiyorum. Hücre parçalama adımlar (2011) 28. Saito ve ark uyarlanan ve bileşeni sindirmek in-jel tripsin Shevche uyarlanmıştırNKO ve diğ. (2007) 29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterivex -GP 0.22 &#956;m filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SVGP01050</td>
			<td>Sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater Stabilization Solution</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>Sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>77-86-1 or TB0196-500G</td>
			<td>Protein Extraction/ SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632-1G</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>15-21-3</td>
			<td>Protein Extraction/ SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10K Amicon Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337-4L</td>
			<td>Protein Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td>Protein Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPC Protein Precipitation reagent</td>
			<td>Epicenter</td>
			<td>mmP03750</td>
			<td>DNA Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td>DNA Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>DNA Quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Protein Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33211</td>
			<td>Protein Quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0158</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0718</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0375EDU</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CABDH6044-4</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4HCO3</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>1066-33-7</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632-1G</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0507-500ML</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270733-4L</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>144-48-9</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tube 1.5ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL ROBO vial 9mm</td>
			<td>Candian Life Science</td>
			<td>VT009/C395SB</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP BM insert, No spring</td>
			<td>Candian Life Science</td>
			<td>4025P-631</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an aquatic microbial metaproteomics workflow: from cells to tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based analysis

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and metabolism. Although powerful, metagenomics alone can only elucidate functional potential. On the other hand, metaproteomics enables the description of the expressed in situ metabolism and function of a community. Here we describe a protocol for cell lysis, protein and DNA isolation, as well as peptide digestion and extraction from marine microbial cells collected on a cartridge filter unit (such as the Sterivex filter unit) and preserved in an RNA stabilization solution (like RNAlater). In mass spectrometry-based proteomics studies, the identification of peptides and proteins is performed by comparing peptide tandem mass spectra to a database of translated nucleotide sequences. Including the metagenome of a sample in the search database increases the number of peptides and proteins that can be identified from the mass spectra. Hence, in this protocol DNA is isolated from the same filter, which can be used subsequently for metagenomic analysis.

Bir gösteri olarak, yüzey ve Kuzey Kanada&#39;da kıyı okyanus klorofil maksimum toplanan iki deniz suyu örnekleri üzerinde protokol uygulandı. Denizde, deniz suyu 6-7 L 3 mikron GF / D ön filtre geçirildi ederken, daha sonra mikrobiyal hücrelerin Walsh ve ark., 20 protokole 0.22 mikron kartuş filtre ünitesi üzerine toplanmıştır. Hücreler, hemen daha sonra işlenene kadar bir RNA stabilizasyonu çözelti içinde muhafaza edilmiştir. Burada sunulan laboratuarda döndükten sonra biz p...

Watch this Scientific Journal Video about An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis at JoVE.com

An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis

This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

Bir Aquatic Mikrobiyal Metaproteomics İş Akışı: Tandem Kütle Spektrometre tabanlı analiz için uygun Triptik Peptitler için Hücreleri itibaren

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and ...

an-aquatic-microbial-metaproteomics-workflow-from-cells-to-tryptic

Research

JoVE Journal

Environment

8.7K Görüntüleme.  Concordia University. This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

Video: An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis

Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study provides a protocol for the passive sampler preparation, calibration, extraction method and instrumental analysis. Sampling rates (RS) and passive sampler-water partition coefficients (KPW) were calculated for silicone rubber, polar organic chemical integrative sampler POCIS-A, POCIS-B, SDB-RPS and C18 disk. The uptake of the selected compounds depended on their physicochemical properties, i.e., silicone rubber showed a better uptake for more hydrophobic compounds (log octanol-water partition coefficient (KOW) &#62; 5.3), whereas POCIS-A, POCIS-B and SDB-RPS disk were more suitable for hydrophilic compounds (log KOW &#60; 0.70).

A protocol about the characterization and application of five different passive sampling devices is presented.

Suda Pestisitlerin İzleme Karakterizasyonu ve Pasif Numune Uygulama

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study ...

Çevre

Alternative Method of Removing Otoliths from Sturgeon

Extracting the otoliths (ear bones) from fish that have very thick skulls can be difficult and very time consuming. The common practice of making a transverse vertical incision on the top of the skull with a hand or electrical saw may damage the otolith if not performed correctly. Sturgeons (Acipenseridae) are one family in particular that have a very large and thick skull. A new laboratory method entering the brain cavity from the ventral side of the fish to expose the otoliths was easier than other otolith extraction methods found in the literature. Methods reviewed in the literature are designed for the field and are more efficient at processing large quantities of fish quickly. However, this new technique was designed to be more suited for a laboratory setting when time is not pressing and successful extraction from each specimen is critical. The success of finding and removing otoliths using this technique is very high and does not compromise the structure in any manner. This alternative technique is applicable to other similar fish species for extracting the otoliths.

The goal of the protocol is to show an effective method to extract the otoliths from sturgeon carcasses.

Sturgeon gelen otolitler Çıkarma Alternatif Yöntem

Extracting the otoliths (ear bones) from fish that have very thick skulls can be difficult and very time consuming. The common practice of making a ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about the overall structure of terrestrial microbial communities. PLFA profiling has been extensively used in a range of ecosystems as a biological index of overall soil quality, and as a quantitative indicator of soil response to land management and other environmental stressors.
The standard method presented here outlines four key steps: 1. lipid extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, 2. fractionation using solid phase extraction columns to isolate phospholipids from other extracted lipids, 3. methanolysis of phospholipids to produce fatty acid methyl esters (FAMEs), and 4. FAME analysis by capillary gas chromatography using a flame ionization detector (GC-FID). Two standards are used, including 1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC(19:0/19:0)) to assess the overall recovery of the extraction method, and methyl decanoate (MeC10:0) as an internal standard (ISTD) for the GC analysis.

Phospholipid fatty acids provide information about the structure of soil microbial communities. We present methods for extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, fractionation of extracted lipids using solid phase extraction columns, and methanolysis to produce fatty acid methyl esters, which are analyzed by capillary gas chromatography.

Ekstraksiyon ve Topraklarda Mikrobiyal Fosfolipid Yağ Asitleri Analizi

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond quickly to environmental changes and can be thus used as indicators of water quality. Currently, biofilm assessment is mostly based on integrative and functional endpoints, such as photosynthetic or respiratory activity, which do not provide information on the biofilm community structure. Flow cytometry and computational visualization offer an alternative, sensitive, and easy-to-use method for assessment of the community composition, particularly of the photoautotrophic part of freshwater biofilms. It requires only basic sample preparation, after which the entire sample is run through the flow cytometer. The single-cell optical and fluorescent information is used for computational visualization and biological interpretation. Its main advantages over other methods are the speed of analysis and the high-information-content nature. Flow cytometry provides information on several cellular and biofilm traits in a single measurement: particle size, density, pigment content, abiotic content in the biofilm, and coarse taxonomic information. However, it does not provide information on biofilm composition on the species level. We see high potential in the use of the method for environmental monitoring of aquatic ecosystems and as an initial biofilm evaluation step that informs downstream detailed investigations by complementary and more detailed methods.

Flow cytometry in combination with visual clustering offers an easy-to-use and fast method for studying aquatic biofilms. It can be used for biofilm characterization, detection of changes in biofilm community structure, and detection of abiotic particles embedded in the biofilm.

Akış sitometresi ile su biyofilmler karakterizasyonu

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The purpose of this manuscript is to provide detail on how to rapidly sample soil, rhizosphere, and endosphere of replicated field trials and analyze changes that may occur in the microbial communities due to sample type, treatment, and plant genotype. The experiment used to demonstrate these methods consists of replicated field plots containing two, pure, warm-season grasses (Panicum virgatum and Andropogon gerardii) and a low-diversity grass mixture (A. gerardii, Sorghastrum nutans, and Bouteloua curtipendula). Briefly, plants are excavated, a variety of roots are cut and placed in phosphate buffer, and then shaken to collect the rhizosphere. Roots are brought to the laboratory on ice and surface sterilized with bleach and ethanol (EtOH). The rhizosphere is filtered and concentrated by centrifugation. Excavated soil from around the root ball is placed into plastic bags and brought to the lab where a small amount of soil is taken for DNA extractions. DNA is extracted from roots, soil, and rhizosphere and then amplified with primers for the V4 region of the 16S rRNA gene. Amplicons are sequenced, then analyzed with open access bioinformatics tools. These methods allow researchers to test how the microbial community diversity and composition varies due to sample type, treatment, and plant genotype. Using these methods along with statistical models, the representative results demonstrate there are significant differences in microbial communities of roots, rhizosphere, and soil. Methods presented here provide a complete set of steps for how to collect field samples, isolate, extract, quantify, amplify, and sequence DNA, and analyze microbial community diversity and composition in replicated field trials.

Excavation of plant roots from the field as well as processing of samples into endosphere, rhizosphere, and soil are described in detail, including DNA extraction and data analysis methods. This paper is designed to enable other laboratories to use these techniques for the study of soil, endosphere, and rhizosphere microbiomes.

Yalıtım ve mikrobiyal topluluklarda toprak, rizosferde ve kökleri çok yıllık çim deneylerde Analizi

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and toxicological studies. Using automated digital tracking platforms, recent efforts in neuropharmacology are leveraging larval fish locomotor behaviors to identify potential therapeutic targets for novel small molecules. Similar to these efforts, research in the environmental sciences and comparative pharmacology and toxicology is examining various behaviors of fish models as diagnostic tools in tiered evaluation of contaminants and real-time monitoring of surface waters for contaminant threats. Whereas the zebrafish is a popular larval fish model in the biomedical sciences, the fathead minnow is a common larval fish model in ecotoxicology. Unfortunately, fathead minnow larvae have received considerably less attention in behavioral studies. Here, we develop and demonstrate a behavioral profile protocol using caffeine as a model neurostimulant. Though photomotor responses of fathead minnows were occasionally affected by caffeine, zebrafish&#160;were markedly more sensitive for photomotor and locomotor endpoints, which responded at environmentally relevant levels. Future studies are needed to understand comparative behavioral sensitivity differences among fish with age and time of day, and to determine whether similar behavioral effects would occur in nature and be indicative of adverse outcomes at the individual or population levels of biological organization.

Here, we present a protocol to examine larval zebrafish and fathead minnow locomotor activities and photomotor responses (PMR) using an automated tracking software. When incorporated in common toxicology bioassays, analyses of these behaviors provide a diagnostic tool to examine chemical bioactivity. This protocol is described using caffeine, a model neurostimulant.

Davranışsal yanıt profilleri larva balık incelenmesi için deneysel protokol: nöro-uyarıcı kafein uygulamaya

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, we described a protocol for multiple analyses of the biological compositions in environmental PM. Five experiments are presented: (1) PM number monitoring by using a laser particle counter; (2) PM collection by using a cyclonic aerosol sampler; (3) PM collection by using a high-volume air sampler with filters; (4) culturable microbes collection by the Andersen six-stage sampler; and (5) detection of biological composition of environmental PM by bacterial 16SrDNA and fungal ITS region sequencing. We selected hazy days and a livestock farm as two typical examples of the application in this protocol. In this study, these two sampling methods, cyclonic aerosol sampler and filter sampler, showed different sampling efficiency. The cyclonic aerosol sampler performed much better in terms of collecting bacteria, while these two methods showed the same efficiency in collecting fungi. Filter samplers can work under low temperature conditions while cyclonic aerosol samplers have a sampling limitation for temperature. A solid impacting sampler, such as an Andersen six-stage sampler, can be used to sample bioaerosols directly into the culture medium, which increases the survival rate of culturable microorganisms. However, this method mainly relies on culture while more than 99% of microbes cannot be cultured. DNA extracted from the culturable bacteria collected by the Andersen six-stage sampler and samples collected by cyclonic aerosol sampler and filter sampler were detected by bacterial 16S rDNA and fungal ITS region sequencing.All the methods above may have wide application in many fields of study, such as environmental monitoring and airborne pathogen detection. From these results, we can conclude that these methods can be used under different conditions and may help other researchers further explore the health impacts of environmental bioaerosols.

Understanding the biological composition of environmental particulate matter is important for the study of its significant impacts on human health and disease spread. Here, we used three types of bioaerosol sampling methods and a biological analysis of airborne microbes to better explore airborne microbial communities under different environmental conditions.

Kompozisyon ve Bioaerosols farklı çevresel koşullar altında dağıtım Analizi

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...

Identifying Per- and Polyfluorinated Chemical Species with a Combined Targeted and Non-Targeted-Screening High-Resolution Mass Spectrometry Workflow

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the local to federal levels. The continuing evolution of PFAS chemistries presents a challenge to the environmental monitoring, where ongoing development of targeted methods necessarily lags the discovery of new chemical compounds. There is a need, therefore, to have forward-looking methodologies that can detect emerging and unexpected compounds, monitor these species over time, and resolve details of their chemical structure to enable future work in human health. To this end, non-targeted analysis by high-resolution mass spectrometry offers a broad base detection approach that can be combined with almost any sample preparation scheme and provides significant capabilities for compound identification after detection. Herein, we describe a solid-phase extraction (SPE) based sample concentration method tuned for shorter chain and more hydrophilic PFAS chemistries, such as per fluorinated ether acids and sulfonates, and describe analysis of samples prepared in this fashion in both targeted and non-targeted modes. Targeted methods provide superior quantification when reference standards are available but are intrinsically limited to expected compounds when performing analysis. In contrast, a non-targeted approach can identify the presence of unexpected compounds and provide some information about their chemical structure. Information about chemical features can be used to correlate compounds across sample locations and track abundance and occurrence over time.

Here, we present a protocol for the sequential targeted quantification and non-targeted analysis of fluorinated compounds in water by mass spectrometry. This methodology provides quantitative levels of known fluorochemical compounds and identifies unknown chemicals in related samples with semi-quantitative estimates of their abundance.

Ücret belirlenmesi- ve Polyfluorinated kimyasal türler ile kombine hedef ve hedef tarama olmayan yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi iş akışı

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the ...

Fluorescently Labeled Bacteria as a Tracer to Reveal Novel Pathways of Organic Carbon Flow in Aquatic Ecosystems

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial communities has many limitations, and determining a predator, prey, and predatory rates is often difficult. Presented here is an optimized method based on the addition of fluorescently labelled prey as a tracer, which allows for reliable quantitation of the grazing rates in aquatic predatory eukaryotes and estimation of nutrient transfer to higher trophic levels.

Presented here is a protocol for a single-cell, epifluorescence microscopy-based technique to quantify grazing rates in aquatic predatory eukaryotes with high precision and taxonomic resolution.

Floresan Etiketli Bakteriler Sucul Ekosistemlerde Organik Karbon Akışının Yeni Yollarını Ortaya Çıkaracak Bir İzleyici Olarak

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial ...

A Guide to Concentration Alternating Frequency Response Analysis of Fuel Cells

An experimental setup capable of generating a periodic concentration input perturbation of oxygen was used to perform concentration-alternating frequency response analysis (cFRA) on proton-exchange membrane (PEM) fuel cells. During cFRA experiments, the modulated concentration feed was sent to the cathode of the cell at different frequencies. The electric response, which can be cell potential or current depending on the control applied on the cell, was registered in order to formulate a frequency response transfer function. Unlike traditional electrochemical impedance spectroscopy (EIS), the novel cFRA methodology makes it possible to separate the contribution of different mass transport phenomena from the kinetic charge transfer processes in the frequency response spectra of the cell. Moreover, cFRA is able to differentiate between varying humidification states of the cathode. In this protocol, the focus is on the detailed description of the procedure to perform cFRA experiments. The most critical steps of the measurements and future improvements to the technique are discussed.

We present a protocol for concentration alternating frequency response analysis of fuel cells, a promising new method of studying fuel cell dynamics.

Yakıt Hücrelerinin Konsantrasyon Alternatif Frekans Yanıt Analizi Kılavuzu

An experimental setup capable of generating a periodic concentration input perturbation of oxygen was used to perform concentration-alternating frequency ...