La señora Alster, el Sr. Honrath y el Dr. Jiang son apreciados por su excelente asistencia técnica. También aprecia es el Dr. Volz y el grupo de investigación del Dr. Dandri para proporcionar el acceso a su dispositivo digital PCR.

1. Preparación de la mezcla de cultivo que contiene las células tumorales y células no tumorales <ol><li> Utilizar las células tumorales de una línea celular establecida TMVNP S462 5. Usa los fibroblastos como las células no tumorales 6,7 </li><li> Cultura tanto células tumorales y fibroblastos en medio estándar DMEM con 10% de suero fetal bovino (BSA), glutamina 3 mM, 0,1 mM 2-mercaptoetanol, 500 U / ml de penicilina, 500 g / ml de estreptomicina y piruvato de sodio 1 mM a 37 ° C y 5% de CO 2 5-7. En sub-confluencia, cosechar las células con tripsina al 0,05% y contarlos utilizando un hemocitómetro. </li><li> Mezclar 400 células tumorales y 1.600 células no tumorales juntos en cada pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos en 0,2 ml de medio. Teniendo en cuenta el crecimiento más rápido de las células tumorales durante el periodo de tratamiento de 5 días, la proporción inicial de las células tumorales se fijó en 25%. Configurar 4 repeticiones para cada concentración de fármaco. Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO 2 O / N. </li></ol> 2. Drug Tratamiento <ol><li> Utilice nilotinib como el fármaco de prueba. Preparar soluciones madre de nilotinib 0, 2, 4 y 20 mM en DMSO. Diluir cada uno de ellos por 200 veces en 5 ml de medio DMEM, dando 2-plegado de drogas soluciones concentradas de 0, 10, 20 y 100 mM 6,7. </li><li> Retirar 0,1 ml de medio de cada pocillo y añadir 0,1 ml de medio que contiene fármaco. Las concentraciones finales son 0, 5, 10 y 50 mM. Continuar la incubación de las células en medio que contenía fármaco durante 5 días. </li><li> Al final del tratamiento, inspeccionar las células unidas utilizando un microscopio de contraste de fase y tomar fotos. Aspirar el medio de distancia, se lavan las células adhesivas sobrevivido una vez con 0,2 ml de PBS. </li></ol> 3. Preparación de ADN para PCR Digital <ol><li> Lisar las células utilizando HotShot 8. <ol><li> Añadir 50 l solución de lisis alcalina (NaOH 25 mM, EDTA 0,2 mM) a cada pocillo. Sellar los pozos con papel de aluminio. Incubar la placa a 95 ° C en un horno o en una placa de calentamiento durante 30 min. Compruebe debajo de un microscope para asegurarse de que no hay más células intactas permanecieron en la superficie de los pozos. En caso de que las células no se lisan por completo, aumentan el tiempo de calentamiento o añadir detergente. Congelarlos una vez a -20 ° C aumenta también romper las células. </li><li> Añadir 50 l de solución (40 mM Tris-HC, pH 4,0) a cada neutralizantes también. Transferir todos los lisados ​​en forma de U pocillos de una placa de PCR y se seca en un ciclador de PCR a 95 ° C durante 10 a 30 min. Reconstituir los lisados ​​con 20 l de agua destilada. </li></ol></li><li> Desalar mediante diálisis Drop-9 <ol><li> utilizar filtros de membrana con tamaño de poro promedio 0.025 micras. </li><li> Flotar el filtro en agua destilada con la parte brillante hacia arriba en pocillos de una placa de 12 pocillos. Mojar el filtro durante 5 minutos. Prestar atención para evitar burbujas de aire entre el filtro y el agua. </li><li> Pipetear los lisados ​​reconstituidas de cada muestra de la etapa 3.1.4 cuidadosamente sobre cada una de las 4 zonas de filtro. Cubrir la placa y se dializa durante 30 a 60 min. </li><li> Succionar el agua debajo del filtro, sin voltear sobre el filtro ni perturbar las gotas. </li><li> Transferir el lisado gotas en los pocillos de una nueva placa de PCR-. Secar las ADN-gotas por calentamiento a 95 ° C durante 10 a 30 min en un ciclador PCR. Reconstituir los lisados ​​en 10 l de agua. </li></ol></li></ol> 4. La PCR digital <ol><li> Descongele componentes tales como el ADN, tampón y la mezcla de ensayo a temperatura ambiente, dejen de girar durante 10 segundos a máxima fuerza centrífuga de cualquier disponible (por ejemplo, VWR minicentrifugadora) y luego mantenerlos en hielo. </li><li> Preparar la mezcla madre que contiene todos los componentes excepto el ADN (Tabla 1). Considere volumen muerto y calcular mezcla maestra aproximadamente un 10% más de la cantidad requerida. NOTA: Utilice los cebadores y sondas utilizadas en el kit comercial. </li><li> Vórtice la mezcla maestra, centrifugar durante 10 segundos a máxima fuerza centrífuga de cualquier disponible (por ejemplo, VWR minicentrifugadora) y prescindir de 15 l a cadapocillo de una placa de 96-PCR. Añadir todos lisado (que contiene ADN) de cada muestra a los pocillos que contienen la mezcla principal. Transferencia de 20 l de cada mezcla de reacción en un pozo en el lado de la muestra de un cartucho a TA. </li><li> Prescindir de 70 l de aceite de generador de gotas en cada pocillo de aceite en el lado de un cartucho. Cierre el cartucho con la junta y colocar toda la configuración en un generador de gotas. Iniciar la generación de gotitas. </li><li> Transferencia de 40 l de gota solución en pocillos de una placa de PCR de 96 pocillos. Sellar la placa con papel de aluminio y colocar la placa en un termociclador de PCR. Establecer la tapa-temperatura a 105 ° C y velocidad de rampa a 2 ° C / seg. Llevar a cabo la PCR utilizando los ajustes en la Tabla 2. Después de la PCR, la transferencia de la placa en un lector de gota y empieza a leer. Alternativamente, la placa de almacenar a 4 ° C durante un máximo de 24 horas. </li></ol> 5. El cálculo de la proporción de células tumorales <ol><li> Cargar los datos de PCR digital y realizar analys automáticoses. </li><li> Control de los resultados de cada ensayo de forma manual mediante la inspección de la distribución unidimensional y 2-dimensional de las gotitas de positivos y negativos, y asegurarse de que están bien separados y las líneas de umbral estaban en las posiciones correctas. Excluir resultados no satisfacen los criterios, por ejemplo, hay una clara separación de las gotitas positivos y negativos, de los nuevos análisis. Copiar la relación NF1 / RPP30 resultante en una hoja de Excel. </li><li> Calcular la proporción de células tumorales como: 2 x (1- NF1 / RPP30). </li></ol> Cambio 6. dependiente de la dosis de la proporción de células tumorales <ol><li> Para cada fármaco-concentración, calcular la media y la desviación estándar de las 4 repeticiones. Trazar los medios y las desviaciones estándar contra el dopaje concentraciones. </li></ol>

<ol>
	<li>Caponigro, G., Sellers, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+preclinical+testing+of+cancer+therapeutic+hypotheses.">Advances in the preclinical testing of cancer therapeutic hypotheses.</a> Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 179-187 (2011).</li><li>McMillin, D. W., Negri, J. M., Mitsiades, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+tumour-stromal+interactions+in+modifying+drug+response:+challenges+and+opportunities.">The role of tumour-stromal interactions in modifying drug response: challenges and opportunities.</a> Nat Rev Drug Discov. 12 (3), 217-228 (2013).</li><li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development.">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer Res. 74 (9), 2377-2384 (2014).</li><li>Edwards, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+target+validation+using+patient-derived+cells.">Preclinical target validation using patient-derived cells.</a> Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 149-150 (2015).</li><li>Frahm, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+phenotypic+characterization+of+tumor+cells+derived+from+malignant+peripheral+nerve+sheath+tumors+of+neurofibromatosis+type+1+patients.">Genetic and phenotypic characterization of tumor cells derived from malignant peripheral nerve sheath tumors of neurofibromatosis type 1 patients.</a> Neurobiol Dis. 16 (1), 85-91 (2004).</li><li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+selectivity+of+nilotinib+on+NF1-associated+tumors+in+vitro.">Efficacy and selectivity of nilotinib on NF1-associated tumors in vitro.</a> J Neurooncol. 116 (2), 231-236 (2014).</li><li>Jiang, W., Mautner, V. F., Friedrich, R. E., Kluwe, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+assessment+of+the+anticancer+drug+response+of+plexiform+neurofibroma+tissue+using+primary+cultures.">Preclinical assessment of the anticancer drug response of plexiform neurofibroma tissue using primary cultures.</a> J Clin Neurol. 11 (2), 172-177 (2015).</li><li>Montero-Pau, J., Gomez, A., Munoz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+an+inexpensive+and+high-throughput+genomic+DNA+extraction+method+for+the+molecular+ecology+of+zooplanktonic+diapausing+eggs.">Application of an inexpensive and high-throughput genomic DNA extraction method for the molecular ecology of zooplanktonic diapausing eggs.</a> Limnology and Oceanography-Methods. 6, 218-222 (2008).</li><li>Saraswat, M., Grand, R. S., Patrick, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desalting+DNA+by+drop+dialysis+increases+library+size+upon+transformation.">Desalting DNA by drop dialysis increases library size upon transformation.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 77 (2), 402-404 (2013).</li><li>Iglesias-Bartolome, R., Martin, D., Gutkind, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+the+head+and+neck+cancer+oncogenome:+widespread+PI3K-mTOR+pathway+alterations+and+novel+molecular+targets.">Exploiting the head and neck cancer oncogenome: widespread PI3K-mTOR pathway alterations and novel molecular targets.</a> Cancer Discov. 3, 722-725 (2013).</li></ol>

The procedure is patent-protected (10 2013 221 452, Germany)

El paso clave en esta herramienta genético-y basado en células para la evaluación de especificidad fármaco in vitro es la determinación de la proporción de las células tumorales utilizando una o más características genéticas específicas de tumor. En contraste con características fenotípicas convencionales 7, las características genéticas son específicos, estable y fácil de cuantificar. Por ejemplo, una variación mutación o el número de copias específico de tumor está presente exclusivamente en las células tumorales pero no en células no tumorales. un estigma genético de este tipo puede ser fiable y precisa cuantificada, por ejemplo, usando PCR digital como se demuestra en este estudio. Para la PCR digital, de alta pureza de ADN no es esencial. Sin embargo, la desalinización y la eliminación de moléculas inhibidoras son necesarios que se puede lograr por una caída de la diálisis usando un filtro adecuado. La lisis y la caída de la diálisis combinado es simple y rápido, no requiere instrumentos especiales y por lo tanto puede llevarse a cabo en cualquier laboratorio estándar. Si las células no break bien, el tratamiento adicional puede ser considerada como la congelación de las células a -20 ° C, la adición de detergente o / y el uso de la proteasa. En el presente estudio, se utilizó la deleción heterocigota del gen NF1 como la característica específica de tumor para la cuantificación. Del mismo modo, las deleciones de otros genes o loci también se pueden utilizar. Además, las mutaciones también se pueden utilizar para la cuantificación de células tumorales. En tal caso, los ensayos de PCR digitales para el mutante y los alelos normales necesitan ser ampliamente validado para asegurar su especificidad para cada uno de ellos. proporción dependiente de la dosis de las células tumorales proporciona una indicación para el fármaco-especificidad o selectividad. Además, también permite la extracción de la respuesta de las células tumorales a partir de la respuesta del total de células de un cultivo mixto a un fármaco (figura 4). Esta estrategia de extracción proporciona una solución para el problema técnico en el uso de cultivos primarios (que contiene tanto tumor y nocélulas n-tumor) para pruebas de drogas. El genético-y basados ​​en células in vitro herramienta demostrado en el presente estudio, por tanto, pueden tener un potencial de aplicación (1) en el descubrimiento de medicamentos donde proporciona una plataforma para evaluar la especificidad o selectividad de drogas in vitro y (2) en la atención personalizada del cáncer donde permite a los fármacos de ensayo en cultivos primarios y por lo tanto pueden contribuir a la selección de drogas en la quimioterapia adyuvante 4. Por otra parte, el mecanismo farmacológico de un medicamento puede ser estudiada usando esta herramienta, ya que cierta alteración genética o alteraciones genéticas múltiples pueden ser seguidos durante el tratamiento con fármaco. Una dificultad en el uso de cultivos primarios individualizadas es la falta una característica genético universal para la cuantificación de las células tumorales. Sin embargo, con el avance de hoy en la secuenciación de todo el genoma, los genes y las regiones más frecuentemente alterados son conocidos por tumores comunes. Por ejemplo, entre la cabeza y el cuellotumores, 71%, 23% y 22% tienen mutaciones en el gen TP53, FAT1 y genes CDKN2A, y el 60%, 34% y 26% tienen deleciones en las regiones de genes de CDKN2A, STK11 y PTEN, respectivamente 10. Screening 5 a 10 tales genes o / y regiones por medio de la secuenciación dirigida y / o PCR digital tanto, es probable identificar una o más alteraciones genéticas que se pueden usar para la cuantificación de células tumorales en el cultivo primario derivada. Otra limitación es la cantidad a menudo insuficiente de tumores resecados para el establecimiento de cultivos primarios. A pesar de las características ventajosas y su potencial aplicación prometedora de la genético-herramienta y en vitro basados ​​en células, sus limitaciones se deben tener en mente y su naturaleza in vitro deben ser resaltados. Por ejemplo, los efectos diferenciales o la citotoxicidad de un fármaco sobre las células tumorales puede más bien debido a la diferencia en los tipos de células (fibroblastos en comparación con las células de Schwann) o sudiferentes orígenes (de diferentes individuos). El efecto más fuerte de un fármaco sobre las células tumorales que en células no tumorales también puede explicarse por el hecho de que el primero crecen más rápido que el segundo. Lo más importante, las células en el comportamiento in vitro difieren de las células en el cuerpo humano y, en consecuencia, los resultados de la evaluación in vitro a menudo no o sólo parcialmente reflejan la situación clínica real. Por lo tanto, la eficacia, la citotoxicidad y especificidad de los medicamentos obtenidos para las células cultivadas son más bien de naturaleza biomarcador, pero no tienen la fiabilidad de la eficacia preclínica medido de antibióticos. Sin embargo, al pasar de líneas celulares a cultivos mixtos y / o cultivos primarios es un paso adelante en la evaluación de medicamentos de efecto y la especificidad / selectividad in vitro. Con grandes esfuerzos, en condiciones in vitro se puede encontrar que permite correlación razonable de los datos in vitro con las respuestas reales de los pacientes, al menos para algunos medicamentos.

Therapeutic effects of anticancer drugs on tumor cells are associated with various unwished toxic effects on non-tumor cells. Toxic effects are difficult to assess in the laboratory, largely due to the lack of suitable tools1. Cell cultures containing both tumor and non-tumor cells would provide a potential in vitro resource for assessing specificity or selectivity of a drug which may shed light on clinical toxicity. However, conventional in vitro assays such as proliferation or viability assays measure effect of a drug on total cells, but cannot divide the effect into the part on tumor cells and the part on non-tumor cells. For example, a 50% reduction of total cell number in a culture composed of 50% tumor cells and 50% non-tumor cells can imply death of all tumor cells, death of all non-tumor cells or, more likely, death of parts of both at various ratios. 
Also because of this technical problem, primary cultures which contain tumor and non-tumor stromal cells are frequently unsuitable for testing drugs. On the other side, because of this cellular heterogeneity, primary cultures resemble their original tumors far better than clonal cells in established cell lines2. More importantly, primary cultures are patient-specific and may enable individualized drug testing2-4.
An essential issue is therefore the development of a method for determination of the proportion of tumor cells in mixed cultures including primary cultures. Toward this challenge, a genetic solution was conceived which is based on determination of the quantitative ratio of a tumor-specific genetic feature to a universal reference sequence. From this ratio, the proportion of tumor cells in a mixed culture can be calculated. 
This study illustrates the procedure of the genetic and cell-based tool for assessing specificity of anticancer drugs including (1) preparing a mixed culture from tumor cells of an established line and non-tumor fibroblasts, (2) treating the mixed culture with a test drug, (3) preparing DNA for digital PCR, (4) determining the ratio of an tumor-specific heterozygous deletion to a reference sequence using a dual-probe droplet digital PCR assay, (5) calculating proportions of tumor cells at each drug concentration and (6) drawing up dose-dependent change of proportion of tumor cells.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">membrane filter of 25 mm diameter</td>
			<td style="width:71px;">Merk-Millipore</td>
			<td style="width:119px;">VSWP 02500</td>
			<td style="width:167px;">for drop-dialysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ddPCR assay for NF1</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>dHsaCP1000177</td>
			<td>FAM-labelled</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ddPCR assay for RPP30</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>dHsaCP2500350</td>
			<td>HEX-labelled</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QX200</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td style="width:119px;">186-4001</td>
			<td>the previous version QX was used in the study, which is not available any more. The replacement is QX200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Droplet oil</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cartriges&#160;</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gaskets</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cartrige holder</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>186-3051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">pierceble foil</td>
			<td style="width:71px;">BioRad</td>
			<td>181-4040</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing specificity of anticancer drugs in vitro

Un procedimiento para evaluar la especificidad de medicamentos contra el cáncer in vitro utilizando cultivos que contienen células tanto tumorales y no tumorales se demuestra. El elemento clave es la determinación cuantitativa de una alteración genética específica de tumor en relación con una secuencia universal, usando un ensayo de PCR digitales de doble sonda y el posterior cálculo de la proporción de células tumorales. El ensayo se lleva a cabo en un cultivo que contiene células tumorales de una línea establecida y enriquecida en células no tumorales. El cultivo mixto es tratado con un fármaco de ensayo a diversas concentraciones. Después del tratamiento, el ADN se prepara directamente a partir de las células adhesivas sobrevivido en pocillos de placas de 96 pocillos usando un método simple y de bajo costo, y se sometió a un ensayo de PCR digital dual de la sonda para la medición de una alteración genética específica de tumor y una secuencia de referencia Universal . En la presente demostración, una deleción heterocigota del gen NF1 se utiliza como la alteración genética específica del tumor yun gen RPP30 como el gen de referencia. Usando la relación NF1 / RPP30, se calculó la proporción de células tumorales. Puesto que el cambio dependiente de la dosis de la proporción de células tumorales proporciona una indicación in vitro de la especificidad del fármaco, este ensayo genético y basado en células in vitro es probable que tenga potencial de aplicación en el descubrimiento de fármacos. Además, para el cuidado personalizado del cáncer, esta herramienta genético-y basado en células puede contribuir a la optimización de la quimioterapia adyuvante por medio de probar la eficacia y la especificidad de los fármacos candidatos utilizando cultivos primarios de tumores individuales.

Calidad de ADN preparado mediante el HotShot combinado / Drop-La diálisis es suficiente para digital PCR satisfactoria (Figura 1B). Para 2.000 fibroblastos, se obtuvieron aproximadamente 3.000 ± 500 gotitas positivos, que corresponde a 75% de los esperados 4.000 copias (dos copias en una célula). En este estudio, las células tumorales fueron de una línea establecida MPNST S462 que se sabe que tienen una deleción heterocigota del gen NF1 5. Esta reducción de la dosis del gen 50% se detectó claramente por el ensayo de PCR digital de doble (Figura 1B). Por el contrario, se midieron dos copias de este gen en los fibroblastos. Esta diferencia genética entre las células tumorales y no tumorales permite el cálculo de la proporción de células tumorales en cultivos mixtos (Figura 2). Mediante la medición de la dosis génica relativa de NF1 a RPP30, la proporción de células tumorales en un cultivo mixto puede determinarseen cada fármaco-concentración (Figura 3). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig1.jpg" /> Figura 1. PCR digital. (A) ilustración del principio. (B) un ensayo de doble sonda revela una cantidad reducida de un gen diana (NF1) en las células tumorales TMVNP S462 en relación con un gen de referencia (RPP30). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig2.jpg" /> Figura 2. Proporción Calculado de células tumorales. Las células tumorales y no tumorales células se mezclaron en diversas proporciones y se sembraron en cada pocillo de una placa de 96. Después de la unión O / ingenio N, las células se lisaronh HotShot / Drop-diálisis y los lisados ​​desaladas se sometieron a PCR digital que dio la relación de NF1 / RPP30. La base en esta relación, se calculó la proporción de células tumorales en cada pocillo. La media y la desviación estándar de la proporción de las células tumorales se calculó a partir de 4 réplicas en cada proporción configuración. Las proporciones calculadas de las células tumorales (eje Y) se representaron frente a las proporciones de puesta a punto (eje X). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig3.jpg" /> Figura 3. cambio de dosis-dependiente de la proporción de células tumorales. (A) dependiente de la dosis la reducción de las células vitales visibles. (B) la proporción de las células tumorales (media y desviación estándar de 4 réplicas) calculada a partir de la<html> relación de NF1: RPP30, disminución en el rango de 0 - 10 mM. En la dosis más alta de 50 mM, se dejaron pocas células vitales, probablemente debido al efecto tóxico de todas las células. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53752/53752fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53752/53752fig4.jpg" /> . Figura 4. Separación de respuesta de las células tumorales de la de las células no tumorales (A) la viabilidad y / o proliferación de células totales se puede medir usando ensayos convencionales; Proporción de células tumorales se puede determinar usando el procedimiento demostrado en el presente estudio. (B) utilizando los dos parámetros, la respuesta del total de células en un cultivo mixto a un fármaco puede ser dividido en respuesta de las células tumorales y la respuesta de las células no tumorales..com / archivos / ftp_upload / 53752 / 53752fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <table fo:keep-together.within-page="1"><colgroup><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"></td><td style="width:171px;"> 1 Reacción </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> 2 x ddPCR supermix </td><td style="width:171px;"> 12 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> mezcla de ensayo para NF1 </td><td style="width:171px;"> 1.2 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> mezcla de ensayo para RPP30 </td><td style="width:171px;"> 1.2 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> HaeIII </td><td style="width:171px;"> 0,6 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:147px;"> Total parcial </td><td style="width:171px;"> 15 </td><td style="width:99px;"> mezcla maestra </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:147px;"> ADN </td><td style="width:171px;"> 9 </td><td style="width:99px;"></td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;width:147px;"> Total </td><td style="width:171px;"> 24 </td><td style="width:99px;"> Final de mezcla de PCR </td></tr></tbody></table> Tabla 1 Configuración Dual ddPCR Reacción <table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Paso </td><td> Acción </td><td> Temperatura </td><td> Hora </td><td> ciclos </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Polymborrar la activación </td><td> 95 ° C </td><td> 10 minutos </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> desnaturalización del ADN </td><td> 94 ° C </td><td> 30 segundos </td><td rowspan="2"> 40 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> El recocido / exetension </td><td> 60 ° C </td><td> 1 minuto </td></tr><tr><td> 4 </td><td> desactivación de la polimerasa </td><td> 98 ° C </td><td> 10 minutos </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Hold (opcional) </td><td> 4 ° C </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> La Tabla 2 Configuración Cycler PCR

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Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

El objetivo de este protocolo es evaluar la especificidad de los medicamentos contra el cáncer in vitro utilizando cultivos mixtos que contienen células tumorales tanto y no tumorales.

La especificidad de la evaluación de Medicamentos contra el cáncer<em&gt; In Vitro</em

A procedure for assessing specificity of anticancer drugs in vitro using cultures containing both tumor and non-tumor cells is demonstrated. The key ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Assessing Specificity of Anticancer Drugs In Vitro

9.4K vistas.  University Medical Center Hamburg-Eppendorf.  El objetivo de este protocolo es evaluar la especificidad de los medicamentos contra el cáncer in vitro utilizando cultivos mixtos que contienen células tumorales tanto y no tumorales. 

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In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice

Transgenic and knockout mice have been powerful tools for the investigation of the physiology and pathophysiology of airways1,2. In vitro tensometry of isolated tracheal preparations has proven to be a useful assay of airway smooth muscle (ASM) contractile response in genetically modified mice. These in vitro tracheal preparations are relatively simple, provide a robust response, and retain both functional cholinergic nerve endings and muscle responses, even after long incubations.
Tracheal tensometry also provides a functional assay to study a variety of second messenger signaling pathways that affect contraction of smooth muscle. Contraction in trachea is primarily mediated by parasympathetic, cholinergic nerves that release acetylcholine onto ASM (Figure 1). The major ASM acetylcholine receptors are muscarinic M2 and M3 which are Gi/o and Gq coupled receptors, respectively3,4,5. M3 receptors evoke contraction by coupling to Gq to activate phospholipase C, increase IP3 production and IP3-mediated calcium release from the sarcoplasmic reticulum3,6,7. M2/Gi/o signaling is believed to enhance contractions by inhibition of adenylate cyclase leading to a decrease in cAMP levels5,8,9,10. These pathways constitute the so called "pharmaco-contraction coupling" of airway smooth muscle11. In addition, cholinergic signaling through M2 receptors (and modulated by M3 signaling) involves pathways that depolarize the ASM which in turn activate L-type, voltage-dependent calcium channels (Figure 1) and calcium influx (so called "excitation-contraction coupling")4,7. More detailed reviews on signaling pathways controlling airway constriction can be found4,12. The above pathways appear to be conserved between mice and other species. However, mouse tracheas differ from other species in some signaling pathways. Most prominent is their lack of contractile response to histamine and adenosine13,14, both well-known ASM modulators in humans and other species5,15.
Here we present protocols for the isolation of murine tracheal rings and the in vitro measurement of their contractile output. Included are descriptions of the equipment configuration, trachea ring isolation and contractile measurements. Examples are given for evoking contractions indirectly using high potassium stimulation of nerves and directly by depolarization of ASM muscle to activate voltage-dependent calcium influx (1. high K+, Figure 1). In addition, methods are presented for stimulations of nerves alone using electric field stimulation (2. EFS, Figure 1), or for direct stimulation of ASM muscle using exogenous neurotransmitter applied to the bath (3. exogenous ACH, Figure 1). This flexibility and ease of preparation renders the isolated trachea ring model a robust and functional assay for a number of signaling cascades involved in airway smooth muscle contraction.

In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice

Transgenic mice have been extremely useful in ascribing physiological function to genes. As such, research in general, and functional studies of airway, in particular, have undergone a remarkable shift toward murine models. Here we provide protocols for in vitro trachea constriction studies to evaluate smooth muscle function in murine airway.

Mediciones in vitro de la constricción de la tráquea Utilizando ratones

Transgenic and knockout mice have been powerful tools for the investigation of the physiology and pathophysiology of airways1,2. In vitro tensometry of ...

Investigación

Medicina

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, including mental retardation due to disordered and damaged brain development. Fetal alcohol spectrum disorder (FASD) is a term used to cover a continuum of birth defects that occur due to maternal alcohol consumption, and occurs in approximately 4% of children born in the United States. With 50% of child-bearing age women reporting consumption of alcohol, and half of all pregnancies being unplanned, unintentional exposure is a continuing issue2. In order to best understand the damage produced by ethanol, plus produce a model with which to test potential interventions, we developed a model of developmental ethanol exposure using the zebrafish embryo. Zebrafish are ideal for this kind of teratogen study3-8. Each pair lays hundreds of eggs, which can then be collected without harming the adult fish. The zebrafish embryo is transparent and can be readily imaged with any number of stains. Analysis of these embryos after exposure to ethanol at different doses and times of duration and application shows that the gross developmental defects produced by ethanol are consistent with the human birth defect. Described here are the basic techniques used to study and manipulate the zebrafish FAS model.

In order to understand the molecular mechanisms of the ethanol-induced developmental damage, we have developed a zebrafish model of ethanol exposure and are exploring the physical, cellular, and genetic alterations that occur after ethanol exposure1. We then seek to find potential interventions and rapidly test them in this animal model.

Evaluación de los cambios teratogénicos en un modelo de pez cebra de la exposición fetal al alcohol

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic Therapy is a novel approach for a more tumor selective treatment.
Photodynamic Therapy (PDT) that makes use of a nontoxic photosensitizer (PS), which, upon activation with light of a specific wavelength in the presence of oxygen, generates oxygen radicals that elicit a cytotoxic response1. Despite its approval almost twenty years ago by the FDA, PDT is nowadays only used to treat a limited number of cancer types (skin, bladder) and nononcological diseases (psoriasis, actinic keratosis)2.
The major advantage of the use of PDT is the ability to perform a local treatment, which prevents systemic side effects. Moreover, it allows the treatment of tumors at delicate sites (e.g. around nerves or blood vessels). Here, an intraoperative application of PDT is considered in osteosarcoma (OS), a tumor of the bone, to target primary tumor satellites left behind in tumor surrounding tissue after surgical tumor resection. The treatment aims at decreasing the number of recurrences and at reducing the risk for (postoperative) metastasis.
In the present study, we present in vitro PDT procedures to establish the optimal PDT settings for effective treatment of widely used OS cell lines that are used to reproduce the human disease in well established intratibial OS mouse models. The uptake of the PS mTHPC was examined with a spectrophotometer and phototoxicity was provoked with laser light excitation of mTHPC at 652 nm to induce cell death assessed with a WST-1 assay and by the counting of surviving cells. The established techniques enable us to define the optimal PDT settings for future studies in animal models. They are an easy and quick tool for the evaluation of the efficacy of PDT in vitro before an application in vivo.

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

The protocol reported here allows the evaluation of the efficacy of photodynamic therapy (PDT) in cell lines and the optimization of the PDT settings before applying the therapy in animal models.

Citotóxica eficacia de la terapia fotodinámica en células de osteosarcoma<em&gt; In Vitro</em

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic ...

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they typically rely upon lengthy and costly in vivo animal challenge studies. A number of in vitro assays have been developed to aid in measuring prion species barriers, thereby reducing animal use and providing quicker results than animal bioassays. Here, we present the protocol for a rapid in vitro prion conversion assay called the conversion efficiency ratio (CER) assay. In this assay cellular prion protein (PrPC) from an uninfected host brain is denatured at both pH 7.4 and 3.5 to produce two substrates. When the pH 7.4 substrate is incubated with TSE agent, the amount of PrPC that converts to a proteinase K (PK)-resistant state is modulated by the original host&#8217;s species barrier to the TSE agent. In contrast, PrPC in the pH 3.5 substrate is misfolded by any TSE agent. By comparing the amount of PK-resistant prion protein in the two substrates, an assessment of the host&#8217;s species barrier can be made. We show that the CER assay correctly predicts known prion species barriers of laboratory mice and, as an example, show some preliminary results suggesting that bobcats (Lynx rufus) may be susceptible to white-tailed deer (Odocoileus virginianus) chronic wasting disease agent.

Assessing Transmissible Spongiform Encephalopathy Species Barriers with an In Vitro Prion Protein Conversion Assay

Measuring the barrier to the interspecies transmission of prion diseases is challenging and typically involves animal challenges or biochemical assays. Here, we present an in vitro prion protein conversion assay with the ability to predict species barriers.

La evaluación de la encefalopatía espongiforme transmisible Especies Barreras con un<em&gt; In Vitro</em&gt; Prion Análisis de Conversión de proteínas

Studies to understanding interspecies transmission of transmissible spongiform encephalopathies (TSEs, prion diseases) are challenging in that they ...

Use of Rabbit Eyes in Pharmacokinetic Studies of Intraocular Drugs

The intraocular route of drug administration enables the delivery of high concentrations of therapeutic drugs, while minimizing their systemic absorption. Several drugs are administered into the anterior chamber or vitreous, and the intraocular injection has been effective in curing various intraocular diseases. Rabbit eyes have been widely used for ophthalmic research, as the animal is easy to handle and economical compared to other mammals, and the size of a rabbit eye is similar to that of a human eye. Using a 30 G needle, drugs can be injected into the intracameral and intravitreal spaces of rabbit eyes. The eyeballs are then frozen until analysis, and can be divided into the aqueous humor, vitreous, and retina/choroid. The vitreous and retina/choroid samples can be homogenized and solubilized before analysis. Then, immunoassays can be performed to measure the concentrations of intraocular drugs in each compartment. Appropriate pharmacokinetic models can be used to calculate several parameters, such as the half-life and maximum concentration of the drug. Rabbit eyes can be a good model for pharmacokinetic studies of intraocular drugs.

Rabbits are widely used to study the pharmacokinetics of intraocular drugs. We describe a method for conducting pharmacokinetic studies of intraocular drugs using rabbit eyes.

El uso de ojos de conejo en el estudio farmacocinético de intraoculares Drogas

The intraocular route of drug administration enables the delivery of high concentrations of therapeutic drugs, while minimizing their systemic absorption. ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant CFTR channel in subjects with cystic fibrosis (CF). Identification of subjects that may benefit from these drugs is challenging because of the extensive heterogeneity of CFTR mutations, as well as other unknown factors that contribute to individual drug efficacy. Here, we describe a simple and relatively rapid assay for measuring individual CFTR function and response to CFTR modulators in vitro. Three dimensional (3D) epithelial organoids are grown from rectal biopsies in standard organoid medium. Once established, the organoids can be bio-banked for future analysis. For the assay, 30-80 organoids are seeded in 96-well plates in basement membrane matrix and are then exposed to drugs. One day later, the organoids are stained with calcein green, and forskolin-induced swelling is monitored by confocal live cell microscopy at 37 &#176;C. Forskolin-induced swelling is fully CFTR-dependent and is sufficiently sensitive and precise to allow for discrimination between the drug responses of individuals with different and even identical CFTR mutations. In vitro swell responses correlate with the clinical response to therapy. This assay provides a cost-effective approach for the identification of drug-responsive individuals, independent of their CFTR mutations. It may also be instrumental in the development of future CFTR modulators.

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

This protocol describes an assay for measuring CFTR function and CFTR modulator responses in cultured tissue from subjects with cystic fibrosis (CF). Biopsy-derived intestinal organoids swell in a cAMP-driven fashion, a response that is defective (or strongly reduced) in CF organoids and can be restored by exposure to CFTR modulators.

Inducida por la forskolina Hinchazón en organoides intestinal: Una<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayo para evaluar la respuesta de drogas en pacientes con fibrosis quística

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models. 
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&amp;E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.

Análisis optimizada de<em&gt; En Vivo</em&gt; y<em&gt; In Vitro</em&gt; La esteatosis hepática

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a condition that typically involves damage to or loss of the delicate mechanosensory structures of the inner ear. Sophisticated in vitro and ex vivo assays have emerged in recent years, enabling the screening of an increasing number of potentially therapeutic compounds while minimizing resources and accelerating efforts to develop cures for SNHL. Though homogenous cultures of certain cell types continue to play an important role in current research, many scientists now rely on more complex organotypic cultures of murine inner ears, also known as cochlear explants. The preservation of organized cellular structures within the inner ear facilitates the in situ evaluation of various components of the cochlear infrastructure, including inner and outer hair cells, spiral ganglion neurons, neurites, and supporting cells. Here we present the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The careful preparation of these explants facilitates the identification of mechanisms that contribute to SNHL and constitutes a valuable tool for the hearing research community.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

The goal of this protocol is to demonstrate the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The technique can be utilized as an in vitro screening tool in hearing research.

Técnica de Explante Coclear Murino Neonatal como<em&gt; In Vitro</em&gt; Herramienta de detección en la investigación de la audición

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to moderate level of increase in high-density lipoprotein (HDL) cholesterol in plasma. However, a possible role of these drugs in altering morphology and distribution of cholesterol particles is poorly understood. Here, we describe the in vitro evaluation of lipid-lowering drug effects in modulating morphological features of cholesterol particles using the plaque array method in combination with imaging flow cytometry. Image analyses of the cholesterol particles indicated that lovastatin, simvastatin, ezetimibe, and atorvastatin induce the formation of both globular and linear strand-shaped particles, whereas niacin, fibrates, fluvastatin, and rosuvastatin induce the formation of only globular-shaped particles. Next, purified very low-density lipoprotein (VLDL) and LDL particles incubated with these drugs showed changes in the morphology and image texture of cholesterol particles subpopulations. Furthermore, screening of 50 serum samples revealed the presence of a higher level of linear shaped HDL cholesterol particles in subjects with dyslipidemia (mean of 18.3%) compared to the age-matched normal (mean of 11.1%) samples. We also observed considerable variations in lipid-lowering drug effects on reducing linear shaped LDL and HDL cholesterol particles formation in serum samples. These findings indicate that lipid-lowering drugs, in addition to their cell-mediated hypolipidemic effects, may directly modulate morphology of cholesterol particles by a non-enzymatic mechanism of action. The outcomes of these results have potential to inform diagnosis of atherosclerosis and predict optimal lipid-lowering therapy.

The objective of this study was to evaluate in vitro lipid-lowering drug effects in modulating the morphology of cholesterol particles. Comparison of lipid-lowering drugs revealed variations in their effect in modulating the morphological features of cholesterol particles.

Efectos de fármacos hipolipemiantes en la modulación de la morfología de las partículas de colesterol

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to ...

Assessing Therapeutic Angiogenesis in a Murine Model of Hindlimb Ischemia

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard therapy, a considerable number of CLI patients are not suited for either surgical or endovascular revascularization. Angiogenic therapies are emerging as an option for these patients but are currently still under investigation. Before application in humans, those therapies must be tested in animal models and its mechanisms must be clearly understood. An animal model of hindlimb ischemia (HLI) has been developed by the ligation and excision of the distal external iliac and femoral arteries and veins in mice. A comprehensive panel of tests was assembled to assess the effects of ischemia and putative angiogenic therapies at functional, histologic and molecular levels. Laser Doppler was used for the flow measurement and functional assessment of perfusion. Tissue response was evaluated by the analysis of capillary density after staining with the anti-CD31 antibody on histological sections of gastrocnemius muscle and by measurement of collateral vessel density after diaphonization. Expression of angiogenic genes was quantified by RT-PCR targeting selected angiogenic factors exclusively in endothelial cells (ECs) after laser capture microdissection from mice gastrocnemius muscles. These methods were sensitive in identifying differences between ischemic and non-ischemic limbs and between treated and non-treated limbs. This protocol provides a reproducible model of CLI and a framework for testing angiogenic therapies.

Here, a critical hindlimb ischemia experimental model is presented followed by a battery of functional, histologic and molecular tests&#160;to assess the effectiveness of angiogenic therapies.&#8203;

Evaluación de la angiogénesis terapéutica en un modelo murino de isquemia de las extremidades posteriores

Critical limb ischemia (CLI) is a serious condition that entails a high risk of lower limb amputation. Despite revascularization being the gold-standard ...