Este trabajo fue apoyado por un Centro de Investigación de Medicina y Salud Nacional (NHMRC) subvención para el proyecto de RM

Todos los procedimientos experimentales aquí descritos cumplen con el Comité de Cuidado y Ética Animal de la UNSW Australia y se llevaron a cabo de acuerdo con el Nacional de Salud y Consejo de Investigación Médica de Australia reglamentos para la experimentación animal. Todos los procedimientos de este protocolo deben realizarse de acuerdo con el requerimiento de la Comisión correspondiente Cuidado de Animales y Ética. 1. La acetilcolinesterasa histoquímica tinción <ol><li> Preparar la mezcla de reacción de la acetilcolinesterasa <ol><li> Añadir 290 mg de yoduro de acetiltiocolina a 200 ml de tampón fosfato 0,1 M (PB). Mezclar con un agitador magnético a 900 rpm. </li><li> Añadir 600 mg de glicina bajo agitación continua. </li><li> Añadir lentamente 420 mg de sulfato de cobre a la mezcla de reacción bajo agitación continua hasta que el producto se haya disuelto completamente. </li></ol></li><li> Retire la piel de la canal animal (obtenido a través del intercambio de tejido) haciendo incisionesen la piel de una rata o ratón perfundido, agarrando la piel de la zona del cuello y tirando de él más allá de sus pies. Asegúrese de que la fascia que cubre cada músculo es o bien eliminado o perforado de manera significativa para asegurar una amplia exposición de las fibras musculares a la solución de reacción. </li><li> Sumergir todo el cuerpo o la integridad física de interés en la mezcla de reacción y se incuba O / N a 4 ° C. </li><li> Lavar la carcasa durante 2 minutos en agua destilada. Nota: En esta etapa, los músculos exhiben una coloración azul y las placas extremas del motor (MEPS) pueden verse como puntos blancos. </li><li> Exponer la carcasa a una solución de sulfuro de amonio al 10% durante 3-5 seg. Nota: Las fibras musculares se convierten rápidamente marrón y los diputados al Parlamento Europeo serán observables como puntos negros moteados. Si la reacción se produce con demasiada rapidez, y las fibras musculares se tiñen demasiado oscuro para distinguir entre los eurodiputados y las fibras musculares intente usar concentraciones más bajas de solución de sulfuro de amonio (por ejemplo, 5%). El tiempo de reacción para obtener elun contraste óptimo entre los eurodiputados y las fibras musculares varía de una muestra a la otra. Por lo tanto, es difícil definir el tiempo de exposición exacta para el reactivo. La reacción debe ser monitoreado de cerca y se detuvo cuando el contraste se considera adecuada. </li><li> Lave la canal dos veces, con agitación en agua destilada y acaricie suavemente el cadáver seco. </li><li> Fotografía los aspectos lateral y medial de la extremidad, lo que garantiza que los eurodiputados de todos los músculos de interés son capturados. </li></ol> 2. Las inyecciones intramusculares en las placas motoras de final <ol><li> Tire micropipetas de vidrio con un extractor micropipeta (el uso de micropipetas graduadas con émbolos se recomienda). Con la ayuda de un microscopio de disección, romper las puntas de las micropipetas con un par de pinzas de tal manera que el diámetro interno del lumen de la micropipeta es de aproximadamente 0,5 mm. </li><li> Asegúrese de que todos los instrumentos quirúrgicos utilizados son recién autoclave y XXen el área quirúrgica es estéril. </li><li> Llenar las micropipetas con fluoro-Oro (5% en agua destilada). </li><li> Inducir anestesiar en el animal en una cámara de inducción con isofluorano (4% en O 2). Compruebe reflejo de enderezamiento y asegurar su ausencia antes de sacarla de la cámara de inducción. Asegurar un cono de la nariz sobre el hocico de la rata y entregar isofluorano (2% en O 2) para el mantenimiento de la anestesia. Apriete los pies del animal y tocar suavemente el ojo del animal para asegurar que tanto la retirada del pedal y los reflejos corneales están ausentes. Nota: Una mezcla de ketamina y xylazil también se puede utilizar (80 y 10 mg / kg respectivamente, entregado por vía intraperitoneal). La ketamina es un Anexo 8 (&quot;controlada&quot;) de drogas y protocolos necesarios relacionados con la compra, uso, almacenamiento y eliminación de la droga tendrán que ser respetados. </li><li> Aplicar lubricante ocular para evitar el secado de los ojos durante el curso del procedimiento. </li><li> Afeitarse la textremidad argeted y el uso de gasa para limpiar la zona afeitada con tres matorrales alternas de clorhexidina y alcohol al 70%. Transferir el animal para el área quirúrgica. </li><li> Colocar el animal en un underpad limpio y posicionarlo adecuadamente para garantizar un buen acceso al músculo (s) objetivo. </li><li> Use un par de pinzas con los apretones de dientes para levantar la piel sobre el músculo a tratar fuera de la musculatura subyacente y hacer una incisión en la piel con unas tijeras quirúrgicas. Asegúrese de que la incisión es lo suficientemente grande para exponer completamente el músculo (s) de interés. Asegúrese de que haya una interrupción mínima de la fascia. </li><li> Utilice las fotografías MEP transponer mentalmente la ubicación y la forma de la región MEP en el músculo (s). Nota: un marcador de fieltro bien podría ayudar a reproducir la región MEP en la fotografía en el músculo (s) de interés. </li><li> Realizar múltiples inyecciones a lo largo de toda la longitud de la región MEP (por fluoro-Oro, 3 a 4 inyecciones de 2.1 l cada should ser suficiente). Limpie suavemente el músculo (s) para eliminar cualquier filtración. </li><li> Traiga los dos extremos de la piel incisa muy juntos con unas pinzas romas y cerrar la herida con grapas quirúrgicas. Infíltrate en 0,1 ml de bupivacaína (0,5% en agua) (u otros anestésicos locales) a lo largo de todo el arco de la herida. </li><li> Encienda la máquina de anestesia fuera y controlar al animal hasta que se ha recuperado totalmente de la anestesia. </li><li> Espere 14 días entre la administración de inyecciones intra-muscular y la perfusión de los animales. </li></ol> 3. perfusiones <ol><li> Administrar una dosis letal de pentobarbital de sodio solución (por ejemplo Lethabarb; 150 mg / kg) al animal mediante inyección intraperitoneal. <ol><li> Seguir de cerca el animal hasta que se alcance un nivel de profundidad de la anestesia, según ha confirmado la ausencia de la retirada del pedal y los reflejos corneales. </li></ol></li><li> Coloque el animal sobre su espalda en una tabla de disección se coloca sobre un perfusion fregadero. </li><li> Use un par de pinzas con los apretones de dientes para levantar la piel que cubre la base del esternón. Haga una pequeña incisión en la piel con un par de fuertes tijeras quirúrgicas inmediatamente por debajo del esternón y luego usar las pinzas para agarrar el cartílago xifoides del esternón. Mientras sostiene el cartílago xifoides, agrandar la incisión en ambos lados de la cavidad del pecho, desde el esternón hasta las axilas. </li><li> Cortar el diafragma para exponer el corazón. <ol><li> Inyectar 0.ml de heparina directamente en el ápice del corazón para prevenir la coagulación de la sangre. </li><li> Cortar el ápice para permitir la inserción de una cánula en el ventrículo izquierdo, y luego sujetar rápidamente la cánula en su lugar con la ayuda de un hemostático. </li><li> Hacer una incisión en la aurícula derecha con un par de tijeras finas y comenzar inmediatamente la bomba peristáltica. Perfundir con 0,1 M PB hasta que el líquido que sale del atrio es casi libre de la sangre y el color del hígado se vuelve de color marrón claro. Entonces, perfundir con una solución de paraformaldehído (4% en PB 0,1 M) hasta que todo el cuerpo del animal se vuelve rígido. </li></ol></li></ol> 4. cervical Médula Espinal La disección y preparación para Histología <ol><li> Coloque el cadáver de un animal en su abdomen. </li><li> Cortar la piel en la línea media del cuerpo con un bisturí y reflejar de la base del cráneo hasta el nivel del hueso ilíaco. </li><li> Cortar y reflejan los músculos paravertebrales para exponer la cara dorsal de la columna vertebral. </li><li> Identificar la apófisis espinosa ósea del Atlas, el segundo segmento cervical (es decir, C2), y eliminarlo con un par de pinzas gubias quirúrgicas o para localizar la raíz dorsal correspondiente subyacente. <ol><li> Identificar la raíz C2 derecho coloreando con un rotulador permanente. </li><li> Retire el siguiente vértebras uno por uno y marcar las raíces dorsales correctas con colores alternos (es decir, C2, C4, C6, C8 y pueden ser coloreados en verde y C3, C5, C7, T1 puede ser colORed en azul). </li></ol></li><li> Utilice una aguja quirúrgica pequeña (por ejemplo, G aguja de calibre 30) para perforar suavemente a través de la duramadre que cubre el extremo inferior de la médula espinal. Con el bisel de la aguja hacia arriba, levante la duramadre lejos de la cuerda mientras se mueve la aguja rostralmente hacer una hendidura longitudinal. <ol><li> Reflejar la duramadre. </li></ol></li><li> Cortar la forma transversal de la médula espinal en bloques de uno o dos segmentos con una nueva hoja de bisturí. <ol><li> Deja los segmentos de la médula espinal in situ y, para cada bloque, hacer cuidadosamente una pequeña marca fiducial en el lado izquierdo de cada bloque con la mitad de camino hoja de bisturí entre dos raíces adyacentes. Asegúrese de que la marca de referencia es lo suficientemente profunda a través del tejido que sea visible desde el aspecto ventral de los bloques. Hacer la marca fiducial en un ángulo de aproximadamente 45 °, señalando ya sea anterior o posterior con respecto a la anatomía animal, para ayudar en la orientación del segmento de tejido después de la disección. </li></ol></li><li> Recoge los bloques individuales en pequeñas botellas, claramente etiquetados que contienen una solución de paraformaldehído (4% en 0,1 M PB) y dejar a temperatura ambiente O / N. </li><li> La transferencia de los bloques en botellas limpias, claramente marcado que contiene una solución de sacarosa (30% en 0,1 M PB) y mantener a 4 ° C durante al menos dos días. </li><li> Coloque los segmentos en crio-moldes y los cubrió con medio de congelación de tejido. Para la preparación histológica longitudinal, orientar los bloques con la cara dorsal hacia arriba y usar la marca de referencia para orientar el bloque en los crio-moldes. </li><li> Congelar las crio-moldes a -20 ° C y cortar con un criostato en secciones de 50 micras de grosor. Nota: Las secciones se pueden montar directamente en portaobjetos de microscopio de adhesión y se dejan secar O / N. Alternativamente, las secciones se pueden flotar en placas de 48 pocillos llenos de 0,1 M PB y posteriormente montados usando la marca de referencia para orientar las secciones de tejido en las diapositivas. </li></ol> 5. columna lumbar Cord disección y preparación para Histología <ol><li> Coloque el cadáver de un animal sobre su espalda. </li><li> Realizar una incisión en la línea media a lo largo del abdomen del animal y eliminar las vísceras. Diseccionar los músculos de la pared abdominal posterior para exponer el aspecto ventral de la columna vertebral. </li><li> Localice el corto rib-caudal mayor y su contigua vértebra T13 donde la raíz ventral T13 sale del hueso. <ol><li> Eliminar consecutivamente uno por uno el rostral dos o tres vértebras T13 (es decir, T12, T11 y, si es necesario, T10) con gubias quirúrgicas finas para seguir la raíz ventral T13 hasta su punto de entrada en la cara ventral del cordón ventral y marcar con un rotulador permanente. </li><li> A partir de ahora, repita el mismo procedimiento para identificar la ubicación de los puntos de entrada de la raíz ventral para L1, L2, L3, L4, L5, L6 y S1, colorear con colores alternados. </li></ol></li><li> Siga el mismo procedimiento que se describe en la Sección 4.5 a 4.10 para lumbar disección de la médula espinal. </li></ol>

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	<li>Kaspar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+Viral+Delivery+of+IGF-1+Prolongs+Survival+in+a+Mouse+ALS+Model.">Retrograde Viral Delivery of IGF-1 Prolongs Survival in a Mouse ALS Model.</a> Science. 301 (5634), (2003).</li><li>Ishiyama, T., Okada, R., Nishibe, H., Mitsumoto, H., Nakayama, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Riluzole+slows+the+progression+of+neuromuscular+dysfunction+in+the+wobbler+mouse+motor+neuron+disease.">Riluzole slows the progression of neuromuscular dysfunction in the wobbler mouse motor neuron disease.</a> Brain Res. 1019 (1-2), 226-236 (2004).</li><li>Turner, B. J., Parkinson, N. J., Davies, K. E., Talbot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+motor+neuron+deficiency+enhances+progression+in+an+amyotrophic+lateral+sclerosis+mouse+model.">Survival motor neuron deficiency enhances progression in an amyotrophic lateral sclerosis mouse model.</a> Neurobiol Dis. 34 (3), 511-517 (2009).</li><li>Wegorzewska, I., Bell, S., Cairns, N. J., Miller, T. M., Baloh, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+mutant+transgenic+mice+develop+features+of+ALS+and+frontotemporal+lobar+degeneration.">TDP-43 mutant transgenic mice develop features of ALS and frontotemporal lobar degeneration.</a> P Natl Acad Sci USA. 106 (44), 18809-18814 (2009).</li><li>Kimura, E., Li, S., Gregorevic, P., Fall, B. M., Chamberlain, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+delivery+to+muscles+of+mdx+mice+using+lentiviral+vectors+leads+to+myogenic+progenitor+targeting+and+stable+gene+expression.">Dystrophin delivery to muscles of mdx mice using lentiviral vectors leads to myogenic progenitor targeting and stable gene expression.</a> Mol Ther. 18 (1), 206-213 (2009).</li><li>Van Den Bosch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+rodent+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Genetic rodent models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Biomed Biotechnol. 2011 (6), 348765–11 (2011).</li><li>Pratt, S. J. P., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+in+vivo+injury+on+the+neuromuscular+junction+in+healthy+and+dystrophic+muscles.">Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles.</a> J Physiol. 591 (Pt 2), 559-570 (2013).</li><li>Garrett, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DYNC1H1+mutation+alters+transport+kinetics+and+ERK1/2-cFos+signalling+in+a+mouse+model+of+distal+spinal+muscular+atrophy).">DYNC1H1 mutation alters transport kinetics and ERK1/2-cFos signalling in a mouse model of distal spinal muscular atrophy).</a> Brain. 137 (Pt 7), 1883-1893 (2014).</li><li>Bordet, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+cardiotrophin-1+adenoviral+gene+transfer+on+neuromuscular+degeneration+in+transgenic+ALS+mice).">Protective effects of cardiotrophin-1 adenoviral gene transfer on neuromuscular degeneration in transgenic ALS mice).</a> Hum Mol Gen. 10 (18), 1925-1933 (2001).</li><li>Acsadi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+survival+and+function+of+SOD1+mice+after+glial+cell-derived+neurotrophic+factor+gene+therapy.">Increased survival and function of SOD1 mice after glial cell-derived neurotrophic factor gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 13 (9), 1047-1059 (2002).</li><li>Azzouz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+delivery+with+retrogradely+transported+lentivector+prolongs+survival+in+a+mouse+ALS+model.">VEGF delivery with retrogradely transported lentivector prolongs survival in a mouse ALS model.</a> Nature. 429 (6990), 413-417 (2004).</li><li>Suzuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+muscle+delivery+of+GDNF+with+human+mesenchymal+stem+cells+improves+motor+neuron+survival+and+function+in+a+rat+model+of+familial+ALS.">Direct muscle delivery of GDNF with human mesenchymal stem cells improves motor neuron survival and function in a rat model of familial ALS.</a> Mol Ther. 16 (12), 2002-2010 (2008).</li><li>Benkhelifa-Ziyyat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intramuscular+scAAV9-SMN+Injection+Mediates+Widespread+Gene+Delivery+to+the+Spinal+Cord+and+Decreases+Disease+Severity+in+SMA+Mice.">Intramuscular scAAV9-SMN Injection Mediates Widespread Gene Delivery to the Spinal Cord and Decreases Disease Severity in SMA Mice.</a> Mol Ther. 21 (2), 282-290 (2013).</li><li>Azzouz, M., Hottinger, A., Paterna, J. C., Zurn, A. D., Aebischer, P., B&#252;eler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+motoneuron+survival+and+improved+neuromuscular+function+in+transgenic+ALS+mice+after+intraspinal+injection+of+an+adeno-associated+virus+encoding+Bcl-2.">Increased motoneuron survival and improved neuromuscular function in transgenic ALS mice after intraspinal injection of an adeno-associated virus encoding Bcl-2.</a> Hum Mol Gen. 9 (5), (2000).</li><li>Lepore, A. C., Haenggeli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraparenchymal+spinal+cord+delivery+of+adeno-associated+virus+IGF-1+is+protective+in+the+SOD1G93A+model+of+ALS.">Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS.</a> Brain Res. 1185, 256-265 (2007).</li><li>Schnapp, B. J., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+is+the+motor+for+retrograde+axonal+transport+of+organelles.">Dynein is the motor for retrograde axonal transport of organelles.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 86 (5), 1548-1552 (1989).</li><li>Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Molecular+Motor+Toolbox+for+Intracellular+Transport.">The Molecular Motor Toolbox for Intracellular Transport.</a> Cell. 112 (4), 467-480 (2003).</li><li>Schiavo, G., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+biology:+Alternative+energy+for+neuronal+motors.">Cell biology: Alternative energy for neuronal motors.</a> Nature. 495 (7440), 178-180 (2013).</li><li>Gracies, J. -. M., Lugassy, M., Weisz, D. J., Vecchio, M., Flanagan, S., Simpson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Botulinum+Toxin+Dilution+and+Endplate+Targeting+in+Spasticity.+A+Double-Blind+Controlled+Study.">Botulinum Toxin Dilution and Endplate Targeting in Spasticity. A Double-Blind Controlled Study.</a> Arch Phys Med Rehabil. 90 (1), 9-16 (2009).</li><li>Van Campenhout, A., Molenaers, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+motor+endplate+zone+in+human+skeletal+muscles+of+the+lower+limb:+anatomical+guidelines+for+injection+with+botulinum+toxin.">Localization of the motor endplate zone in human skeletal muscles of the lower limb: anatomical guidelines for injection with botulinum toxin.</a> Dev Med Child Neurol. 53 (2), 108-119 (2011).</li><li>Tosolini, A. P., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+characterization+of+the+motor+neuron+columns+supplying+the+rat+forelimb.">Spatial characterization of the motor neuron columns supplying the rat forelimb.</a> Neuroscience. 200, 19-30 (2012).</li><li>Tosolini, A. P., Mohan, R., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+full+length+of+the+motor+end+plate+regions+in+the+mouse+forelimb+increases+the+uptake+of+fluoro-gold+into+corresponding+spinal+cord+motor+neurons.">Targeting the full length of the motor end plate regions in the mouse forelimb increases the uptake of fluoro-gold into corresponding spinal cord motor neurons.</a> Front Neurol. 4, 58 (2013).</li><li>Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+motor+end+plates+in+the+mouse+hindlimb+gives+access+to+a+greater+number+of+spinal+cord+motor+neurons:+an+approach+to+maximize+retrograde+transport.">Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport.</a> Neuroscience. 274, 318-330 (2014).</li><li>Baumgartner, B. J., Shine, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+of+spinal+motoneurons+following+targeted+transduction+with+an+adenoviral+vector+carrying+the+gene+for+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor.">Neuroprotection of spinal motoneurons following targeted transduction with an adenoviral vector carrying the gene for glial cell line-derived neurotrophic factor.</a> Exp Neurol. 153 (1), 102-112 (1998).</li><li>Gransee, H. M., Zhan, W. -. Z., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+TrkB+receptor+to+phrenic+motoneurons+enhances+functional+recovery+of+rhythmic+phrenic+activity+after+cervical+spinal+hemisection.">Targeted delivery of TrkB receptor to phrenic motoneurons enhances functional recovery of rhythmic phrenic activity after cervical spinal hemisection.</a> PLoS ONE. 8 (5), e64755 (2013).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Focalización intramuscular y transferencia retrógrada posterior de transgenes terapéuticos a los correspondientes motoneuronas α para el tratamiento experimental de la condición neuromuscular no es una estrategia nueva. Por ejemplo, este método de entrega se ha utilizado para retrasar la degeneración neuromuscular en diferentes etapas de la progresión de la ALS en ratones y ratas SOD1 1,9-12 así como en ratones con SMA 13. Aunque prometedor, la eficacia de estos escenarios de terapia géni...

La pérdida de control del movimiento voluntario que resulta de condiciones neurológicas como la enfermedad de la motoneurona espinal-y así como la atrofia muscular de Duchenne es una enfermedad debilitante que tiene impacto duradero de alto y largo en la vida cotidiana de los individuos afectados. Durante la última década, los esfuerzos de investigación con el objetivo de detener o al menos retrasar los efectos nocivos de estas enfermedades neuromusculares ha sido una prioridad para muchos médicos y científicos de todo el mundo. En este sentido, la reciente generación de modelos animales que imitan estas enfermedades neuromusculares ha sido fundamental en la obtención de conocimientos fundamentales de los mecanismos fisiológicos subyacentes al desarrollo y la progresión de estas condiciones 1-13. El tratamiento de estas enfermedades neuromusculares requiere acceso directo a la médula espinal y se puede lograr por medio de inyecciones en la médula espinal 14,15. Los recientes avances en la terapia génica también han atacado a los músculos estriados de la parte superior ymiembros inferiores a los genes terapéuticos de transporte a los correspondientes motoneuronas α que se encuentran dentro del asta ventral de la médula espinal 1,9-13. Sin embargo, esta estrategia una vez prometedora no ha logrado mejorar el resultado de estas condiciones neurológicas. Si bien es justo concluir que estos pobres resultados podrían ser, al menos en parte, ser atribuible a la baja eficacia de estos genes protectores, no se puede excluir la baja eficacia de estos métodos de administración de genes. Placas terminales del motor (los diputados) son regiones especializadas de las miofibras esqueléticas que se sangría por los terminales de los axones de las grandes fibras motoras periféricas procedentes de α neuronas motoras. En conjunto, las terminaciones de fibras nerviosas periféricas y los eurodiputados forman la unión neuromuscular, es decir, el lugar donde los impulsos sinápticos son provocados por la liberación anterógrada del neurotransmisor, la acetilcolina. Es importante destacar que la relación entre las fibras nerviosas periféricas y los eurodiputados es bi-direccional, aunque diferentes motores son responsables del transporte de moléculas y orgánulos hacia y fuera de la neurona Somata 16-18. A la luz de estas consideraciones anatómicas, los eurodiputados parecen ser el blanco de elección para la entrega y transporte retrógrado subsiguiente de material genético a las neuronas motoras correspondientes. En este contexto, no es sorprendente que el éxito de la transducción de las neuronas del motor depende en gran medida de la distancia entre la inyección intramuscular de vectores virales y eurodiputados del músculo 19-20. Sorprendentemente, sin embargo, la localización exacta de las zonas de MEP en las miofibras de la rata y el ratón de laboratorio, las dos especies de elección para modelar enfermedades neuromusculares, no estaban disponibles hasta hace poco. Hemos producido mapas completos de la región MEP durante varios músculos de las extremidades anteriores en la rata y el ratón 21-22. Más recientemente, hemos mostrado los detalles de la organización del MEP region durante varios músculos de la extremidad posterior del ratón 23 y que están analizando las características de los diputados al Parlamento Europeo en la extremidad posterior de la rata. En nuestras manos, inyecciones intramusculares de trazadores retrógradas dirigidas a la totalidad de las zonas de MEP en estos músculos dieron lugar a las neuronas motoras más marcadas que se abarcan segmentos más de la médula espinal que se informó anteriormente. Aquí presentamos el protocolo que se ha desarrollado en los últimos años para revelar la ubicación de los diputados en la superficie externa, así como en toda la profundidad de las extremidades posteriores y músculos de la extremidad anterior, tanto en el ratón y la rata.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fluoro-Gold</td>
			<td>Fluorochrome, LLC</td>
			<td>Nil</td>
			<td>Diluted to 5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drummond PCR Micropipets 1-10&#181;l</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>5-000-1001-X10</td>
			<td>accompanied with plungers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetylthiocholine Iodide</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A5751-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) Sulfate Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>61230-500G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T Compound</td>
			<td>Sakura Finetek</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>1083-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Tetramethylrhodamine and biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D-3312</td>
			<td>Diliuted in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isothesia</td>
			<td>Provet</td>
			<td>ISOF00</td>
			<td>1000mg/g Isoflurane inhalation vapour</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclip 9mm Wound Clips</td>
			<td>Texas Scientific Instruments, LLC</td>
			<td align="right">205016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lethabarb Enthanasia Injection</td>
			<td>Virbac (Australia) Pty Ltd.</td>
			<td>LETHA450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Solution</td>
			<td>Ajax Finechem</td>
			<td>A809-2.5L PL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus glass slides</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulphide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A1952</td>
			<td>Diluted to 10%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marcain Spinal 0.5% (Bupivacaine hydrochloride)</td>
			<td>Astrazenca</td>
			<td></td>
			<td>Diluted to 0.25%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intramuscular injections along the motor end plates: a minimally invasive approach to shuttle tracers directly into motor neurons

Las enfermedades que afectan la integridad de las neuronas motoras de la médula espinal se encuentran entre las enfermedades neurológicas más debilitantes. Durante las últimas décadas, el desarrollo de varios modelos animales de estos trastornos neuromusculares ha proporcionado la comunidad científica con diferentes escenarios terapéuticos dirigidos a retrasar o revertir la progresión de estas condiciones. Al tomar ventaja de la maquinaria retrógrado de las neuronas, uno de estos enfoques ha sido para apuntar los músculos esqueléticos con el fin de genes terapéuticos de transporte en los correspondientes neuronas motoras de la médula espinal. Aunque una vez prometedor, el éxito del enfoque de prestación de dicho gen se ha visto obstaculizada por el número subóptimo de las neuronas motoras transducidas se ha mostrado hasta ahora a ceder. Placas de extremo del motor (MEPS) son regiones altamente especializados en la musculatura esquelética que están en contacto sináptica directa a la médula espinal α neuronas motoras. A este respecto, es importante señalar que, hasta ahora, los esfuerzos para retrógradamentegenes de transferencia en neuronas motoras se hicieron sin referencia a la ubicación de la región de MEP en los músculos objetivo. A continuación, describimos un protocolo simple 1) para revelar la ubicación exacta de los eurodiputados en la superficie de los músculos esqueléticos y 2) para utilizar esta información para guiar la entrega intramuscular y posterior transporte retrógrado óptima de trazadores retrógradas en neuronas motoras. Esperamos utilizar los resultados de estos experimentos de rastreo en otros estudios en la investigación de transporte retrógrado de genes terapéuticos a las neuronas motoras de la médula espinal a través de la focalización de los eurodiputados.

La acetilcolinesterasa tinción histoquímica revela la localización de las placas extremas del motor a través de la anchura de los músculos. Figura 1 ilustra los resultados de tales tinción realizado en toda una extremidad anterior de rata. Se sugiere para optimizar la concentración de la solución de sulfuro de amonio (por ejemplo., 5-7% en lugar del 10%), así como el tiempo de la muestra se sumerge en la solución si la tinción de fondo no específica en las fibras de músculos es dem...

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Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

Las inyecciones intramusculares largo de las placas motoras de final: un abordaje mínimamente invasivo de trazadores de traslado directamente en neuronas motoras

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

intramuscular-injections-along-motor-end-plates-minimally-invasive

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.5K vistas.  University of New South Wales. The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

Video: Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Extracelularmente Identificar las neuronas motoras de un músculo en la piscina Motor<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Investigación

Neurociencias

Minimally-invasive Technique for Injection into Rat Optic Nerve

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central nervous system in a minimally-invasive surgery without bone removal. This technique describes an approach to visualization and direct injection of the optic nerve following minor fascial dissection from the orbital ridge, using a conjunctival traction suture to gently pull the eye down and out. Representative examples of an injected optic nerve show successful injection of dyed beads.

Direct injection into the rat optic nerve is useful for regenerative research. We demonstrate a minimally-invasive technique for direct injection into a rat optic nerve that does not involve opening the skull. Using this method, surgical complications are minimized and recovery is more rapid.

Técnica mínimamente invasiva para la inyección en nervio óptico de la rata

The rat optic nerve is a useful model for stem cell regeneration research. Direct injection into the rat optic nerve allows delivery into the central ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

¿Por qué importa la cuantificación: Caracterización de fenotipos en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval unión neuromuscular

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons extend growth cones to navigate along specific pathways by responding to a large number of axon guidance cues that emanate from the surrounding extracellular environment. Growth cone target recognition also plays a critical role in neuromuscular specificity. This work presents a standard immunohistochemistry protocol to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. This protocol includes a few key steps, including a genotyping procedure, to sort the desired mutant embryos; an immunostaining procedure, to tag embryos with fasciclin II (FasII) antibody; and a dissection procedure, to generate filleted preparations from fixed embryos. Motor axon projections and muscle patterns in the periphery are much better visualized in flat preparations of filleted embryos than in whole-mount embryos. Therefore, the filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition, and it can also be applied to both loss-of-function and gain-of-function genetic screens.

Visualization of the Axonal Projection Pattern of Embryonic Motor Neurons in Drosophila

This work details a standard immunohistochemistry method to visualize motor neuron projections of late stage-16 Drosophila melanogaster embryos. The filleted preparation of fixed embryos stained with FasII antibody provides a powerful tool to characterize the genes required for motor axon pathfinding and target recognition during neural development.

Visualización del patrón de proyección axonal de las neuronas motrices embrionarias<em&gt; Drosophila</em

The establishment of functional neuromuscular circuits relies on precise connections between developing motor axons and target muscles. Motor neurons ...

Endoscopic Endonasal Trans-sphenoidal Approach: Minimally Invasive Surgery for Pituitary Adenomas

Endoscopic endonasal trans-sphenoidal surgery has become the gold standard for the surgical treatment of pituitary adenomas and many other pituitary lesions. Refinements in surgical techniques, technological advancements, and incorporation of neuronavigation have rendered this surgery minimally invasive. The complication rates of this surgery are very low while excellent results are consistently obtained through this approach.
This paper focuses on the step-by-step surgical approach to pituitary adenomas, which is based on personal experience, and details the results obtained with this minimally invasive surgery.

The aim of this paper is to describe the different steps of the endoscopic endonasal approach to the sella turcica.

Enfoque Endonasal endoscópica trans-esfenoidal: Cirugía mínimamente invasiva para los Adenomas pituitarios

Endoscopic endonasal trans-sphenoidal surgery has become the gold standard for the surgical treatment of pituitary adenomas and many other pituitary ...

Retrograde Neuroanatomical Tracing of Phrenic Motor Neurons in Mice

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic nerves innervating the respiratory diaphragm. In spinal cord slices, phrenic motor neurons cannot be identified from other motor neurons on morphological or biochemical criteria. We provide the description of procedures for visualizing phrenic motor neuron cell bodies in mice, following intrapleural injections of cholera toxin subunit beta (CTB) conjugated to a fluorophore. This fluorescent neuroanatomical tracer has the ability to be caught up at the diaphragm neuromuscular junction, be carried retrogradely along the phrenic axons and reach the phrenic cell bodies. Two methodological approaches of intrapleural CTB delivery are compared: transdiaphragmatic versus transthoracic injections. Both approaches are successful and result in similar number of CTB-labeled phrenic motor neurons. In conclusion, these techniques can be applied to visualize or quantify the phrenic motor neurons in various experimental studies such as those focused on the diaphragm-phrenic circuitry.

Here, we describe a protocol for identifying phrenic motor neurons in mice after intrapleural delivery of fluorophore conjugated cholera toxin subunit beta. Two techniques are compared to inject the pleural cavity: transdiaphragmatic versus transthoracic approaches.

Seguimiento Neuroanatomical retrógrada frénico de neuronas de Motor en ratones

Phrenic motor neurons are cervical motor neurons originating from C3 to C6 levels in most mammalian species. Axonal projections converge into phrenic ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

Conversión de células madre pluripotentes inducidas por humanos (IPSC) en neuronas motoras craneales y espinales funcionales usando vectores PiggyBac

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Non-Invasive Modulation and Robotic Mapping of Motor Cortex in the Developing Brain

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries unique challenges in children. Similarly, transcranial direct current stimulation (tDCS) can improve motor learning in adults but has only recently been applied to children. The use of tDCS and emerging techniques like high&#8211;definition tDCS (HD-tDCS) require special methodological considerations in the developing brain. Robotic TMS motor mapping may confer unique advantages for mapping, particularly in the developing brain. Here, we aim to provide a practical, standardized approach for two integrated methods capable of simultaneously exploring motor cortex modulation and motor maps in children. First, we describe a protocol for robotic TMS motor mapping. Individualized, MRI-navigated 12x12 grids centered on the motor cortex guide a robot to administer single-pulse TMS. Mean motor evoked potential (MEP) amplitudes per grid point are used to generate 3D motor maps of individual hand muscles with outcomes including map area, volume, and center of gravity. Tools to measure safety and tolerability of both methods are also included. Second, we describe the application of both tDCS and HD-tDCS to modulate the motor cortex and motor learning. An experimental training paradigm and sample results are described. These methods will advance the application of non-invasive brain stimulation in children.

We demonstrate protocols for the modulation (tDCS, HD-tDCS) and mapping (robotic TMS) of the motor cortex in children.

Modulación no invasiva y mapeo robótico de la corteza motora en el cerebro en desarrollo

Mapping the motor cortex with transcranial magnetic stimulation (TMS) has potential to interrogate motor cortex physiology and plasticity but carries ...

3D Kinematic Analysis for the Functional Evaluation in the Rat Model of Sciatic Nerve Crush Injury

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of sciatic nerve injury rodent models. In this protocol, we describe a novel kinematic analysis method that uses a three-dimensional (3D) motion capture apparatus for functional evaluations using a rat sciatic nerve crush injury model. First, the rat is familiarized with treadmill walking. Markers are then attached to the designated bone landmarks and the rat is made to walk on the treadmill at the desired speed. Meanwhile, the posterior limb movements of the rat are recorded using four cameras. Depending on the software used, marker tracings are created using both automatic and manual modes and the desired data are produced after subtle adjustments. This method of kinematic analysis, which uses a 3D motion capture apparatus, offers numerous advantages, including superior precision and accuracy. Many more parameters can be investigated during the comprehensive functional evaluations. This method has several shortcomings that require consideration: The system is expensive, can be complicated to operate, and may produce data deviations due to skin shifting. Nevertheless, kinematic analysis using a 3D motion capture apparatus is useful for performing functional anterior and posterior limb evaluations. In the future, this method may become increasingly useful for generating accurate assessments of various traumas and diseases.

We introduce a kinematic analysis method that uses a three-dimensional motion capture apparatus containing four cameras and data processing software for performing functional evaluations during fundamental research involving rodent models.

Análisis cinemático 3D para la evaluación funcional en el modelo de rata de lesión de aplastamiento de nervios ciáticos

Compared to the Sciatic Functional Index (SFI), kinematic analysis is a more reliable and sensitive method for performing functional evaluations of ...

Three-Dimensional Motor Nerve Organoid Generation

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and neurodegenerative diseases. Although numerous studies of axons have been conducted, our understanding of formation and dysfunction of axon fascicles is still limited due to the lack of robust three-dimensional in vitro models. Here, we describe a step-by-step protocol for the rapid generation of a motor nerve organoid (MNO) from human induced pluripotent stem (iPS) cells in a microfluidic-based tissue culture chip. First, fabrication of chips used for the method is described. From human iPS cells, a motor neuron spheroid (MNS) is formed. Next, the differentiated MNS is transferred into the chip. Thereafter, axons spontaneously grow out of the spheroid and assemble into a fascicle within a microchannel equipped in the chip, which generates an MNO tissue carrying a bundle of axons extended from the spheroid. For the downstream analysis, MNOs can be taken out of the chip to be fixed for morphological analyses or dissected for biochemical analyses, as well as calcium imaging and multi-electrode array recordings. MNOs generated with this protocol can facilitate drug testing and screening and can contribute to understanding of mechanisms underlying development and diseases of axon fascicles.

This protocol provides a comprehensive procedure to fabricate human iPS cell-derived motor nerve organoid through spontaneous assembly of a robust bundle of axons extended from a spheroid in a tissue culture chip.

Generación de organoides nerviosos motores tridimensionales

A fascicle of axons is one of the major structural motifs observed in the nervous system. Disruption of axon fascicles could cause developmental and ...