Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación y Desarrollo para la Sociedad de la Fundación Nacional de Investigación (NRF), financiado por el Ministerio de Ciencia, TIC y planificación de futuro (Grant No. 2013M3C8A1075908).

1. Extracción de ADN de líneas celulares FFPE norma de referencia Nota: Para este procedimiento, la extracción de ADN se realizó a partir de líneas celulares FFPE estándar de referencia (HD598, HD593, HD617, HD273 y de tipo salvaje (WT)) con el kit de aislamiento de ADN de tejidos FFPE como se describe en el protocolo a continuación. Extracción de ADN automatizada se logró siguiendo las instrucciones del fabricante para el aislamiento de ADN total. <ol><li> Usando un microtomo y el bloque de FFPE original, preparar manualmente secciones frescas antes de la extracción y el análisis de ADN, de acuerdo con los procedimientos establecidos. Asegúrese de que la muestra de entrada para la sección (s) tejido analizado no exceda un espesor total combinado de 10 micras y que el área superficial no excede de 600 mm 2 para una sola sección. </li></ol> 1.2 protocolo de TPS Nota: Los volúmenes mostrados en la Tabla 1 corresponden al mínimo requerido para procesar 48 muestras, y el procedimiento demostrado es de conformidad con las directrices de TPS. Antes de iniciar el experimento asentarse las muestras FFPE en la dirección de tubo por centrifugación a 600 xg, para evitar la pérdida de las muestras durante el programa automatizado. <ol><li> Encienda el instrumento de aislamiento de ADN automático y el ordenador. Abra el software de control de ejecución e inserte una bandeja de carga automática en el área de la cubierta de carga TPS. </li><li> Dispensar reactivos en sus correspondientes canales como se muestra en la Figura 1. <ol><li> Colocar las 4 muestras (BRAF WT, BRAF V600E 50%, 5% y 1%) en los bastidores de soporte de la muestra. </li><li> Coloque las cajas de propina en los valles en las columnas 2 y 3 y comprobar los consejos para la presencia de más de un filtro por la punta, lo que abortar la ejecución. </li><li> Asegurar una mezcla adecuada del tampón de lisis y tampón de lavado mediante la inversión de ellos 3-5 veces y cargarlos en las respectivas depresiones en la columna 4 (Figura 1). </li><li> Después de invertir para el par de veces o vort leveexing, cargue el tampón de elución, perlas magnéticas, y tampón FFPE en las canaletas en la columna 5, dejando 1 ranura vacía que se indique (Figura 1, Tabla 1). </li><li> Cargue una placa de pozo profundo 2 ml (DWP) sobre la placa de soporte (Figura 1). </li></ol></li><li> Lleve a cabo los siguientes pasos finales antes de iniciar una carrera: <ol><li> Destape todos los tubos y valles de reactivos. Confirme que suficiente capacidad disponible en la botella de residuos líquidos. Confirme que la botella de residuos sólidos está vacía y forrado con una bolsa de riesgo biológico. Confirme que la placa de expulsión de punta se centra en la asamblea de residuos. </li><li> Cierre la cubierta frontal. </li></ol></li><li> Inicie el software. Abra el archivo NA_Prep_Main_MLSTARlet.med. </li><li> Haga clic en &quot;Start&quot;. El estado del instrumento cambiará desde el ralentí hasta correr. </li><li> Introduce el número de muestras para esta ejecución. Elegir el método deseado para esta ejecución (ADN = 0). Introduzca la posición de la primera alta volume punta, la selección de &quot;1&quot; si todas las bandejas están llenas. Introduzca la posición del primer consejo de volumen estándar, la selección de &quot;1&quot; si todas las bandejas están llenas. Nota: El instrumento se ejecutará a través de pasos automatizados sin intervención del usuario. Un flujo de trabajo detallado se muestra en la Figura 2. Una vez que se terminó el experimento, los residuos de reactivos y consejos se inyectan en el conjunto de residuos. </li><li> Cuantificar el ADN genómico purificado mediante el uso de un método fluorométrico. Nota: las muestras de ADN que contienen una concentración mínima de 3,3 ng / l se someten a análisis ddPCR (sección 2). </li></ol> 2. ADN Mutación Profiling: Protocolo ddPCR Nota: El protocolo para el perfilado mutación del ADN consta de 3 pasos principales: 1) la generación de gotas, 2) amplificación por PCR convencional, 3) la lectura de la gotita y 4) de perfiles de mutación del ADN. 2.1. Generación Gotita Nota: ddPCR supermix esrecomendado para ddPCR, ya que esta mezcla contiene los reactivos necesarios para la generación de gotitas. <ol><li> Para evitar la contaminación, siga las precauciones estándar, tales como el uso de guantes, con una capucha limpia PCR, pipetas limpias, y los tubos de unión de baja en proteínas. </li><li> Asegúrese de que la concentración mínima de muestra de ADN genómico humano es de 3,3 ng / l. Nota: La cantidad de concentración de la muestra de ADN purificado variará basado en el análisis de detección de frecuencia% mutación. </li><li> Montar mezclas de reacción de PCR en placas de 96 pocillos. Descongelar y equilibrar los componentes de la reacción a RT. Preparar las reacciones de PCR mediante la combinación de 2X ddPCR Supermix (10 l) y 20 cebadores (directo e inverso, 900 nM) y la sonda (250 nM) con cada muestra de ADN purificado (66ng / 2 l) hacer hasta 20 l con agua destilada (como se por el protocolo generador de gotitas) </li><li> Vórtex con la mezcla a fondo para asegurar la homogeneidad y centrifugar brevemente para recoger el contenido en la parte inferior del tubo antes de la dispensación. Cargar 20 &amp; #181; l en el cartucho para la formación de gotas. </li><li> El funcionamiento del generador de gotas, según el protocolo recomendado por el fabricante <ol><li> Insertar el cartucho en el soporte con la muesca en el cartucho situado en el lado superior izquierdo del soporte. Añadir 20 l de mezcla de reacción que contiene muestras en el medio, y 70 l de aceite de generador en los pocillos de fondo. </li><li> Coloque la junta en la parte superior del cartucho. Asegúrese de que la junta esté firmemente enganchado en ambos extremos del titular; de lo contrario, no se logrará una presión suficiente para la generación de gotitas. </li><li> Abra el generador de gotas pulsando el botón verde en la parte superior del instrumento e inserte el cartucho. Cuando el soporte está en la posición correcta, tanto el poder (de izquierda a la derecha) y el soporte (centro derecha) luces indicadoras son de color verde. </li><li> Presione el botón superior en el instrumento de nuevo para cerrar la puerta e iniciar la generación de gotas. Nota: Después de pulsar el button, a sí mismo múltiples posiciones en los pozos de salida, dibujo petróleo y las muestras a través de los canales de microfluidos, donde se crean gotas. Las gotas fluyan hacia la gota así, donde se acumulan. La luz indicadora de gota (a la derecha) parpadea en verde después de 10 segundos para indicar que la generación de gotas está en curso. </li><li> Cuando la generación de gotas es completa, los 3 indicadores luminosos cambian de color verde; abrir la puerta pulsando el botón y retire el soporte de la unidad. Retire la junta desechable del soporte y descartarlo. Nota: Los pocillos superiores del cartucho contienen gotitas, y los pocillos medio e inferior son casi vacío, con una pequeña cantidad de aceite residual. </li></ol></li></ol> 2.2. Preparación para la PCR <ol><li> Para cada muestra, pipetear a cabo 40 l de los contenidos de gotitas desde la parte superior así los cartuchos en un solo pocillo de una placa de 96 pocillos PCR recomendadas tal como se indica en el protocolo del fabricante del instrumento. Sinte: Con una pipeta multicanal es ideal para la transferencia de las emulsiones de gotitas. Se recomienda la aspiración lenta y suave de gotas para minimizar esquila de gota durante los traslados. </li><li> Selle la placa de PCR con papel inmediatamente después de la transferencia de las gotas para evitar la evaporación. Utilice sellos de placa lámina perforables que son compatibles con el sellador de placas PCR y las agujas en el lector de gotas. Siga las instrucciones del manual de instrucciones sellador de placas PCR. </li><li> Ajuste la temperatura de la placa selladora a 180 ° C y el tiempo de 5 seg. </li><li> Toque la flecha para abrir la puerta de la bandeja. Coloque el bloque de soporte en la bandeja con la cara de 96 pocillos para arriba. Coloque la placa de 96 pozos en el bloque de ayuda y asegurarse de que todos los pocillos de la placa están alineados con el bloque de soporte. </li><li> Cubra la placa de 96 pocillos con 1 hoja de papel de aluminio sellado perforable. Una vez que la placa de 96 pocillos se fija en el bloque de soporte y se cubre con el sello de aluminio que se puede perforar, toque el botón del sello. La bandeja se cerraráy termosellado iniciará. </li><li> Cuando termosellado es completa, la puerta se abre de forma automática; retire la placa del bloque de calor de ciclos térmicos y luego retire el bloque de calor. </li><li> Asegúrese de que todos los pozos de la placa están sellados comprobando que las depresiones en la lámina son evidentes sobre cada pocillo. Una vez sellado, el plato está listo para el ciclo térmico. </li><li> Una vez que se eliminan las gotas, presione los pestillos en el soporte del cartucho para abrirla. Retire el cartucho vacío y deséchelo. </li><li> Realizar la amplificación por PCR convencional siguiendo los parámetros detallados en la Tabla 2. </li></ol> 2.3 la lectura de la gotita (según el protocolo recomendado por el fabricante) Nota: Después de la amplificación por PCR del ácido nucleico diana en las gotitas, el instrumento lector de gotita analiza cada gotita de forma individual utilizando un sistema de detección de 2 colores 13. Normalmente nos propusimos detectar un FAMfluoróforos reportero d VIC. <ol><li> Haga clic en &quot;sistema Flush&quot; para cebar el lector de gota y que quede listo para el análisis ddPCR. </li><li> Cargue la placa en el lector de la gotita y haga clic en &quot;start&quot;. El lector gotita aspira cada muestra, singulariza las gotas, y los arroyos en fila junto a un detector de 2 colores. El detector lee las gotitas para enumerar muestras positivas y negativas. </li><li> Cuando la lectura de gota, abra la puerta y retire el soporte de la placa de la unidad. Retire la placa de PCR de 96 pocillos del soporte y descartarlo. </li><li> Para el mantenimiento adecuado, reemplace el aceite lector de gota y vaciar el recipiente de residuos, según sea necesario. Añadir 50 ml de 10% de lejía a la botella de residuos para prevenir el crecimiento microbiano. </li></ol> 2.4 ADN perfiles mutación (según el protocolo recomendado por el fabricante) Nota: Las gotas de PCR-positivos y PCR-negativos se cuentan para proporcionar quantific absolutaación de las mutaciones del ADN diana BRAF V600E en forma digital, utilizando el software de análisis de datos. <ol><li> Haga clic en Configuración para introducir información sobre las muestras, ensayos y experimentos. </li><li> En la ventana de configuración, cargue una placa (filename.qlp), a continuación, haga clic en Analizar para abrir y analizar los datos. La interfaz de análisis de datos se divide en tres ventanas: Resultados de mesa, Selector Bueno y Procesado de Datos / pantalla gráfica. </li><li> En la ventana de datos procesados, los datos de concentración para cada objetivo aparecen en los pozos en el mapa plato y se tabulan en la Tabla de Resultados. Haga clic Concentración de visualizar datos en parcelas de concentración. </li></ol>

<ol>
	<li>Vogelstein, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+alterations+during+colorectal-tumor+development.">Genetic alterations during colorectal-tumor development.</a> The New England journal of medicine. 319, 525-532 (1988).</li><li>Davies, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+BRAF+gene+in+human+cancer.">Mutations of the BRAF gene in human cancer.</a> Nature. 417, 949-954 (2002).</li><li>Solit, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+mutation+predicts+sensitivity+to+MEK+inhibition.">BRAF mutation predicts sensitivity to MEK inhibition.</a> Nature. 439, 358-362 (2006).</li><li>Wong, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+developments+in+anti-cancer+agents+targeting+the+Ras/Raf/+MEK/ERK+pathway.">Recent developments in anti-cancer agents targeting the Ras/Raf/ MEK/ERK pathway.</a> Recent patents on anti-cancer drug discovery. 4, 28-35 (2009).</li><li>Brose, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+and+RAS+mutations+in+human+lung+cancer+and+melanoma.">BRAF and RAS mutations in human lung cancer and melanoma.</a> Cancer research. 62, 6997-7000 (2002).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRAF+mutations+in+colon+cancer+are+not+likely+attributable+to+defective+DNA+mismatch+repair.">BRAF mutations in colon cancer are not likely attributable to defective DNA mismatch repair.</a> Cancer research. 63, 5209-5212 (2003).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Droplet+Digital+PCR+System+for+Absolute+Quantitation+of+DNA+Copy+Number.">High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number.</a> Anal Chem. 83, 8604-8610 (1021).</li><li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+Droplet+Digital+Polymerase+Chain+Reaction+Format+for+DNA+Copy+Number+Quantification.">Evaluation of a Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Format for DNA Copy Number Quantification.</a> Anal Chem. 84, 1003-1011 (1021).</li><li>Jones, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+copy+target+detection+by+Droplet+Digital+PCR+through+application+of+a+novel+open+access+bioinformatic+pipeline,+'definetherain'.">Low copy target detection by Droplet Digital PCR through application of a novel open access bioinformatic pipeline, 'definetherain'.</a> Journal of virological methods. 202, 46-53 (2014).</li><li>Strain, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+precise+measurement+of+HIV+DNA+by+droplet+digital+PCR.">Highly precise measurement of HIV DNA by droplet digital PCR.</a> PloS one. 8, e55943 (2013).</li><li>Miotke, L., Lau, B. T., Rumma, R. T., Ji, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+sensitivity+detection+and+quantitation+of+DNA+copy+number+and+single+nucleotide+variants+with+single+color+droplet+digital+PCR.">High sensitivity detection and quantitation of DNA copy number and single nucleotide variants with single color droplet digital PCR.</a> Anal Chem. 86, 2618-2624 (2014).</li><li>Bizouarn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+applications+using+digital+PCR.">Clinical applications using digital PCR.</a> Methods in molecular biology. 1160, 189-214 (2014).</li><li>McDermott, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+target+detection+using+DNA-binding+dye+chemistry+in+droplet+digital+PCR.">Multiplexed target detection using DNA-binding dye chemistry in droplet digital PCR.</a> Anal Chem. 85, 11619-11627 (2013).</li><li>Milbury, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+lower+limits+of+detection+of+digital+PCR+assays+for+cancer-related+gene+mutations.">Determining lower limits of detection of digital PCR assays for cancer-related gene mutations.</a> Biomolecular detection and quantification. 1, 8-22 (2014).</li><li>Zhu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+Sensitive+Droplet+Digital+PCR+Method+for+Detection+of+EGFR+Activating+Mutations+in+Plasma+Cell-Free+DNA+from+Patients+with+Advanced+Non-Small+Cell+Lung+Cancer.">Highly Sensitive Droplet Digital PCR Method for Detection of EGFR Activating Mutations in Plasma Cell-Free DNA from Patients with Advanced Non-Small Cell Lung Cancer.</a> The Journal of molecular diagnostics: JMD. , (2015).</li><li>Fan, H., Gulley, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+extraction+from+paraffin-embedded+tissues.">DNA extraction from paraffin-embedded tissues.</a> Methods in molecular medicine. 49, 1-4 (2001).</li><li>Nadauld, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+Sensitive+Detection+of+Cancer+Genome+Amplifications+from+Formalin+Fixed+Paraffin+Embedded+Tumors+with+Droplet+Digital+PCR.">Quantitative and Sensitive Detection of Cancer Genome Amplifications from Formalin Fixed Paraffin Embedded Tumors with Droplet Digital PCR.</a> Translational medicine. 2, (2012).</li></ol>

Myung Ryuri Oh, Si Eun Kim, y Young Deug Kim son empleados de ABION CRO.

En este sentido, destacamos la aplicabilidad de ddPCR y el aislamiento de ADN a partir de muestras de líneas celulares estándar FFPE de referencia para una evaluación específica de mutación genética. En este estudio, se utiliza TPS método de aislamiento de ADN automatizado que se puede adaptar fácilmente y automatizado, y tiene capacidad para un máximo de 48 muestras diferentes de forma simultánea, lo que permite más grandes experimentos a escala y una menor variabilidad. Una de las limitaciones del aislamien...

La acumulación de mutaciones genéticas en genes reguladores clave altera la programación normal de las células como la proliferación celular, la diferenciación y la supervivencia, que conduce al cáncer 1. La vía RAS-RAF quinasa MAP media las respuestas celulares a las señales de crecimiento. Mutaciones oncogénicas BRAF pueden resultar de mutaciones del conductor en el gen BRAF, que pueden causar la BRAF oncoproteína para convertirse hiperactiva 2. Las mutaciones en el gen BRAF también dan lugar a la señalización aguas abajo hiperactiva MEK y ERK 3, que, a su vez, conduce a un crecimiento celular excesivo y la proliferación independiente de factor de crecimiento mediada por la regulación 4-6. Varias herramientas están disponibles para perfilar mutación del ADN, como en tiempo real mutaciones BRAF V600E cuantitativos en fijado en formol, embebidos en parafina (FFPE) referencia las líneas celulares estándar por ddPCR. ddPCR es un método basado en la PCR para la cuantificación absoluta-ofreciendo una mayor precisión en comparación con el tiempo real convencional de PCR cuantitativa (qPCR) 7,8. ddPCR también proporciona mayor poder de resolución y la precisión para la detección de mutaciones raras en plantillas de ADN, lo que permite la investigación del cáncer más informativo y diagnóstico 9. Las ventajas adicionales de ddPCR sobre qPCR convencional incluyen su mayor sensibilidad y precisión cuando se estudia el número de copias bajo plantilla 10-12. En este documento, un protocolo para la extracción automática de ADN de referencia FFPE líneas celulares estándar, seguido por la determinación de la presencia o ausencia de mutaciones BRAF V600E por ddPCR se demuestra. También se describen el uso de software para el análisis de datos y una representación gráfica de los resultados. Todo el procedimiento es relativamente simple y totalmente depende del número de muestras que se perfilados y el número de máquinas de PCR y ddPCR convencionales disponibles. El siguiente protocolo describe los procedimientos estándar para BR<html> FFPE de referencia líneas celulares estándar AF V600E-positivos (HD598, HD593, HD617, HD273 y de tipo salvaje (WT)) se realiza en un instrumento totalmente automatizado usando el protocolo Tissue Sistema de Preparación de (TPS). Posteriormente, se analizaron muestras de ADN aisladas de la presencia de mutaciones BRAF V600E utilizando sistema ddPCR. Análisis de la mutación se realiza después se han perfilado todas las muestras y los datos se ha cargado en el software de análisis de datos. Dependiendo del número de muestras / grupos estudiados, análisis de datos puede requerir de una a varias horas. El componente experimental de la metodología requiere precisión en la manipulación de <a href="http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast" title="Aislamiento de ácidos nucleicos a partir de levadura, un video Educación JoVe Ciencia explicar más acerca sobre el contexto de ARN">ADN</a> yrológicos Pipetas y pipetas, un video JoVe Educación Ciencia explicar más acerca sobre el contexto de pipeteo &quot;&gt; pipeteo en placas de 96 pocillos, mientras que el análisis de datos se realiza mediante software.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Hamilton MICROLAB STARlet IVD instrument</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>10701001</td>
			<td>Automated DNA isolation instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Generator&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>772BR1119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>771BR1497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Conventional PCR machine capable of ramp-time adjustment</td>
			<td></td>
			<td>621BR17718</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR plate sealer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>770BR1575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA isolation kit&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1&#160;</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>10632398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VERSANT Tissue Preparation Reagents Box 1&#160;</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>10632399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO-RE tips</td>
			<td>Siemens</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR mutation analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR186-3010</td>
			<td>2X concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG8 cartridge&#160;</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR186-4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet Generator oil</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR-186-3005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gasket</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR186-3006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Droplet reader oil</td>
			<td>Bio-Rad&#160;</td>
			<td>BR-186-3004</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

employing digital droplet pcr to detect braf v600e mutations in formalin-fixed paraffin-embedded reference standard cell lines

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is partitioned into ~20,000 nano-sized, water-in-oil droplets, and PCR amplification occurs in individual droplets. The ddPCR approach is in identifying sequence mutations, copy number alterations, and select structural rearrangements involving targeted genes. Here, we demonstrate the use of ddPCR as a powerful technique for precisely quantitating rare BRAF V600E mutations in FFPE reference standard cell lines, which is helpful in identifying individuals with cancer. In conclusion, ddPCR technique offers the potential to precisely profile the specific rare mutations in different genes in various types of FFPE samples.

Para nuestro análisis ddPCR, estudiamos las de referencia FFPE mutación líneas celulares estándar BRAF V600E. El lector de gota se conecta a un software de análisis de datos portátil ordenador en funcionamiento. Cada gotita individual se define sobre la base de la amplitud fluorescente como positivo o negativo. El software proporcionado por el fabricante también permite un punto de corte definido por el usuario a introducir para definir el umbral entre las gotitas positivos y negativos. El número de got...

Watch this Scientific Journal Video about Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines at JoVE.com

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

El objetivo de este video es demostrar cómo llevar a cabo la extracción de ADN automatizado de parafina embebido (FFPE) referencia las líneas celulares estándar fijado en formol y gotita digital de PCR (ddPCR) análisis para detectar mutaciones raras en un entorno clínico. La detección de mutaciones en muestras de FFPE demuestra la utilidad clínica de ddPCR en muestras FFPE.

El empleo de la gotita de PCR digital para detectar mutaciones BRAF V600E en embebidos en parafina líneas celulares de referencia estándar fijos-formalina

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

employing-digital-droplet-pcr-to-detect-braf-v600e-mutations-formalin

Research

JoVE Journal

Biology

13.1K vistas.  Seoul National University.  El objetivo de este video es demostrar cómo llevar a cabo la extracción de ADN automatizado de parafina embebido (FFPE) referencia las líneas celulares estándar fijado en formol y gotita digital de PCR (ddPCR) análisis para detectar mutaciones raras en un entorno clínico. La detección de mutaciones en muestras de FFPE demuestra la utilidad clínica de ddPCR en muestras FFPE. 

Video: Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Las secciones incluidas en parafina y congeladas de Drosophila Los músculos de Adultos

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Investigación

Biología

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

Extracción de ADN a partir de material incluido en parafina para análisis genéticos y epigenéticos

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Proteomic Sample Preparation from Formalin Fixed and Paraffin Embedded Tissue

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale quantitative analysis of formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissue. The procedure comprises four distinct steps. The first one is the preparation of sections from the FFPE material and microdissection of cells of interest. In the second step the isolated cells are lysed and processed using 'filter aided sample preparation' (FASP) technique. In this step, proteins are depleted from reagents used for the sample lysis and are digested in two-steps using endoproteinase LysC and trypsin. 
After each digestion, the peptides are collected in separate fractions and their content is determined using a highly sensitive fluorescence measurement. Finally, the peptides are fractionated on 'pipette-tip' microcolumns. The LysC-peptides are separated into 4 fractions whereas the tryptic peptides are separated into 2 fractions. In this way prepared samples allow analysis of proteomes from minute amounts of material to a depth of 10,000 proteins. Thus, the described workflow is a powerful technique for studying diseases in a system-wide-fashion as well as for identification of potential biomarkers and drug targets.

Archival formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) clinical samples are valuable material for investigation of diseases. Here we demonstrate a sample preparation workflow allowing in-depth proteomic analysis of microdissected FFPE tissue.

Proteómica Preparación de muestras de formol fija y embebidos en parafina de tejidos

Preserved clinical material is a unique source for proteomic investigation of human disorders. Here we describe an optimized protocol allowing large scale ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

MicroRNA<em&gt; In situ</em&gt; La hibridación de los tejidos del riñón y fijados con formalina

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

Perfiles de Células Madre Embrionarias Humanas individual por RT-PCR cuantitativa

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

qPCR Is a Sensitive and Rapid Method for Detection of Cytomegaloviral DNA in Formalin-fixed, Paraffin-embedded Biopsy Tissue

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for developing severe infection. Many laboratory methods for the detection of CMV infection have been developed, including serology, viral culture, and molecular methods. Often, these methods reflect systemic involvement with CMV and do not specifically identify local tissue involvement. Therefore, detection of CMV infection in the GI tract is frequently done by traditional histology of biopsy tissue. Hematoxylin and eosin (H&#38;E) staining in conjunction with immunohistochemistry (IHC) have remained the mainstays of examining these biopsies. H&#38;E and IHC sometimes result in atypical (equivocal) staining patterns, making interpretation difficult. It was shown that quantitative polymerase chain reaction (qPCR) for CMV can successfully be performed on formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) biopsy tissue for very high sensitivity and specificity. The goal of this protocol is to demonstrate how to perform qPCR testing for the detection of CMV in FFPE biopsy tissue in a clinical laboratory setting. This method is likely to be of great benefit for patients in cases of equivocal staining for CMV in GI biopsies.

This protocol describes qPCR detection of cytomegalovirus in formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy tissue, which is rapid, sensitive, specific, and useful for interpreting equivocal hematoxylin and eosin or immunohistochemical staining patterns.

qPCR es un método sensible y rápido para la detección de ADN de citomegalovirus en fija en formol, biopsia de tejido embebido en parafina

It is crucial to identify cytomegalovirus (CMV) infection in the gastrointestinal (GI) tract of immunosuppressed patients, given their greater risk for ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

Preparación de núcleos de tejido incluidas en parafina fijadas con formalina para ambos RNA y DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

Célula activada por el magnético clasificación estrategias para aislar y purificar sinovial líquido mesenquimales células madre derivadas de un modelo de conejo

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Quantitative Immunoblotting of Cell Lines as a Standard to Validate Immunofluorescence for Quantifying Biomarker Proteins in Routine Tissue Samples

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An optimal method of quantification is accurate, has a broad linear dynamic range and maintains the structural integrity of the sample to allow for identification of individual cell types. Current methods such as immunohistochemistry (IHC), mass spectrometry, and immunoblotting each fail to meet these stipulations due to their categorical nature or need to homogenize the sample. As an alternative method, we propose the use of immunofluorescence (IF) and image analysis to determine the relative abundance of a protein of interest in FFPE tissues. Herein we demonstrate that this method is easily optimized, yields a wide dynamic range, and is linearly quantifiable as compared to the gold standard of quantitative immunoblotting. Furthermore, this method permits the maintenance of the structural integrity of the sample and allows for the distinction of various cell types, which may be crucial in diagnostic applications. Overall, this is a robust method for the relative quantification of proteins in FFPE samples and can be easily adapted to suit clinical or research needs.

We describe the use of quantitative immunoblotting to validate immunofluorescence histology coupled with image analysis as a means of quantifying a protein of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples. Our results demonstrate the utility of immunofluorescence histology for ascertaining the relative quantity of biomarker proteins in routine biopsy samples.

Immunoblotting cuantitativa de líneas celulares como un estándar para validar la inmunofluorescencia para cuantificar proteínas biomarcadoras en muestras de tejido de rutina

Quantification of proteins of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue samples is important in clinical and research applications. An ...

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) is the gold standard for SARS-CoV-2 diagnosis as no permanent solution is available. However effective this technique may be, research has emerged showing its limitations in detection and diagnosis especially when it comes to low abundant targets. In contrast, droplet digital PCR (ddPCR), a recent emerging technology with superior advantages over qPCR, has been shown to overcome the challenges of RT-qPCR in diagnosis of SARS-CoV-2 from low abundant target samples. Prospectively, in this article, the capabilities of RT-ddPCR are further expanded by showing steps on how to develop simplex, duplex, triplex probe mix, and quadruplex assays using a two-color detection system. Using primers and probes targeting specific sites of the SARS-CoV-2 genome (N, ORF1ab, RPP30, and RBD2), the development of these assays is shown to be possible. Additionally, step by step detailed protocols, notes, and suggestions on how to improve the assays workflow and analyze data are provided. Adapting this workflow in future works will ensure that the maximum number of targets can be sensitively detected in a small sample significantly improving on cost and sample throughput.

This work summarizes steps on developing different assays for SARS-CoV-2 detection using a two color ddPCR system. The steps are elaborate and notes have been included on how to improve the assays and experiment performance. These assays may be used for multiple SARS-CoV-2 RT-ddPCR applications.

Protocolos de PCR digital de gotas con transcripción inversa de dos pasos para la detección y cuantificación del SARS-CoV-2

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...