This work was funded by the Institut Pasteur, the Bettencourt-Schueller foundation, Centre National de la Recherche Scientifique, University Paris Diderot, Agence Nationale de la Recherche (ANR-13-SAMA-0006; SynDivAutism), the Conny-Maeva Charitable Foundation, the Cognacq Jay Foundation, the Orange Foundation, and the Fondamental Foundation. L.G. is supported by an undergraduate fellowship from the Health Ministry. We acknowledge the help of BitPlane in particular Georgia Golfis, in the early stage of this work.

1. Nöronal Kültür Not: pluripotent kök hücreleri yeniden programlama Fibroblast geç kortikal atalarıdır dorsal telencephalon soy, türetme, büyütme ve bankacılık bağlılık (LCP) Boissart ark 4 tarif edildi. LCP benzeri hücrelerin nöronal farklılaşma, aynı zamanda hafif değişiklikler Boissart et al 4&#39;e göre gerçekleştirilmiştir. Diğer prosedürler nöronlar içine farklılaşma ardından uyarılmış pluripotent kök hücrelerin içine doğrudan fibroblastların yeniden programlama için geliştirilmiştir. O piramidal Glutamaterjik nöronların seçici üretimine izin verir, çünkü bu protokol muhafaza edildi. <ol><li> Poli-ornitin (DPBS 1/6 seyreltildi, stok konsantrasyonu% 0.01) DPBS içinde üç kez yıkanması izler O / N, cam lamelleri ile 6 oyuklu kültür plakaları tedavi edin. Daha sonra bir akış hunisi altına, en az 10 saat süre ile laminin (1 mg / ml, DPBS içinde 500 defa seyreltilmiş stok konsantrasyonu) ekleyin<html> . </li><li> Plaka ve düşük yoğunlukta NSC sevk N2 ekinin (50.000 hücre / cm2), cam DMEM / F12 oluşan kültür ortamının 3 ml lamelleri (500 mi), 2 şişeler 6 oyuklu kültür plakaları içinde (her biri 5 mi), B27 ekinin 2 şişeler (10 mL) ekstrakte edildi, Pen-Streptomisin (10 ml Penisilin = ml Streptomisin = 10.000 birim / ml 10.000 ünite /), 2-merkaptoetanol, 1 ml (stok çözeltisi: 50 mM) ve laminin (1 / 500), büyüme faktörleri olmadan. KRİTİK ADIM: Hücre kümeleme azaltmak için yavaş dönen hareketlerle hücreler ekleyerek dikkatle bu adımı uygulayın. </li><li> Kültür ortamı çıkarın. Cam lameller üzerine eklenmiş nöron tutmak topaklaşmayı önlemek için taze laminin çözeltisi 2 ug / ml ihtiva eden taze ortam N2B27 ekleyin. Her 3 günde orta değiştirin. Kurutma hücre önlemek için taze ortam ilave edilmeden önce kalan ortamı (200 ul) bir kısmını muhafaza edin. Alternatif olarak, daha hızlı ilerler ve toplam hacmin (3 mi) değiştirin. </li></ol>e_title &quot;&gt; 2. lentiviral İletimi Not: GFP lentiviral vektörler nazik Institut Pasteur Uwe Maskos Laboratory (Paris) tarafından sağlanan ve yayınlanan bir protokolün 5&#39;e göre hazırlandı. GFP ekspresyonu fare fosfogliserat kinaz (PGK) promoteri tarafından tahrik edilir. Bu çalışma için, bir viral titresi 400 ng / ul (PBS 1x stok çözelti) oldu. <ol><li> Kültür başına GFP lentiviral vektör de (6-yuvalı plakalar), 40 ng ihtiva eden stok çözeltisi 1 ul ekleyerek viral partiküllerin yolu ile olgunlaştırma herhangi bir aşamasında, insan iPSC türetilmiş nöronlar transdüksiyonu ve taze kültür ortamı içinde 48 saat süreyle inkübe edilir. Not: Bu protokol için inkübasyon süresi omurga yapılarının iyi bir etiketleme verir. </li></ol> 3. İmmünofloresan Not: Bütün omurga morfolojisinin etiketleme geliştirmek için, immüno-floresan etiketlemesini permeabilize koşullarında bir anti-GFP antikor kullanılarak gerçekleştirilmiştir. </p&gt; <ol><li> Oda sıcaklığında 10 dakika süreyle% 4 paraformaldehid içinde lamelleri transduse hücreleri kültür ortamı çıkarın ve gidermek ve ardından 1 x PBS içinde (10 dk) 3 kez yıkayın. </li><li> PBS içinde Immerge mistery lamelleri% 0.05 Triton (100x) ve oda sıcaklığında 1 saat süre ile,% 10 at serumu ile desteklenmiş, daha sonra 1 x PBS içinde 3 kez yıkayın. </li><li> 1x PBS 100 ul% 4 at serumu ve primer antikor (1/1000), GFP karşı ortaya her lamel 1000 kat seyreltildi ile takviye ekleyin. Bir karanlık kutu O inkübe / N 4 ° C&#39;de, daha sonra 1 x 3 defa PBS ile yıkayın. </li><li> PBS Tween 20% 0.5 ile takviye edilmiş olarak ve Alexa Fluor 488-konjuge antikor (1/200) seyreltin ve oda sıcaklığında 1 saat süreyle inkübe edin. Sonra 1x PBS içinde 3 kere yıkayın ve floresan mikroskobu için montaj orta ile cam slaytlar lamelleri monte edin. </li></ol> 4. Dendritik Omurga Görüntüleme <ol><li> Konfokal lazer tarama mikroskobu ile konfokal Görüntüleme gerçekleştirin. </li><li> Piramidal morfoloji a ile sağlıklı nöronlar seçinnd tam dendritik arborization ve ayrı deneylerden elde edilen durumda en az 10 nöronlar ölçmek. Dendritin başına 100 mikron - 60 ölçmek. </li><li> 20 uW etrafında örnek düzeyinde tipik bir zirve gücü ile NA objektif 1.3 = 40X yağ ve GFP uyarma için 488 nm lazer hattı kullanarak görüntüleri edinin. 80 nm çapında belirle piksel boyutu düzgün dendritik dikenler örnek. Not: Gürültü dendritler ve dikenler doğru segmentasyon taviz vermeyen hangi bir görüntü için daha sonra analiz çağrısı. Yukarıda belirtilen mekansal örnekleme ve güç ayarları ile, 3.15 ms&#39;den piksel bekleme zamanı böyle bir görüntü oluşturmak için yeterli fotonları toplamak için yeterli olduğu görülmektedir. Loş numuneler için, görüntü kalitesi 2 ila 4 tarama ortalama geliştirilebilir. Birkaç XY çini satın alma daha sonra birlikte işlemeden önce dikişli gereken ilgi bölgeyi kapsayacak şekilde gerekli olabilir. </li><li> Ile, Z-yığını elde, tüm nöron hacmi örnekZ 20 30 Z dilimleri, sonuçta 150 nm ila 300 nm arasında değişen aralığı. Not: Bu ayarlarla elde yanal uzaysal çözünürlüğü 234 nm ve eksenel çözünürlük 591 nm. Burada seçilen örnekleme yeterli olduğunu, ancak eksenel çözünürlük yansıması için dikenler küçük boyutundan büyük olduğu için, analiz dendritler yana doğru uzanan dikenleri yanadır. </li></ol> Dendritik Spine 5. 3D Niceleme Not: Aşağıdaki bölümlerde özel analiz için Imaris yazılım kullanımını tarif eder. Alternatif uygulamalar benzer sonuçlar sağlayabilir NeuronStudio 15 veya Metamorph 8 de dahil olmak üzere, mevcuttur. Aşağıdaki anahtar ayarları kullanın: <ol><li> Bir ön işleme aşaması olarak, yazılım tarafından sunulan görüntü işleme tesisleri ile Gauss filtreleme kullanmak. Görüntü İşleme&gt; smoo yoluyla Gauss filtreleme gerçekleştirinşey&gt; Gauss Filtre. XY piksel boyutuna eşit olması için filtre genişliğini ayarlayın. </li><li> Yazılımın Filament Tracer modülü kullanılarak, dendritler bir yarı otomatik izleme yapın. <ol><li> İlk olarak, yazılım Dilim sekmesinde mesafe aracını kullanarak, dendrit çapını tahmin ediyoruz. </li><li> Aşan sekmesinde, Filament aracı tıklayın. Daha iyi bir sağlamlık için bu protokol yarı otomatik izleme dayanır; Atla otomatik oluşturulması tıklayın. Modül arayüzü artık Çizim sekmesini gösteriyor. Burada, bir yöntem, bir tür olarak dendrit ve giriş tahmini dendrit çapı olarak autopath seçin. </li><li> Bir kutunun içine imleç dönüm işaretçi Seç modunu kullanın. Dendrit başlangıç ​​noktasında Shift-sağ tıklayın. Not: Yazılımın ilk hesaplamalar gerçekleştirir. </li><li> Dendritin boyunca hareket ettirin. Başlangıç ​​noktasından (temsilmavi küre olarak ed), büyük olasılıkla dendrit yolu temsil eden bir sarı çizgi gösterilir. Dendrit uç noktası üzerinde Shift-sol tıklayın. </li></ol></li><li> Otomatik dikenleri segmentasyon gerçekleştirin. Not: takip dendrit üzerindeki dikenler modül arabirimi tarafından otomatik olarak rastlanmaktadır. <ol><li> Modül arayüzünde, Yaratılış sekmesine tıklayın. Yeniden açılan listesinde, Dendrit Çap yeniden almak ve Tut veri kutusunu işaretleyin. Ardından yeniden tıklatın. </li><li> Parçalara hacmi gerçek dendrit hacmine tekabül böylece Eşik ayarlayın. Bir Algoritma olarak. Mesafe Map Kısa Mesafe seçin İleri düğmesini tıklatın. </li><li> En küçük omurga baş çapı ve maksimal uzunluğunu tespit, yine yazılımın Dilim sekmesinde mesafe aracını kullanarak, sonra tekrar Aşmak sekmesine gelip parametreleri girin. Fveya bu protokol, 200 civarında değerleri - minimal çapı 300 nm ve maksimal uzunluğu 4 mikron iyi bir başlangıç ​​noktalarıdır. İzin Şube Dikenler kutusunu kontrol etmeyin. İleri düğmesini tıklatın. </li><li> Dikenler temsil mavi noktalar gerçek omurga kafaları lokalize böylece Tohum Noktaları Eşik ayarlayın. İleri düğmesini tıklatın. Not: Çekirdek hesaplaması şu anda yapılıyor ve uzun olabilir. </li></ol></li><li> Modül arayüzü Araçlar sekmesine giderek dikenleri sınıflandırır. Sınıflandırır Spine tıklayın. İstendiğinde kullanıcı arayüzü, aşağıdaki gibi kendi morfolojisi ile tanımlanan dört sınıfları vardır emin olun: Topaç: uzunluk &lt;1 um; Mantar: Uzunluk (omurga)&gt; 3 ve Max genişliği (baş)&gt; genişliği (boyun) 2 x anlamına gelir; Uzun ince: Ortalama genişlik (kafa) ≥ ortalama genişliği (boyun); Filopodia gibi: Uzunluk ≤ 4 mikron (hiç kafa). Not: module arayüz sınıflandırma sonuçlarını içeren dört yeni Filament nesneleri oluşturur. </li><li> İhracat Istatistiksel veriler: Bu dört nesne arayüzleri herhangi İstatistikler sekmesine gidin. Düğmesine Dosyaya Aktar Tüm İstatistikleri tıklayın. Not: Diğer istatistiksel değerler dendritler için ihraç edilebilir (.. Örneğin uzunluk, alan, vb çapı, şube derinliği, dallanma açısı, hacim, ortalama), ve dikenler (örneğin, doğruluk, bağlılık, uzunluk ve farklı hacminin alan omurga parçaları, omurga çapı, yoğunluğu vb.) </li></ol>

<ol>
	<li>Durand, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SHANK3+mutations+identified+in+autism+led+to+modification+of+dendritic+spine+morphology+via+an+actin-dependent+mechanism.">SHANK3 mutations identified in autism led to modification of dendritic spine morphology via an actin-dependent mechanism.</a> Molecular Psychiatry. 17 (1), 71-84 (2013).</li><li>Arenallo, J. I., Espinosa, A., Fairen, A., Yuste, R., Defelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-synaptic+dendritic+spines+in+neocortex.">Non-synaptic dendritic spines in neocortex.</a> Neuroscience. 145, 464-469 (2007).</li><li>Benavides-Piccione, R., Fernaud-Espinosa, I., Robles, V., Yuste, R., DeFelipe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-based+comparison+of+human+dendritic+spine+structure+using+complete+three-dimensional+reconstructions.">Age-based comparison of human dendritic spine structure using complete three-dimensional reconstructions.</a> Cerebral Cortex. 23 (8), 1798-1810 (2013).</li><li>Boissart, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+from+human+pluripotent+stem+cells+of+cortical+neurons+of+the+superficial+layers+amenable+to+psychiatric+disease+modeling+and+high-throughput+drug+screening.">Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening.</a> Translational Psychiatry. 3, 1-11 (2013).</li><li>Avale, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+beta+2*+nicotinic+receptors+and+dopamine+pathways+in+the+control+of+spontaneous+locomotion.">Interplay of beta 2* nicotinic receptors and dopamine pathways in the control of spontaneous locomotion.</a> Proceedings of National Academy of Science USA. 105 (41), 15991-15996 (2008).</li><li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+synaptic+adhesion+with+dendritic+spine+remodeling+by+AF6+and+kalirin-7.">Coordination of synaptic adhesion with dendritic spine remodeling by AF6 and kalirin-7.</a> Journal of Neuroscience. 28 (24), 6079-6091 (2008).</li><li>Srivastava, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Afadin+is+required+for+maintenance+of+dendritic+structure+and+excitatory+tone.">Afadin is required for maintenance of dendritic structure and excitatory tone.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35964-35974 (2012).</li><li>Srivastava, D. P., Woolfrey, K. M., Penzes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+dendritic+spine+morphology+in+cultured+CNS+neurons.">Analysis of dendritic spine morphology in cultured CNS neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2794 (2011).</li><li>Brennand, K. J., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+psychiatric+disorders+through+reprogramming.">Modeling psychiatric disorders through reprogramming.</a> Disease Models and Mechanisms. 5 (1), 26-32 (2012).</li><li>Kim, S. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+neuronal+differentiation+from+induced+pluripotent+stem+cells+to+model+ASD.">Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-16 (2014).</li><li>Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iPS+cells:+a+game+changer+for+future+medicine.">iPS cells: a game changer for future medicine.</a> EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).</li><li>Stein, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquantitative+framework+to+evaluate+modeling+of+cortical+development+by+neural+stem+cells.">Aquantitative framework to evaluate modeling of cortical development by neural stem cells.</a> Neuron. 83, 69-86 (2014).</li><li>Sivapatham, R., Zheng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+characterization+of+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cell+for+disease+modeling.">Generation and characterization of patient-specific induced pluripotent stem cell for disease modeling.</a> Methods in Molecular Biology. , (2014).</li><li>Xu, X., Miller, E. C., Pozzo-Miller, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spine+dysgenesis+in+Rett+Syndrome.">Dendritic spine dysgenesis in Rett Syndrome.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 8, 1-8 (2014).</li><li>Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Three+Dimensional+Detection+and+Shape+Classification+of+Dendritic+spines+from+Fluorescence+Microscopy+Images.">Automated Three Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic spines from Fluorescence Microscopy Images.</a> PLoS ONE. 3 (4), e1997 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Piramidal nöronlar morfolojik özelliklerinin ölçümü yazılımı dayanıyordu. Filament Tracer arayüzü nöronların ve dikenler segmentasyonu için kullanıldı ve XT modülü kendi analiz için kullanıldı. Bizim teknik doğruluğunu analiz etmek, öncelikle kültür 6, 7 ve insan beyin dokularında 3 sıçan olgun piramidal nöronlar kullanarak yayınlanan olanlar ölçülen morfolojik parametreleri (uzunluk, alan ve toplam omurga hacmi uygulanabilir), karşı...

Kortikal piramidal nöronların Dendritik dikenleri kemirgen, primat, insan beyninin, bu nöron alt tiplerinin bazal ve apikal dendritler boyunca dağıtılmıştır küçük ve ince çıkıntılar bulunmaktadır. Bunlar en uyarıcı sinaps siteleri ve öğrenme ve bilişsel süreçlerde önemli fonksiyonları görüntülemek. İnsan dendritik dikenler detaylı yapıları teknik elektron mikroskobu 2 tarafından incelenmiştir. Bununla birlikte, bu yaklaşım, zaman alıcıdır ve ağır iş yükünü temsil eder. Daha yakın zamanda, dendritik dikenler morfoloji üç boyutlu (3D) yeniden büyük el omurga analizi 3 kombine özel bir yazılım kullanılarak insan beyin korteksinde bildirilmiştir. Immünofloresan bağlanmış yeşil floresan protein (GFP) teknolojisi floresan mikroskop ile omurga tespiti ve şekil ölçümü için doğru bir aracı temsil eder. Bu yaklaşım kolayca kültür nöronları için uygulanabilir. However, veriler uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSC) elde edilen insan nöronlar üzerinde omurga olgunlaşması ve morfoloji analizi bildirilmiştir. Bu çalışmanın amacı, in vitro kültürlenmiş insan nöronlardan dendritik omurga görüntüleme sağlayan bir protokol, tanımlamaktır. Imaris yazılımının Filament Tracer modülü ile GFP etiketleme, konfokal mikroskopi ve 3D analiz, mevcut protokolü kullanılmıştır. II nöral kök hücrelerden IV (NSC) için katmanları kortikal nöronlar glutamaterjik elde etmek için gerekli olan kültür adımlar da burada açıklanan kısaca. İnsan MGK üretimi için tüm protokol zaten başka bir yerde 4 yayımlanmıştır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PD-PBS (1X), sans Calcium, Magnesium et Phenol Red</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>14190169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Ornithine Solution Bioreagent</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse laminin</td>
			<td>Dutscher Dominique</td>
			<td>354232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 Supplement</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>17502048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement w/o vit A (50X)</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>12587010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/NUT.MIX F-12 W/GLUT-I</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>31331028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal Med SFM</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>21103049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Steptomycin</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP Rabbit Serum Polyclonal Antibody</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>A-6455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>16050130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit&#160;</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>A11034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Anti-betaIII tubulin antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB9354</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 13 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent avec DAPI</td>
			<td>Gibco/ Life Technologies</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween(R) 20 Bioextra, Viscous Liquid</td>
			<td>Sigma Aldrich Chimie</td>
			<td>P7949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich Chimie</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Fibroblasts</td>
			<td>Coriell Cell Line Biorepository</td>
			<td>GM 4603 and GM 1869</td>
			<td>Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Zeiss (Germany)</td>
			<td>LSM 700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris Software</td>
			<td>Bitplane AG, Zurich</td>
			<td>6.4.0 version</td>
			<td>Filament Tracer and Imaris XT modules are necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Software</td>
			<td>Huygens software, SVI, Netherlands</td>
			<td>Pro version</td>
			<td>Optional (for deconvolution testing)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional quantification of dendritic spines from pyramidal neurons derived from human induced pluripotent stem cells

Dendritik dikenler, merkezi sinir sisteminde, uyarıcı sinapsların post-sinaptik bölmelere karşılık küçük çıkıntılar vardır. Onlar dendritler boyunca dağıtılır. Onların morfolojisi nöronal aktivitenin büyük ölçüde bağlıdır ve onlar dinamik. Dendritik dikenler yüzeylerinde ve postsinaptik yoğunluğu seviyelerinde glutamaterjik reseptörleri (AMPA ve NMDA reseptörleri) ifade etmektedir. Her omurga nöron bağımsız olarak devlet ve yerel aktivite kontrol etmenizi sağlar. Omurga morfolojileri yoğun in vivo yaklaşımları ve kemirgen dokularından elde edilen nöronal kültürler her ikisini de kullanarak, beyin korteksinin glutamaterjik piramit şeklindeki hücrelerinde incelenmiştir. Kemirgen kültürlenmiş nöronlar ve tek boyutlu nicel analiz 1 &#39;de gösterildiği gibi nöropatolojik koşulları, değiştirilmiş omurga indüksiyon ve olgunlaşması ile ilişkili olabilir. Bu çalışmada, insan cortic kullanarak omurga morfolojileri 3D kantitatif analiz için bir protokol tanımlamaktadırnöral kök hücreler (geç kortikal atalarıdır) türetilen al nöronlar. Bu hücreler, ilk uyarılmış pluripotent kök hücreler elde edildi. Bu protokol, farklı kültür dönemlerinde omurga morfolojileri analizi sağlar, ve psikiyatrik hastalığı olan hastalardan elde edilen kontrol bireylerden elde edilen uyarılmış pluripotent kök hücreler arasındaki olası karşılaştırılması.

<html> Bu çalışmada IPSC türetilen piramidal nöronların kültür dendritlerin omurga ölçümü için standart bir protokol tanımlamaktadır. Bu protokol, insan omurga nöronlar üzerinde olgunlaşma ve standart kemirgen nöronal kültürlerinde dikenler olgunlaşması ve in vivo hayvan modellerinde ile olası karşılaştırma analizine izin verir. Şekil 1A kortikal piramidal nöronlar üretimine izin veren farklı kültür adımların bir düzeni temsil etm...

Watch this Scientific Journal Video about Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Piramidal nöronlar dendritik dikenleri memeli beyin korteksinde en uyarıcı sinaps sitelerdir. Bu yöntem, uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden elde edilen insan kortikal piramidal glutamaterjik nöronları omurga morfolojileri 3D kantitatif analiz açıklanır.

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş Piramidal Nöronlar gelen Dendritik Spine Üç boyutlu Niceleme

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

three-dimensional-quantification-dendritic-spines-from-pyramidal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.3K Görüntüleme.  Institut Pasteur.  Piramidal nöronlar dendritik dikenleri memeli beyin korteksinde en uyarıcı sinaps sitelerdir. Bu yöntem, uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden elde edilen insan kortikal piramidal glutamaterjik nöronları omurga morfolojileri 3D kantitatif analiz açıklanır. 

Video: Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.

This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.

Saç türetilmiş keratinositlerden Kullanarak Entegrasyon serbest İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

Gelişim Biyolojisi

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

Insan pluripotent kök hücreleri gelen melanosit besleyici içermeyen türetilmesi

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets of patients with metastatic melanoma. Major obstacles of this approach are the reduced viability of transferred T cells, caused by telomere shortening, and the limited number of TILs obtained from patients. Less-differentiated T cells with long telomeres would be an ideal T cell subset for adoptive T cell therapy;however, generating large numbers of these less-differentiated T cells is problematic. This limitation of adoptive T cell therapy can be theoretically overcome by using induced pluripotent stem cells (iPSCs) that self-renew, maintain pluripotency, have elongated telomeres, and provide an unlimited source of autologous T cells for immunotherapy. Here, we present a protocol to generate iPSCs using Sendai virus vectors for the transduction of reprogramming factors into TILs. This protocol generates fully reprogrammed, vector-free clones. These TIL-derived iPSCs might be able to generate less-differentiated patient- and tumor-specific T cells for adoptive T cell therapy.

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

İnsan Melanom tümör-süzücü lemfositler ile ilgili uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

Epizomal vektörlerin kullanılması insan periferik kan mononükleer hücrelerinden entegrasyon içermeyen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

Periferal Kan Türevi İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Kondrositlerin Farklılaşması

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. Currently, efforts are being made to regenerate damaged cartilage with ex vivo expanded chondrocytes or bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs). However, the restricted viability and instability of these cells limit their application in cartilage reconstruction. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have received scientific attention as a new alternative for regenerative applications. With unlimited self-renewal ability and multipotency, hiPSCs have been highlighted as a new replacement cell source for cartilage repair. However, obtaining a high quantity of high-quality chondrogenic pellets is a major challenge to their clinical application. In this study, we used embryoid body (EB)-derived outgrowth cells for chondrogenic differentiation. Successful chondrogenesis was confirmed by PCR and staining with alcian blue, toluidine blue, and antibodies against collagen types I and II (COL1A1 and COL2A1, respectively). We provide a detailed method for the differentiation of cord blood mononuclear cell-derived iPSCs (CBMC-hiPSCs) into chondrogenic pellets.

Here, we propose a protocol for chondrogenic differentiation from cord blood mononuclear cell-derived human induced pluripotent stem cells.

Kordon Kanından Oluşan İndüklü Pluripotent Kök Hücrelerden Kondrojenik Pellet Oluşumu

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Synaptic Microcircuit Modeling with 3D Cocultures of Astrocytes and Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying the human brain. One emerging technology to address this issue is the use of three dimensional (3D) neural cell cultures, termed &#39;organoids&#39; or &#39;spheroids&#39;, for long term preservation of intercellular interactions including extracellular adhesion molecules. However, these culture systems are time consuming and not systematically generated. Here, we detail a method to rapidly and consistently produce 3D cocultures of neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells. First, pre-differentiated astrocytes and neuronal progenitors are dissociated and counted. Next, cells are combined in sphere-forming dishes with a Rho-Kinase inhibitor and at specific ratios to produce spheres of reproducible size. After several weeks of culture as floating spheres, cocultures (&#39;asteroids&#39;) are finally sectioned for immunostaining or plated upon multielectrode arrays to measure synaptic density and strength. In general, it is expected that this protocol will yield 3D neural spheres that display mature cell-type restricted markers, form functional synapses, and exhibit spontaneous synaptic network burst activity. Together, this system permits drug screening and investigations into mechanisms of disease in a more suitable model compared to monolayer cultures.

In this protocol, we aim to describe a reproducible method for combining dissociated human pluripotent stem cell derived neurons and astrocytes together into 3D sphere cocultures, maintaining these spheres in free floating conditions, and subsequently measuring synaptic circuit activity of the spheres with immunoanalysis and multielectrode array recordings.

Sinaptik Microcircuit modelleme 3D Cocultures Astrocytes ve Neurons insan Pluripotent kök hücre ile

A barrier to our understanding of how various cell types and signals contribute to synaptic circuit function is the lack of relevant models for studying ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

3B cilt Organoid kablosu kan kaynaklı nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...