This work was funded by the Institut Pasteur, the Bettencourt-Schueller foundation, Centre National de la Recherche Scientifique, University Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), the Conny-Maeva Charitable Foundation, the Cognacq Jay Foundation, the Orange Foundation, and the Fondamental Foundation. L.G. is supported by an undergraduate fellowship from the Health Ministry. We acknowledge the help of BitPlane in particular Georgia Golfis, in the early stage of this work.

1. Neuronal Cultura Nota: la reprogramación de fibroblastos en células madre pluripotentes, el compromiso con el linaje telencéfalo dorsal, derivación, amplificación, y la banca de progenitores finales corticales (LCP) se describe en Boissart et al 4. La diferenciación neuronal de las células-LCP como también se realizó de acuerdo a Boissart et al 4 con ligeras modificaciones. Otros procedimientos han sido desarrollados para la reprogramación directa de los fibroblastos en células madre pluripotentes inducidas seguido por su diferenciación en neuronas. Este protocolo fue retenido ya que permite la producción selectiva de las neuronas glutamatérgicas piramidales. <ol><li> Tratar 6 pocillos placas de cultivo con cubreobjetos de vidrio con poli-ornitina (diluido a 1/6 en DPBS, la concentración de stock 0,01%) O / N, seguido de tres lavados en DPBS. A continuación, añadir la laminina (concentración de solución madre 1 mg / ml, se diluyó 500 veces en DPBS) durante al menos 10 h bajo la campana de flujo<html> . </li><li> Plate y despachar NSC a baja densidad (50.000 células / cm 2) en 6 pocillos placas de cultivo con cubreobjetos de vidrio en 3 ml de medio de cultivo que consta de DMEM / F12 (500 ml), 2 viales (5 ml cada uno) de suplemento de N2, 2 viales (10 ml cada una) de suplemento B27, 10 ml de Pen-estreptomicina (Penicilina = 10.000 unidades / ml y estreptomicina = 10.000 unidades / ml), 1 ml de 2-mercaptoetanol (Stock solución: 50 mM) y laminina (1 / 500), y sin factores de crecimiento. PASO CRÍTICO: Llevar a cabo este paso cuidadosamente por la adición de células con movimientos giratorios lentos con el fin de reducir la agrupación de células. </li><li> Retire el medio de cultivo. Añadir medio N2B27 fresco que contiene 2 mg / ml de solución de laminina fresco para mantener la neurona adjunto sobre los cubreobjetos de vidrio y evitar la formación de grumos. Cambie el medio cada 3 días. Mantener algunos de el medio restante (200 l) antes de añadir medio fresco con el fin de evitar que la célula de secado. Alternativamente, proceder rápidamente y cambiar el volumen total (3 ml). </li></ol>e_title &quot;&gt; 2. Lentiviral Transducción Nota: lentiviral vectores GFP fueron amablemente proporcionados por el Dr. Uwe Maskos Laboratorio en el Instituto Pasteur (París) y preparados de acuerdo con el protocolo publicado 5. Expresión de GFP es impulsado por el promotor de fosfoglicerato quinasa de ratón (PGK). Para este estudio, título viral fue de 400 ng / l (solución madre en PBS 1x). <ol><li> Transducir neuronas derivadas de IPSC humanos en cualquier etapa de la maduración de las partículas virales mediante la adición de 1 l de la solución madre que contiene 40 ng de GFP vector lentiviral por cultivo así (placas de 6 pocillos) y se incuba durante 48 horas en medio de cultivo fresco. Nota: Para este protocolo, la duración de la incubación permite un buen etiquetado de las estructuras de la columna vertebral. </li></ol> 3. La inmunofluorescencia Nota: Con el fin de mejorar el etiquetado de toda la morfología de la columna vertebral, se llevó a cabo el etiquetado de inmunofluorescencia utilizando un anticuerpo anti-GFP en condiciones permeabilizadas. </p&gt; <ol><li> Retire medio de cultivo y fijar las células transducidas en cubreobjetos en paraformaldehído al 4% durante 10 min a RT, a continuación, lavar 3 veces en 1X PBS (10 min cada uno). </li><li> Cubreobjetos immergé en PBS suplementado con 0,05% de Triton (100x) y 10% de suero de caballo durante 1 hora a RT, a continuación, lavar 3 veces en 1X PBS. </li><li> Añadir 100 l de 1x PBS suplementado con 4% de suero de caballo y anticuerpo primario (1 / 1.000) generado contra GFP y se diluyeron por un factor de 1000 en cada cubreobjetos. Incubar en una caja oscura O / N a 4 ° C, luego lavar 3 veces con PBS 1x. </li><li> Diluir Alexa Fluor 488-anticuerpo conjugado (1/200) en PBS suplementado con 0,5% de Tween 20 y se incuba durante 1 hora a RT. A continuación, lavar 3 veces en PBS 1x y montar cubreobjetos en portaobjetos de vidrio con medio de montaje para microscopía de fluorescencia. </li></ol> 4. dendríticas Spine Imaging <ol><li> Realizar imagen confocal través de un microscopio láser confocal de barrido. </li><li> Seleccionar las neuronas sanas con una morfología piramidalencontrar una arborización dendrítica completo, y cuantificar al menos 10 neuronas por condición de experimentos separados. Cuantificar 60 - 100 micras en las dendritas. </li><li> Adquirir imágenes utilizando un aceite 40X NA = 1,3 objetiva y una línea láser de 488 nm para la excitación GFP, con una potencia pico típico a nivel de muestra de alrededor de 20 mW. Establecer tamaño de píxel alrededor de 80 nm para probar adecuadamente las espinas dendríticas. Nota: La llamada posterior análisis de una imagen en la que el ruido no ponga en peligro la segmentación adecuada de las dendritas y espinas. Con los ajustes de toma de muestras y de potencia espaciales mencionadas anteriormente, se observó que un píxel en tiempo de permanencia de 3,15 mu s es suficiente para recoger suficientes fotones para construir una imagen tal. Para las muestras tenue, la calidad de imagen puede mejorarse mediante un promedio de 2 a 4 scans. La adquisición de varios azulejos XY puede ser necesaria para cubrir la región de interés, que luego debe ser cosida juntos antes de su procesamiento. </li><li> Para muestra, el volumen total de las neuronas, adquirir una Z-pila, conun espaciado Z que van desde 150 nm a 300 nm, produciendo 20 a 30 rebanadas z. Nota: La resolución espacial lateral logrado con estos ajustes es 234 nm y la resolución axial es 591 nm. El muestreo elegido aquí es adecuada, pero como la resolución axial es más grande que el tamaño más pequeño de las espinas en ser fotografiado, el análisis favorece las espinas que se extienden lateralmente desde las dendritas. </li></ol> 5. 3D Cuantificación de espinas dendríticas Nota: Las siguientes secciones describen específicamente el uso del software Imaris para su análisis. Existen implementaciones alternativas, incluyendo NeuronStudio 15 o Metamorph 8, que puede proporcionar resultados similares. Utilice los siguientes valores fundamentales: <ol><li> Como una etapa de tratamiento previo, utilizar el filtrado gaussiano a través de las instalaciones de procesamiento de imágenes que ofrece el software. Realizar filtrado gaussiano a través del procesamiento de imágenes&gt; SmooLo&gt; Filtro de Gauss. Ajuste el ancho del filtro para que sea igual al tamaño del pixel en XY. </li><li> Realizar un trazado semi-automática de las dendritas, utilizando el módulo de Filamento trazador del software. <ol><li> En primer lugar, calcular el diámetro de las dendritas, con la función distancia en la pestaña de la rebanada del software. </li><li> En la pestaña Surpass, haga clic en la herramienta de filamentos. Para una mejor robustez, este protocolo se basa en el seguimiento semiautomático; haga clic en la creación automática Omitir. El interfaz del módulo muestra ahora en la pestaña Dibujo. Aquí, seleccione AutoPath como método, Dendrita como un tipo, y la entrada al diámetro estimado de dendritas. </li><li> Utilice el modo de selección del puntero, convirtiendo el cursor en una caja. Mayús y haga clic derecho en el punto de partida de las dendritas. Nota: el software realiza cálculos iniciales. </li><li> Mueva el puntero a lo largo de la dendrita. Desde el punto de partida (representared como una esfera azul), se muestra una línea amarilla que representa la ruta de dendritas más probable. Mayús y haga clic izquierdo en el punto final de dendritas. </li></ol></li><li> Realice el espinas segmentación automatizada. Nota: Las espinas en la dendrita trazado se encuentran automáticamente por la interfaz del módulo. <ol><li> En la interfaz de módulo, haga clic en la ficha Creación. En la lista desplegable Reconstruir, recoger Reconstruir Dendrita Diámetro y marque la casilla de datos Fortaleza. Luego haga clic en Reconstruir. </li><li> Establecer el umbral de modo que el volumen segmentado corresponde al volumen dendrita real. Como un algoritmo, seleccione la distancia más corta de Distancia mapa. Haga clic en el botón Siguiente. </li><li> Determine el diámetro de la cabeza más pequeña columna vertebral y la longitud máxima, de nuevo con la función distancia en la pestaña de la rebanada del software, y luego volver a la pestaña Surpass e introduzca los parámetros. Fo este protocolo, los valores alrededor de 200 a 300 nm para el diámetro mínimo y 4 m de longitud máxima son buenos puntos de partida. No marque la casilla Permitir Rama de espinas. Haga clic en el botón Siguiente. </li><li> Ajustar el umbral de puntos semilla de modo que los puntos azules que representan espinas localizar a las cabezas de la columna vertebral reales. Haga clic en el botón Siguiente. Nota: El cálculo básico se hace ahora y puede ser largo. </li></ol></li><li> Clasifique espinas por ir a la pestaña Herramientas de la interfaz del módulo. Haga clic en Clasificar espinas. En la interfaz de usuario se le solicite, asegúrese de que hay cuatro clases, que se define por su morfología de la siguiente manera: Stubby: longitud &lt;1 m; Mushroom: Longitud (columna vertebral)&gt; 3 y el ancho máximo (cabeza)&gt; significan ancho (cuello) x 2; Larga delgada: La media anchura (cabeza) ≥ media anchura (cuello); -Filopodios como: Longitud ≤ 4 micras (sin cabeza). Nota: El mointerfaz dule genera cuatro nuevos objetos filamentos que contienen los resultados de la clasificación. </li><li> Exportar Datos estadísticos: en cualquiera de estos cuatro interfaces de objetos, vaya a la pestaña Estadísticas. Haga clic en los Exportar Estadísticas de botón File. Nota: Otros valores estadísticos se pueden exportar para dendritas (. Por ejemplo, longitud, área, diámetro, profundidad rama, ramas ángulo, volumen, etc significa.), Y por espinas (por ejemplo, la rectitud, la zona de unión, longitud y volumen de distinta partes de la columna vertebral, diámetro columna vertebral, densidades, etc.) </li></ol>

<ol>
	<li>Durand, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHANK3+mutations+identified+in+autism+led+to+modification+of+dendritic+spine+morphology+via+an+actin-dependent+mechanism.">SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism.</a> Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).</li><li>Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-synaptic+dendritic+spines+in+neocortex.">Non-synaptic dendritic spines in neocortex.</a> Neuroscience. 145, 464-469 (2007).</li><li>Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-based+comparison+of+human+dendritic+spine+structure+using+complete+three-dimensional+reconstructions.">Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions.</a> Cerebral Cortex. 23 (8), 1798-1810 (2013).</li><li>Boissart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+of+cortical+neurons+of+the+superficial+layers+amenable+to+psychiatric+disease+modeling+and+high-throughput+drug+screening.">Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening.</a> Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).</li><li>Avale, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+beta+2*+nicotinic+receptors+and+dopamine+pathways+in+the+control+of+spontaneous+locomotion.">Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion.</a> Proceedings of National Academy of Science USA. 105 (41), 15991-15996 (2008).</li><li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+synaptic+adhesion+with+dendritic+spine+remodeling+by+AF6+and+kalirin-7.">Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7.</a> Journal of Neuroscience. 28 (24), 6079-6091 (2008).</li><li>Srivastava, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Afadin+is+required+for+maintenance+of+dendritic+structure+and+excitatory+tone.">Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35964-35974 (2012).</li><li>Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+dendritic+spine+morphology+in+cultured+CNS+neurons.">Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2794 (2011).</li><li>Brennand, K. J., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+psychiatric+disorders+through+reprogramming.">Modeling psychiatric disorders through reprogramming.</a> Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 26-32 (2012).</li><li>Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+neuronal+differentiation+from+induced+pluripotent+stem+cells+to+model+ASD.">Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).</li><li>Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPS+cells:+a+game+changer+for+future+medicine.">iPS cells: a game changer for future medicine.</a> EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).</li><li>Stein, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquantitative+framework+to+evaluate+modeling+of+cortical+development+by+neural+stem+cells.">Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells.</a> Neuron. 83, 69-86 (2014).</li><li>Sivapatham, R., Zheng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell+for+disease+modeling.">Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling.</a> Methods in Molecular Biology. , (2014).</li><li>Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+dysgenesis+in+Rett+Syndrome.">Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).</li><li>Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Three+Dimensional+Detection+and+Shape+Classification+of+Dendritic+spines+from+Fluorescence+Microscopy+Images.">Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images.</a> PLoS ONE. 3 (4), e1997 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

La cuantificación de las características morfológicas de las neuronas piramidales se basó en el software. La interfaz Filament trazador se utilizó para la segmentación de las neuronas y espinas, y el módulo XT se utilizó para su análisis. Analizar la precisión de nuestra técnica, lo primero que comparó los parámetros morfológicos medidos (longitud, superficie, volumen y total de la columna vertebral en su caso), con los publicados utilizando ratas neuronas piramidales maduros e...

Las espinas dendríticas de las neuronas piramidales corticales son protuberancias pequeñas y delgadas que se distribuyen a lo largo de las dendritas basales y apicales de estos subtipos neuronales en los roedores, primates, y el cerebro humano. Son los sitios de la mayoría de las sinapsis excitadoras y mostrar funciones clave en el aprendizaje y los procesos cognitivos. Las estructuras detalladas de las espinas dendríticas humanas se han estudiado técnicamente por microscopía electrónica 2. Sin embargo, este enfoque lleva mucho tiempo y representa la carga de trabajo pesado. Más recientemente, un tridimensional (3D) de reconstrucción de la morfología de las espinas dendríticas ha sido reportado en la corteza del cerebro humano utilizando software específico combinado a gran análisis manual de la columna vertebral 3. La tecnología verde proteína de fluorescencia (GFP) acoplado a inmunofluorescencia representa una herramienta precisa para la identificación de la columna vertebral y medición de la forma por microscopía de fluorescencia. Este enfoque se puede aplicar fácilmente a las neuronas cultivadas. However, no hay datos han sido reportados en el análisis de maduración de la columna vertebral y la morfología de las neuronas humanas derivadas de células madre pluripotentes inducidas (IPSC). El objetivo de este estudio fue describir un protocolo, que permite obtener imágenes de la espina dendrítica de las neuronas humanas cultivadas in vitro. Etiquetado GFP, microscopía confocal y análisis 3D con el módulo del filamento de marcador de software Imaris fueron utilizados en el presente protocolo. Cultura pasos que son necesarios para obtener neuronas glutamatérgicas corticales de las capas II a IV a partir de células madre neurales (NSC) son también brevemente descrito aquí. Todo el protocolo para la producción NSC humana ya ha sido publicado en otra parte 4.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PD-PBS (1X), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse laminin</td>
			<td>Dutscher Dominique</td>
			<td>354232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement w/o vit A (50X)</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>31331028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Med SFM</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Steptomycin</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>A-6455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>16050130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit&#160;</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Anti-betaIII tubulin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB9354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 13 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent avec DAPI</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid</td>
			<td>Sigma Aldrich Chimie</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich Chimie</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Fibroblasts</td>
			<td>Coriell Cell Line Biorepository</td>
			<td>GM 4603 and GM 1869</td>
			<td>Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss (Germany)</td>
			<td>LSM 700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Software</td>
			<td>Bitplane AG, Zurich</td>
			<td>6.4.0 version</td>
			<td>Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Software</td>
			<td>Huygens software, SVI, Netherlands</td>
			<td>Pro version</td>
			<td>Optional (for deconvolution testing)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional quantification of dendritic spines from pyramidal neurons derived from human induced pluripotent stem cells

Las espinas dendríticas son pequeñas protuberancias que corresponden a los compartimentos post-sinápticos de las sinapsis excitadoras en el sistema nervioso central. Se distribuyen a lo largo de las dendritas. Su morfología es dependiente en gran medida de la actividad neuronal, y son dinámico. Las espinas dendríticas expresan receptores glutamatérgicos (receptores AMPA y NMDA) en su superficie y en los niveles de densidades postsinápticas. Cada columna vertebral permite la neurona para controlar su actividad estatal y local de manera independiente. Morfologías la columna vertebral han sido ampliamente estudiados en las células piramidales glutamatérgicas de la corteza cerebral, el uso de ambos enfoques in vivo y cultivos neuronales obtenidas a partir de tejidos de roedores. Condiciones neuropatológicos pueden estar asociados a la inducción de la columna vertebral y la maduración alterada, como se muestra en roedores neuronas cultivadas y el análisis cuantitativo unidimensional 1. El presente estudio describe un protocolo para el análisis cuantitativo 3D de morfologías de columna usando cortic humanacol neuronas derivadas de células madre neurales progenitoras corticales (finales). Estas células se obtuvieron inicialmente a partir de células madre pluripotentes inducidas. Este protocolo permite el análisis de la morfología de la columna vertebral en diferentes períodos de la cultura, y con posibilidad de comparación entre las células madre pluripotentes inducidas obtenidos de individuos de control con los obtenidos a partir de pacientes con enfermedades psiquiátricas.

<html> El presente estudio describe un protocolo estandarizado para la columna vertebral cuantificación de las dendritas de las neuronas piramidales cultivadas derivadas de IPSC. Este protocolo permite el análisis de la maduración de la columna vertebral en las neuronas humanas y su posible relación con la maduración de espinas en cultivos neuronales roedores estándar, así como en modelos animales in vivo. La figura 1A representa un esquema de las diferentes e...

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Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Las espinas dendríticas de las neuronas piramidales son los sitios de la mayoría de las sinapsis excitadoras en la corteza cerebral de los mamíferos. Este método describe un análisis cuantitativo 3D de morfologías de la columna vertebral en las neuronas glutamatérgicas piramidal corticales humanos derivadas de células madre pluripotentes inducidas.

La cuantificación tridimensional de espinas dendríticas de piramidal neuronas derivadas de células madre humanas pluripotentes inducidas

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

three-dimensional-quantification-dendritic-spines-from-pyramidal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.3K vistas.  Institut Pasteur.  Las espinas dendríticas de las neuronas piramidales son los sitios de la mayoría de las sinapsis excitadoras en la corteza cerebral de los mamíferos. Este método describe un análisis cuantitativo 3D de morfologías de la columna vertebral en las neuronas glutamatérgicas piramidal corticales humanos derivadas de células madre pluripotentes inducidas. 

Video: Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.

This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.

Generación de células madre Integración de libre Humanos pluripotentes inducidas Usando derivada de pelo queratinocitos

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

Derivación sin alimentador de melanocitos partir de células madre pluripotentes

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets of patients with metastatic melanoma. Major obstacles of this approach are the reduced viability of transferred T cells, caused by telomere shortening, and the limited number of TILs obtained from patients. Less-differentiated T cells with long telomeres would be an ideal T cell subset for adoptive T cell therapy;however, generating large numbers of these less-differentiated T cells is problematic. This limitation of adoptive T cell therapy can be theoretically overcome by using induced pluripotent stem cells (iPSCs) that self-renew, maintain pluripotency, have elongated telomeres, and provide an unlimited source of autologous T cells for immunotherapy. Here, we present a protocol to generate iPSCs using Sendai virus vectors for the transduction of reprogramming factors into TILs. This protocol generates fully reprogrammed, vector-free clones. These TIL-derived iPSCs might be able to generate less-differentiated patient- and tumor-specific T cells for adoptive T cell therapy.

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

Generación de células madre pluripotentes inducidas a partir de melanoma humano linfocitos infiltrantes de tumores,

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

Generación de Integración libres de células madre pluripotentes inducidas a partir de células mononucleares de sangre periférica humana Utilizando vectores episomales

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

Diferenciación de los condrocitos de las células madre pluripotentes humanas inducidas por la sangre periféricas derivadas de la sangre

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. Currently, efforts are being made to regenerate damaged cartilage with ex vivo expanded chondrocytes or bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs). However, the restricted viability and instability of these cells limit their application in cartilage reconstruction. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have received scientific attention as a new alternative for regenerative applications. With unlimited self-renewal ability and multipotency, hiPSCs have been highlighted as a new replacement cell source for cartilage repair. However, obtaining a high quantity of high-quality chondrogenic pellets is a major challenge to their clinical application. In this study, we used embryoid body (EB)-derived outgrowth cells for chondrogenic differentiation. Successful chondrogenesis was confirmed by PCR and staining with alcian blue, toluidine blue, and antibodies against collagen types I and II (COL1A1 and COL2A1, respectively). We provide a detailed method for the differentiation of cord blood mononuclear cell-derived iPSCs (CBMC-hiPSCs) into chondrogenic pellets.

Here, we propose a protocol for chondrogenic differentiation from cord blood mononuclear cell-derived human induced pluripotent stem cells.

Formación de gránulos condrogénicos a partir de células madre pluripotentes inducidas derivadas de sangre del cordón umbilical

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Diferenciación rápida y dirigida de las células epiteliales del pigmento retiniano de humanos embrionarios o inducidas pluripotenciales células

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying the human brain. One emerging technology to address this issue is the use of three dimensional (3D) neural cell cultures, termed &#39;organoids&#39; or &#39;spheroids&#39;, for long term preservation of intercellular interactions including extracellular adhesion molecules. However, these culture systems are time consuming and not systematically generated. Here, we detail a method to rapidly and consistently produce 3D cocultures of neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells. First, pre-differentiated astrocytes and neuronal progenitors are dissociated and counted. Next, cells are combined in sphere-forming dishes with a Rho-Kinase inhibitor and at specific ratios to produce spheres of reproducible size. After several weeks of culture as floating spheres, cocultures (&#39;asteroids&#39;) are finally sectioned for immunostaining or plated upon multielectrode arrays to measure synaptic density and strength. In general, it is expected that this protocol will yield 3D neural spheres that display mature cell-type restricted markers, form functional synapses, and exhibit spontaneous synaptic network burst activity. Together, this system permits drug screening and investigations into mechanisms of disease in a more suitable model compared to monolayer cultures.

In this protocol, we aim to describe a reproducible method for combining dissociated human pluripotent stem cell derived neurons and astrocytes together into 3D sphere cocultures, maintaining these spheres in free floating conditions, and subsequently measuring synaptic circuit activity of the spheres with immunoanalysis and multielectrode array recordings.

Microcircuito sináptica modelado con 3D Cocultures de astrocitos y neuronas de células madre pluripotentes humanas

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

Generación de 3D piel organoide de cable derivadas de sangre inducida por las células de vástago Pluripotent

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

En la generación de Vitro del Somite derivados humanos inducida por células madre pluripotentes

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...