The authors would like to acknowledge Marcos Di Falco for his expertise and advice with the preparation of the samples for nano-LC MS/MS as well as Dr. Zoran Minic from the University of Regina for the LC MS/MS analysis. This work was supported by NSERC (DG402214-2011) and CRC (950-221184) funding. D.C. was supported by Concordia Institute for Water, Energy, and Sustainable Systems and FQRNT.

1.試薬を準備<ol><li> 0.1 MのTris-HCl pH7.5で、5％グリセロール、10mMのEDTA及び1％SDS：SDS抽出溶液を調製します。 4℃で0.22μmフィルターとストアを使用してフィルター滅菌します。 </li><li>ポリアクリルアミドゲルに必要な株式試薬を準備します。 <ol><li> 1.5 Mトリス塩酸pHが8.8を準備します。室温で0.22μmフィルターとストアを使用してフィルター滅菌します。 </li><li> 0.5 Mトリス塩酸pHは6.8。室温で0.22μmフィルターとストアを使用してフィルター滅菌します。 </li><li> 10％SDSを準備します。フィルターは、室温で0.22μmフィルターとストアを使用して滅菌します。 </li></ol></li><li>ゲル内トリプシン消化およびペプチド抽出に必要なソリューションを準備します。 <ol><li> 100mMの重炭酸アンモニウムを準備します。 4℃で0.22μmフィルターとストアを使用してフィルター滅菌します。 </li><li> 1 M DTTストックを準備します。 -80℃で100mMの重炭酸アンモニウムとストアに懸濁しました。 </li><li> 550 mMのヨードアセトアミドストックを準備します。に懸濁100 mMの-80℃での重炭酸アンモニウムとストア。 </li><li> 100 ngの/μlのトリプシンストックを準備します。 -80℃で1.5 mlマイクロチューブに60μlのアリコートとストア。 </li><li> 1％ギ酸、2％アセトニトリル：抽出液を準備します。 </li><li> 5％アセトニトリルおよび0.1％ギ酸：再懸濁溶液を調製します。 </li></ol></li></ol> 2. RNA安定化策に保存された細胞とカートリッジフィルターユニットで細胞溶解を実行<ol><li>カートリッジフィルターユニット（1.5 ml）でのフィルタのルアーロック端部に取り付けられた60 mlの注射器を使用して、2 mlのマイクロ遠心チューブにRNA安定化溶液を追い出します。 </li><li>任意の細胞破片をペレットに17000×gで10分間、2 mlのマイクロ遠心チューブを遠心。ステップ2.3でフィルターが目詰まりしないようにするためです。 </li><li>凍結/ THAから溶解した細胞に由来する任意のタンパク質を捕捉するために、10K超遠心フィルターユニットに上清を移しますサンプルのワットペレットを廃棄しないでください。なお、ステップ2.5で使用されます。 30分間、または体積が約600μlに減少するまで、3,270×gで超遠心フィルターユニットの遠心分離を行います。 </li><li> P10チップの先端を溶融し、先端の開口端とカートリッジフィルターユニットの非ルアーロック側を遮断します。これには、抽出緩衝液とバイオマスがステップ2.5から2.7の間に脱出しないことを保証します。 </li><li> 1ミリリットルのSDS抽出液中にペレットを中断し、元のカートリッジフィルターユニットにそれをピペット。カートリッジフィルターユニットにピペットする最も簡単な方法は、P1000の先端にP200チップをスタックし、ピペッティングのために、この二重のヒントを使用することです。 </li><li>総容積が約2mlとなるようにカートリッジフィルターユニットにSDS抽出液1mlを添加し、ハイブリダイゼーションオーブン中で回転させながら室温で10分間インキュベートします。 3しわくちゃラボを50mlコニカルチューブの底にワイプ置きます。閉じたカートリッジフィルター部の両端をパラフィルム50 mlのチューブにカートリッジフィルターユニットを置きます。蓋を閉じて、ハイブリダイゼーションオーブンにチューブを入れます。 </li><li> 10分の場所Sterivex後発泡フローターでフィルタとルアーロック端に5ミリリットルの注射器で固定します。フロート、15分間95℃の水浴中でインキュベートします。 </li><li>クールカートリッジフィルターユニットをしようとする（ステップ2.6のように）、室温で1時間回転します。 </li><li> （ステップ2.3）前と同じ超遠心フィルターユニットに60 mlシリンジにフィルタのうちSDS抽出液/細胞溶解物を放出します。カートリッジフィルターユニットに新鮮SDS抽出液1mlを加え、手で30秒間混合し、60 mlの注射器を用いて超遠心フィルターユニットに追い出します。これは、すべてのタンパク質が除去されていることを確認するためにカートリッジフィルターユニットを洗浄することです。 </li><li> 3,270×gでまたはフィルタユニット内の容積が600未満μLになるまで、45分間超遠心フィルターユニットに遠心分離を行い。 </li><li>フロースルーを捨て、新鮮なSDS抽出液を補充して超遠心フィルターユニットを。 </li><li>遠心3270×gでさらに45分間、フィルタユニット。 </li><li>繰り返し二回より2.11と2.12を繰り返します。超遠心フィルターユニット内の最終容量は、最終的なスピンの最後に最も600μlのであることを確認します。 </li><li>この時点で、二つに濃縮物を分割します。一つの画分は、DNA沈殿および他のタンパク質のための沈殿のために使用されます。 注：分別量をろ過したバイオマス量や製品の使用目的によって異なります。私たちのケースでは、DNA沈殿に向かって10％とタンパク質沈殿に向かって90％に濃縮物を分割します。 </li></ol> 3.タンパク質の沈殿<ol><li> 10秒のための濃縮物および渦の一冊にアセトン（50:50）：4倍量のメタノールを追加します。 -20℃で一晩インキュベートします。 </li><li> 30分間17000×gでスピンダウン。上清を除去そしてペレットを1時間（または乾燥するまで）のためにスピードバックで乾燥（目に見えないかもしれない）しましょう​​。 注意：これはそれが困難な再懸濁するために行うことができるようにオーバーペレットを乾燥させないでください。 </li><li> SDS抽出溶液25μlにペレットを一時停止します。その後、ピペッティングにより再懸濁一時間座ってみましょう。 </li><li>タンパク質アッセイキットおよび製造業者の指示に従って用いてタンパク質を定量化します。 </li></ol> 4. DNAを沈殿<ol><li> 500μlのマークまで、DNA沈殿のために使用される濃縮液画分をSDS-抽出溶液を加えます。このステップは、単にそれが簡単で動作するようになって、溶液の体積を増加させることです。 </li><li> 10秒間ボルテックス（例えばMPCタンパク質沈殿試薬として）タンパク質沈殿試薬の0.583ボリュームを追加します。あなたは、白色の沈殿物フォームが表示されるはずです。 注：我々はまた、フェノール使用している：クロロホルムDNA抽出法を、それが低いボリュームにより困難です。我々は、使用してより優れたDNA収量を得ましたMPCタンパク質沈殿試薬。 </li><li> 17000×gで遠心分離し、10分間、4℃。 </li><li>さらに1.5 mlのマイクロ遠心チューブに上清を移し、イソプロパノール0.95ボリュームを追加します。 30〜40回転倒。 </li><li>最大速度で4℃で10分間遠心。 </li><li>慎重にデカントし、上清を捨てます。 </li><li> 70％エタノール750μlので二回洗浄します。 </li><li>空気乾燥をさせた後、ピペッティングによりできるだけ多くのエタノールを除去します。 注意：これはそれが困難な再懸濁するために行うことができるようにオーバーするDNAを乾燥させないでください。 </li><li>低TEバッファー、pH 8（10 mMトリス塩酸、0.1mMのEDTA）25μlの再懸濁。 </li><li>二本鎖DNAアッセイキット及び製造業者の指示を用いてDNAを定量化します。その品質を確認するために、DNAの3μLにアガロースゲル（1％）電気泳動を行います。 </li></ol> 5. SDS-PAGEタンパク質のゲル<ol><li>サンプルバッファー（950μlのレムリ試料緩衝液および50μlのβメルカプトエタノール）を準備します。&lt;/ LI&gt; <li> 15μgのタンパク質に対応する量、またはサンプル緩衝液の等体積の20μLの最大を追加し、4分間沸騰。 SDS-PAGEを行うことができるまで、サンプルは現在-80℃で保存することができます。 </li><li> 5％アクリルアミドスタッキングゲルを有する10％アクリルアミド分離ゲルを準備します。 </li><li>サンプルおよびタンパク質ラダーの4μlのゲルをロードします。 250 kDaのラダーマーカーはちょうど分離ゲルに達するまで一定の120 Vでゲルを実行します。 </li><li>製造者の指示に従って染色ベースのクマシーを用いてゲルを染色。 </li></ol> 6.ゲル内トリプシン消化し、ペプチドの抽出注：6.10までここからすべてのステップは、汚染を最小限にするために生物学的安全キャビネット内で実行されます。 <ol><li>各レーンのための10 kDaのラダーマークの下に余分なゲルを切り取ります。各レーンは、個別MS / MSで分析します。表面積を増加させ、すべてのsquaを配置するために1ミリメートル×1ミリメートルの正方形の中に各レーンをカット低結合マイクロ遠心チューブにレーンからのres。全てのレーンのためにこれを繰り返します。 （1％酢酸を乾燥し、切断することが困難になってからゲルを防止するために使用することができます）。 注：汚染を最小化することは、この段階で重要であるので、ゲルスライスを、ゲルを作るために使用されるガラスSDS-PAGEゲル上で金型生物学的安全キャビネットの中で行われます。 </li><li>脱染色<ol><li>各低結合管、近くにキャップ内に100mMの重炭酸アンモニウムの50μLを分注し、37℃で10分間インキュベートします。 </li><li>アセトニトリル、近いキャップの50μLを分注し、37℃で5分間インキュベートします。 </li><li>吸引し、150μlのを捨てます。 </li><li>繰り返しは6.2.1と6.2.2を繰り返します。 </li><li>吸引し、95μLを破棄します。 </li></ol></li><li>脱水<ol><li> 50μlのアセトニトリル、近くにキャップを分注し、5分待ってください。吸引し、45μLを破棄し、10分待ってください。 </li></ol></li><li>削減<ol><li> 100 mMのAMMで希釈した50μlのDTT（10 mMのを、分注オニウム重炭酸塩）、近くにキャップし、37℃で30分を待ちます。 </li></ol></li><li>アルキル化<ol><li> 50μlのヨードアセトアミド（100mMの重炭酸アンモニウムで希釈した55 mMの、）、近くにキャップを分注し、37℃で20分を待ちます。 </li><li>アセトニトリル、近いキャップの100μLを分注し、37℃で5分間インキュベートします。吸引し、195μ​​Lを破棄します。 </li></ol></li><li>ウォッシュ<ol><li> 50μlの重炭酸アンモニウム、クローズキャップを分配し、37℃で10分間インキュベートします。 </li><li>アセトニトリル、近いキャップの50μLを分注し、37℃で5分間インキュベートします。吸引し、120μLを破棄します。 </li></ol></li><li>脱水<ol><li> 50μlのアセトニトリル、近くにキャップを分注し、5分待ってください。吸引し、45μLを破棄します。 </li><li>アセトニトリル50μLを分注し、5分待ってください。 </li><li>吸引し、75μLを破棄し、5分待ってください。 </li></ol></li><li>消化<ol><li> 6 NG /μlのトリプシン（Uの25〜30μLを分注しntilすべてのゲル断片）が覆われています。閉じるキャップし、室温で30分待ちます。 </li><li> 37℃で一晩（4.5時間以上）インキュベートします。 </li><li>室温で30分間座ってみましょう。 </li></ol></li><li>抽出およびペプチド転送<ol><li>抽出溶液の30μLを分注し、氷上で30分間、蓋をカバーしています。 </li><li>吸引し30μlの、新しいラベル低結合チューブで吸引量を分注します。 </li><li> （ゲルと）元の管に抽出溶液12μlのアセトニトリルの12μLを分注します。閉じるキャップと氷上で30分間インキュベートします。 </li><li>吸引し、新しいチューブに15μlの預金。 </li><li>ステップ（6.9.3および6.9.4）を繰り返します。 </li></ol></li><li>乾燥するまでスピードバックで新しいチューブを置きます。 </li><li>再懸濁溶液50μlで再懸濁します。再懸濁し、10分間培地上で渦。 </li><li>ナノナノ/ LCバイアルまたは適切な96ウェルプレートのいずれかにピペットペプチド溶液/ LCMS / MSの仕事。 </li></ol>

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+analysis+of+environmental+sequences+using+MEGAN4.">Integrative analysis of environmental sequences using MEGAN4.</a> Genome research. 21 (9), 1552-1560 (2011).</li><li>Ea Ottesen, ., Marin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metatranscriptomic+analysis+of+autonomously+collected+and+preserved+marine+bacterioplankton.">Metatranscriptomic analysis of autonomously collected and preserved marine bacterioplankton.</a> The ISME journal. 5 (12), 1881-1895 (2011).</li><li>Feike, J., J&#252;rgens, K., Hollibaugh, J. T., Kr&#252;ger, S., Jost, G., Labrenz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+unbiased+metatranscriptomics+in+suboxic+waters+of+the+central+Baltic+Sea+using+a+new+in+situ+fixation+system.">Measuring unbiased metatranscriptomics in suboxic waters of the central Baltic Sea using a new in situ fixation system.</a> The ISME journal. 6 (2), 461-470 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

サンプル保存はmetaproteomic研究の鍵であると前作は、RNA安定化溶液は、前タンパク質抽出28に細胞を収納するのに便利記憶バッファであることを実証しました。理想的には、サンプルは33,34を取り扱い中のタンパク質発現の変化を打ち消すために、その場で保持されることになります。実際には、 その場でサンプリングし、固定技術が船配備楽器による自律的な収...

微生物は、ユビキタスであり、地球の物質循環1に重要な役割を果たしています。現在、微生物群集の構造と機能を特徴づけるために利用可能な多数の分子アプローチがあります。 4 -最も一般的な16S rRNA遺伝子配列の分析は、環境DNA 2からPCR増幅されます。 16S rRNA遺伝子解析の欠点は、それが唯一の代謝機能にはほとんどの情報を、系統発生的アイデンティティと社会構造についての情報を提供することです。これとは対照的に、このようなメタゲノミクス、metatranscriptomicsとmetaproteomicsとしてのアプローチは、コミュニティの構造と代謝に​​関する情報を提供しています。 8 -メタゲノミクス、または生物の集合体の遺伝子含有量の分析は、社会5の構造と機能の可能性についての情報を提供します。強力なものの、この機能の可能性は、代謝に対応しない場合があります生物の活動。生物の遺伝子型は、RNAに転写し、さらに表現型をもたらす、タンパク質に翻訳することができるそれらの各々は、その遺伝子によって表されます。従って、環境中の微生物の機能的活性の理解を助けるために、ポストゲノム解析は、9実行されるべきです。それは任意の環境で転写される遺伝子を明らかにするためMetatranscriptomics、またはRNA転写物の分析に便利です。しかし、mRNAのレベルは、常に翻訳調節、RNAの半減期、および複数のタンパク質コピーは、すべてのmRNAの10のために生成することができるという事実に起因し、それらの対応するタンパク質のレベルと一致しません。 これらの理由のmetaproteomicsのために今の環境微生物学のための重要なツールとして認識されています。共通metaproteomicは、複雑なサンプル中のタンパク質のほぼ完全な補完は、通常エンを通して、精製し、同時に分析されているショットガンプロテオミクスのアプローチを使用して分析します質量分析計のペプチドおよび分析にzymatic消化。続くタンデム質量分析（MS / MS）「ペプチドフィンガープリント」は、タンパク質データベース検索によって、ペプチド配列および起源の可能性タンパク質（概説については11を参照）を決定するために使用されます。プロテオミクスの研究は、過去25年間で、ゲノムデータの可用性の増加や高スループットのタンパク質の同定および定量11,12を可能にする質量分析計の感度および精度の向上のおかげで長い道のりを歩んできました。タンパク質は、遺伝子発現の最終産物であるので、metaproteomicデータは、任意の与えられた環境で活性である生物、それらが発現しているものタンパク質を判断するのに役立ちます。環境変数の特定のセットは、生物やコミュニティの表現型にどのように影響するかを決定しようとする場合に有利です。初期の段階では、海でのMS / MSベースmetaproteomic研究が対象となるの特定のタンパク質を同定するために使用されましたSAR11の海洋細菌13の光駆動プロトンポンプテオに焦点を当てた最初の研究で、微生物系統、。より最近では、比較metaproteomic分析が複雑な地域社会との差タンパク質発現パターンを解明しました。例としては、沿岸北西部大西洋14または南極半島5における代謝の時間的シフトの識別が含まれます。他の研究では、生産性の高い沿岸湧昇システム 15に低栄養環流から地理的トランセクトに沿って、例えば、空間スケールを越えタンパク質発現パターンの変化を説明しています。 metaproteomicsのさらなるレビューのために我々はシュナイダーら （2010）9、ウィリアムズら （2014年）16をお勧めします。標的プロテオミクスはまた、環境17,18における特定の代謝経路の発現を定量するために近年使用されています。 THEReはmetaproteomic分析には、主な3つの相です。第一段階は、試料収集、細胞溶解及びタンパク質の濃度を含むサンプル調製です。海洋微生物のサンプルの収集は、多くの場合、一般に、0.22μmのカートリッジを使用して、自由生活微生物細胞の捕捉のためにろ過し、より大きな真核生物細胞、粒子と粒子に関連する細菌を除去するためにプレフィルターを通して海水の濾過を伴いますフィルタユニット19,20。これらのフィルタは、プラスチックシリンダーでincasedされ、フィルタユニット内で実行することができる細胞溶解及びタンパク質抽出プロトコルは、貴重なツールであろう。バイオマスが得られると、細胞は、タンパク質抽出を可能にするために溶解されなければなりません。いくつかの方法は、溶解法をベースグアニジン-HCl溶解21とドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含む、使用することができます。 SDSのような界面活性剤は、膜を破壊し、多くのタンパク質の種類を可溶化でconcentrati非常に効率的であるが、下流タンパク質消化及びMS分析22に干渉することが0.1％と低く、ONS。主要な関心事のイオン源23内の逆相液体クロマトグラフィーとイオン抑制または蓄積の解像力、トリプシン消化効率にSDSの悪影響です。 第二段階は、タンパク質が、最初のトリプシンペプチドの一次アミノ酸配列を確認するために使用することができるAM / zの断片化パターンをもたらす、LC MS / MS分析に続いて酵素消化に供される分画及び分析です。さまざまな消化方法が使用される界面活性剤の種類、ならびに下流の質量分析ワークフローに応じて行うことができます。我々のプロトコルでは、ゲルのSDSを除去した1次元PAGE電気泳動は、任意の洗剤汚染を除去するために利用されています。このような膜タンパク質として、可溶化することが困難であるタンパク質の分析は、高いconcenの使用を必要としますSDSまたは他の界面活性剤のtrations。これは、SDSゲル電気泳動との互換性の問題につながります。研究の目的は、タンパク質を可溶化するために、これらの硬質の可溶化を必要とする場合、チューブゲルシステムは、22,24を使用することができます。チューブゲル法、電気泳動を使用することなく、ゲルマトリックス内のタンパク質を組み込みます。続いて可溶化するために使用される任意の界面活性剤は、タンパク質消化の前に削除されます。 第三段階は、バイオインフォマティクス解析です。この段階でMS / MSペプチドデータは、サンプル中に存在するペプチドおよびタンパク質を決定するために翻訳されたヌクレオチド配列データベースに対して検索されます。ペプチドの同定は、それがに対して検索されているデータベースに依存しています。マリンmetaproteomicデータは、一般的に参照ゲノムから成るデータベースに対して検索され、そのようなグローバル・オーシャン・サンプリングデータセット25、ならびに単一セルとメタゲノムのデータが未培養のLiからゲノムを増幅します26,27 neages。タンパク質同定はまたmetaproteomicデータは 5導出されたのと同じ試料からメタゲノム配列を含めることによって増加させることができます。 ここでは、微生物バイオマスからのMS / MSに基づく分析を濾過により回収し、RNA安定化溶液中で保存するのに適したペプチドを生成するためのプロトコルを提供します。 DNAとタンパク質は、同じ試料から単離するためのタンパク質およびDNAの沈殿に至るまでのすべてのステップが同じになるように、ここで説明されたプロトコルができます。唯一のフィルタは、タンパク質およびDNA抽出の両方のために必要とされるので、実用上の観点から、より少ない濾過が必要とされます。また、このプロトコルは2以前に公開されたプロトコルの組み合わせ、適応及び改変によって作成されたことを感謝したいです。細胞溶解工程は、斎藤ら。（2011）28、コンポーネントがShevcheから適応されるダイジェストゲル内トリプシンから適応されていますNKOら。 （2007年）29。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterivex -GP 0.22 &#956;m filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SVGP01050</td>
			<td>Sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater Stabilization Solution</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>Sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>77-86-1 or TB0196-500G</td>
			<td>Protein Extraction/ SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632-1G</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>15-21-3</td>
			<td>Protein Extraction/ SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10K Amicon Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337-4L</td>
			<td>Protein Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td>Protein Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPC Protein Precipitation reagent</td>
			<td>Epicenter</td>
			<td>mmP03750</td>
			<td>DNA Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td>DNA Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>DNA Quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Protein Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33211</td>
			<td>Protein Quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0158</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0718</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0375EDU</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CABDH6044-4</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4HCO3</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>1066-33-7</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632-1G</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0507-500ML</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270733-4L</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>144-48-9</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tube 1.5ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL ROBO vial 9mm</td>
			<td>Candian Life Science</td>
			<td>VT009/C395SB</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP BM insert, No spring</td>
			<td>Candian Life Science</td>
			<td>4025P-631</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an aquatic microbial metaproteomics workflow: from cells to tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based analysis

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and metabolism. Although powerful, metagenomics alone can only elucidate functional potential. On the other hand, metaproteomics enables the description of the expressed in situ metabolism and function of a community. Here we describe a protocol for cell lysis, protein and DNA isolation, as well as peptide digestion and extraction from marine microbial cells collected on a cartridge filter unit (such as the Sterivex filter unit) and preserved in an RNA stabilization solution (like RNAlater). In mass spectrometry-based proteomics studies, the identification of peptides and proteins is performed by comparing peptide tandem mass spectra to a database of translated nucleotide sequences. Including the metagenome of a sample in the search database increases the number of peptides and proteins that can be identified from the mass spectra. Hence, in this protocol DNA is isolated from the same filter, which can be used subsequently for metagenomic analysis.

デモンストレーションとして、我々は、二つの表面から採取した海水サンプルとカナダ北部の沿岸海洋のクロロフィル最大でプロトコルを行いました。海で、海水の6-7 Lが3μmのGF / Dをプレフィルターに通したが、その後、微生物細胞は、ウォルシュら 20のプロトコルに従って、0.22μmのカートリッジフィルターユニットに収集しました。細胞はすぐにさらに処理されるまでRNA安?...

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An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis

This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

水生微生物Metaproteomicsワークフロー：細胞からのトリプシンペプチドのタンデム質量分析ベースの分析に適し

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and ...

an-aquatic-microbial-metaproteomics-workflow-from-cells-to-tryptic

Research

JoVE Journal

Environment

8.7K ビュー.  Concordia University. This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

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Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study provides a protocol for the passive sampler preparation, calibration, extraction method and instrumental analysis. Sampling rates (RS) and passive sampler-water partition coefficients (KPW) were calculated for silicone rubber, polar organic chemical integrative sampler POCIS-A, POCIS-B, SDB-RPS and C18 disk. The uptake of the selected compounds depended on their physicochemical properties, i.e., silicone rubber showed a better uptake for more hydrophobic compounds (log octanol-water partition coefficient (KOW) &#62; 5.3), whereas POCIS-A, POCIS-B and SDB-RPS disk were more suitable for hydrophilic compounds (log KOW &#60; 0.70).

A protocol about the characterization and application of five different passive sampling devices is presented.

水中の農薬のモニタリングのための特性とパッシブサンプラーの応用

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study ...

環境学

Alternative Method of Removing Otoliths from Sturgeon

Extracting the otoliths (ear bones) from fish that have very thick skulls can be difficult and very time consuming. The common practice of making a transverse vertical incision on the top of the skull with a hand or electrical saw may damage the otolith if not performed correctly. Sturgeons (Acipenseridae) are one family in particular that have a very large and thick skull. A new laboratory method entering the brain cavity from the ventral side of the fish to expose the otoliths was easier than other otolith extraction methods found in the literature. Methods reviewed in the literature are designed for the field and are more efficient at processing large quantities of fish quickly. However, this new technique was designed to be more suited for a laboratory setting when time is not pressing and successful extraction from each specimen is critical. The success of finding and removing otoliths using this technique is very high and does not compromise the structure in any manner. This alternative technique is applicable to other similar fish species for extracting the otoliths.

The goal of the protocol is to show an effective method to extract the otoliths from sturgeon carcasses.

チョウザメから耳石を削除する別の方法

Extracting the otoliths (ear bones) from fish that have very thick skulls can be difficult and very time consuming. The common practice of making a ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about the overall structure of terrestrial microbial communities. PLFA profiling has been extensively used in a range of ecosystems as a biological index of overall soil quality, and as a quantitative indicator of soil response to land management and other environmental stressors.
The standard method presented here outlines four key steps: 1. lipid extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, 2. fractionation using solid phase extraction columns to isolate phospholipids from other extracted lipids, 3. methanolysis of phospholipids to produce fatty acid methyl esters (FAMEs), and 4. FAME analysis by capillary gas chromatography using a flame ionization detector (GC-FID). Two standards are used, including 1,2-dinonadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (PC(19:0/19:0)) to assess the overall recovery of the extraction method, and methyl decanoate (MeC10:0) as an internal standard (ISTD) for the GC analysis.

Phospholipid fatty acids provide information about the structure of soil microbial communities. We present methods for extraction from soil samples with a single-phase chloroform mixture, fractionation of extracted lipids using solid phase extraction columns, and methanolysis to produce fatty acid methyl esters, which are analyzed by capillary gas chromatography.

土壌中の微生物のリン脂質脂肪酸の抽出と分析

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

A Flow-through Exposure System for Evaluating Suspended Sediments Effects on Aquatic Life

This paper describes the Fish Larvae and Egg Exposure System (FLEES). The flow-through exposure system is used to investigate the effects of suspended sediment on various aquatic species and life stages in the laboratory by using pumps and automating delivery of sediment and water to simulate suspension of sediment. FLEES data are used to develop exposure-response curves between the effects on aquatic organisms and suspended sediment concentrations at the desired exposure duration. The effects data are used to evaluate management practices used to reduce the interactions between aquatic organisms and anthropogenic causes of suspended sediments. The FLEES is capable of generating total suspended solids (TSS) concentrations as low as 30 to as high as 800 mg/L, making this system an ideal choice for evaluating the effects of TSS resulting from many activities including simulating low ambient levels of TSS to evaluating sources of suspended sediments from dredging operations, vessel traffic, freshets, and storms.

A robust and flexible flow-through exposure system designed to maintain sediment in suspension is presented. The system is used to investigate the effects of suspended sediment on various aquatic species and life stages in the laboratory.

水生生物に浮遊堆積物の影響を評価するためのフロースルー露光装置

This paper describes the Fish Larvae and Egg Exposure System (FLEES). The flow-through exposure system is used to investigate the effects of suspended ...

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond quickly to environmental changes and can be thus used as indicators of water quality. Currently, biofilm assessment is mostly based on integrative and functional endpoints, such as photosynthetic or respiratory activity, which do not provide information on the biofilm community structure. Flow cytometry and computational visualization offer an alternative, sensitive, and easy-to-use method for assessment of the community composition, particularly of the photoautotrophic part of freshwater biofilms. It requires only basic sample preparation, after which the entire sample is run through the flow cytometer. The single-cell optical and fluorescent information is used for computational visualization and biological interpretation. Its main advantages over other methods are the speed of analysis and the high-information-content nature. Flow cytometry provides information on several cellular and biofilm traits in a single measurement: particle size, density, pigment content, abiotic content in the biofilm, and coarse taxonomic information. However, it does not provide information on biofilm composition on the species level. We see high potential in the use of the method for environmental monitoring of aquatic ecosystems and as an initial biofilm evaluation step that informs downstream detailed investigations by complementary and more detailed methods.

Flow cytometry in combination with visual clustering offers an easy-to-use and fast method for studying aquatic biofilms. It can be used for biofilm characterization, detection of changes in biofilm community structure, and detection of abiotic particles embedded in the biofilm.

フローサイトメトリーによる水生バイオ フィルムの特性

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The purpose of this manuscript is to provide detail on how to rapidly sample soil, rhizosphere, and endosphere of replicated field trials and analyze changes that may occur in the microbial communities due to sample type, treatment, and plant genotype. The experiment used to demonstrate these methods consists of replicated field plots containing two, pure, warm-season grasses (Panicum virgatum and Andropogon gerardii) and a low-diversity grass mixture (A. gerardii, Sorghastrum nutans, and Bouteloua curtipendula). Briefly, plants are excavated, a variety of roots are cut and placed in phosphate buffer, and then shaken to collect the rhizosphere. Roots are brought to the laboratory on ice and surface sterilized with bleach and ethanol (EtOH). The rhizosphere is filtered and concentrated by centrifugation. Excavated soil from around the root ball is placed into plastic bags and brought to the lab where a small amount of soil is taken for DNA extractions. DNA is extracted from roots, soil, and rhizosphere and then amplified with primers for the V4 region of the 16S rRNA gene. Amplicons are sequenced, then analyzed with open access bioinformatics tools. These methods allow researchers to test how the microbial community diversity and composition varies due to sample type, treatment, and plant genotype. Using these methods along with statistical models, the representative results demonstrate there are significant differences in microbial communities of roots, rhizosphere, and soil. Methods presented here provide a complete set of steps for how to collect field samples, isolate, extract, quantify, amplify, and sequence DNA, and analyze microbial community diversity and composition in replicated field trials.

Excavation of plant roots from the field as well as processing of samples into endosphere, rhizosphere, and soil are described in detail, including DNA extraction and data analysis methods. This paper is designed to enable other laboratories to use these techniques for the study of soil, endosphere, and rhizosphere microbiomes.

実験で多年生の草の根、根、土壌微生物の分離と解析

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and toxicological studies. Using automated digital tracking platforms, recent efforts in neuropharmacology are leveraging larval fish locomotor behaviors to identify potential therapeutic targets for novel small molecules. Similar to these efforts, research in the environmental sciences and comparative pharmacology and toxicology is examining various behaviors of fish models as diagnostic tools in tiered evaluation of contaminants and real-time monitoring of surface waters for contaminant threats. Whereas the zebrafish is a popular larval fish model in the biomedical sciences, the fathead minnow is a common larval fish model in ecotoxicology. Unfortunately, fathead minnow larvae have received considerably less attention in behavioral studies. Here, we develop and demonstrate a behavioral profile protocol using caffeine as a model neurostimulant. Though photomotor responses of fathead minnows were occasionally affected by caffeine, zebrafish&#160;were markedly more sensitive for photomotor and locomotor endpoints, which responded at environmentally relevant levels. Future studies are needed to understand comparative behavioral sensitivity differences among fish with age and time of day, and to determine whether similar behavioral effects would occur in nature and be indicative of adverse outcomes at the individual or population levels of biological organization.

Here, we present a protocol to examine larval zebrafish and fathead minnow locomotor activities and photomotor responses (PMR) using an automated tracking software. When incorporated in common toxicology bioassays, analyses of these behaviors provide a diagnostic tool to examine chemical bioactivity. This protocol is described using caffeine, a model neurostimulant.

稚魚の行動応答プロファイルを調べるための実験プロトコル: 神経興奮剤カフェインへの応用

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, we described a protocol for multiple analyses of the biological compositions in environmental PM. Five experiments are presented: (1) PM number monitoring by using a laser particle counter; (2) PM collection by using a cyclonic aerosol sampler; (3) PM collection by using a high-volume air sampler with filters; (4) culturable microbes collection by the Andersen six-stage sampler; and (5) detection of biological composition of environmental PM by bacterial 16SrDNA and fungal ITS region sequencing. We selected hazy days and a livestock farm as two typical examples of the application in this protocol. In this study, these two sampling methods, cyclonic aerosol sampler and filter sampler, showed different sampling efficiency. The cyclonic aerosol sampler performed much better in terms of collecting bacteria, while these two methods showed the same efficiency in collecting fungi. Filter samplers can work under low temperature conditions while cyclonic aerosol samplers have a sampling limitation for temperature. A solid impacting sampler, such as an Andersen six-stage sampler, can be used to sample bioaerosols directly into the culture medium, which increases the survival rate of culturable microorganisms. However, this method mainly relies on culture while more than 99% of microbes cannot be cultured. DNA extracted from the culturable bacteria collected by the Andersen six-stage sampler and samples collected by cyclonic aerosol sampler and filter sampler were detected by bacterial 16S rDNA and fungal ITS region sequencing.All the methods above may have wide application in many fields of study, such as environmental monitoring and airborne pathogen detection. From these results, we can conclude that these methods can be used under different conditions and may help other researchers further explore the health impacts of environmental bioaerosols.

Understanding the biological composition of environmental particulate matter is important for the study of its significant impacts on human health and disease spread. Here, we used three types of bioaerosol sampling methods and a biological analysis of airborne microbes to better explore airborne microbial communities under different environmental conditions.

組成と異なる環境条件下におけるバイオエアロゾルの分布解析

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...

Identifying Per- and Polyfluorinated Chemical Species with a Combined Targeted and Non-Targeted-Screening High-Resolution Mass Spectrometry Workflow

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the local to federal levels. The continuing evolution of PFAS chemistries presents a challenge to the environmental monitoring, where ongoing development of targeted methods necessarily lags the discovery of new chemical compounds. There is a need, therefore, to have forward-looking methodologies that can detect emerging and unexpected compounds, monitor these species over time, and resolve details of their chemical structure to enable future work in human health. To this end, non-targeted analysis by high-resolution mass spectrometry offers a broad base detection approach that can be combined with almost any sample preparation scheme and provides significant capabilities for compound identification after detection. Herein, we describe a solid-phase extraction (SPE) based sample concentration method tuned for shorter chain and more hydrophilic PFAS chemistries, such as per fluorinated ether acids and sulfonates, and describe analysis of samples prepared in this fashion in both targeted and non-targeted modes. Targeted methods provide superior quantification when reference standards are available but are intrinsically limited to expected compounds when performing analysis. In contrast, a non-targeted approach can identify the presence of unexpected compounds and provide some information about their chemical structure. Information about chemical features can be used to correlate compounds across sample locations and track abundance and occurrence over time.

Here, we present a protocol for the sequential targeted quantification and non-targeted analysis of fluorinated compounds in water by mass spectrometry. This methodology provides quantitative levels of known fluorochemical compounds and identifies unknown chemicals in related samples with semi-quantitative estimates of their abundance.

あたりを識別する-ポリフルオロ化学種の結合対象・非対象と検診高分解能質量分析ワークフロー

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the ...

Fluorescently Labeled Bacteria as a Tracer to Reveal Novel Pathways of Organic Carbon Flow in Aquatic Ecosystems

Elucidating trophic interactions, such as predation and its effects, is a frequent task for many researchers in ecology. The study of microbial communities has many limitations, and determining a predator, prey, and predatory rates is often difficult. Presented here is an optimized method based on the addition of fluorescently labelled prey as a tracer, which allows for reliable quantitation of the grazing rates in aquatic predatory eukaryotes and estimation of nutrient transfer to higher trophic levels.

Presented here is a protocol for a single-cell, epifluorescence microscopy-based technique to quantify grazing rates in aquatic predatory eukaryotes with high precision and taxonomic resolution.