La ingeniería genética es una herramienta valiosa para modificar genomas de organismos modelo en un proceso conocido como transgénesis. En Biología del desarrollo, este enfoque se utiliza a menudo para expresar genes modificados que pueden visualizarse en los tejidos vivos. Como alternativa, la ingeniería genética puede utilizarse para impedir o interrumpir la expresión de la proteína para estudiar la función de genes específicos de desarrollo.
Este video se resumen los principios detrás de esta tecnología, revisar algunos procedimientos de ingeniería genética y maneras de resaltar que estas técnicas se utilizan en el laboratorio.
Para empezar, vamos a explorar algunos conceptos importantes subyacentes transgénesis. Esto implica la inserción de ADN en el genoma de un organismo modelo. Hay una serie de enfoques según el objetivo del estudio.
En primer lugar, además de un gene alterado pueden revelar cambios funcionales o morfológicos debido a una mutación. Otro método es poner en copias adicionales del gen de tipo salvaje inalterado para estudiar los efectos de la sobreexpresión, que a menudo puede ser igual de dañino como una mutación. Un enfoque diferente es introducir una proteína de fusión que contiene una etiqueta visualizable, como la proteína verde fluorescente, para rastrear el lugar y el momento de la expresión génica en animales vivos.
El segmento de ADN que se inserta en el genoma debe ser cuidadosamente diseñado para producir los patrones de expresión deseada y los resultados. El promotor, que es un elemento de la secuencia que dicta cuándo y dónde se expresa un gen, es un componente crucial. Algunos promotores ubicuo se expresan a lo largo de casi todos los tejidos, mientras que otros son sólo activos en tejidos específicos. Promotores inducibles, que son activados por la administración de química o exposición a altas temperaturas, pueden utilizarse también para controlar el tiempo de la expresión génica.
Para ser estable expresado en tejidos, un transgen primero debe integrarse en el genoma. Para lograr esto, los transgenes pueden incluir que flanquean las secuencias de ADN que coinciden con las zonas del genoma del organismo. Esto permite que el transgén a integrar con el anfitrión DNA a través de un proceso conocido como recombinación homóloga. Alternativamente, en algunas especies, elementos especiales llamados transposones pueden hacer que el transgénesis más eficientes incluyendo sitios de reconocimiento para la enzima transposasa, que cataliza la inserción al azar del transgen en el genoma.
Ahora que conoces algunos de los fundamentos de diseño de transgen, vamos a revisar cómo hacer un animal transgénico. Para hacer el transgén construir, comience por amplificar el gen de interés mediante PCR. Esta región amplificada luego se clona en un vector, que es un pedazo de ADN que puede llevar el transgén en las células. Vectores típicamente contienen elementos que permiten la amplificación eficiente del transgen mediante bacterias como e. coli. Después de este paso de amplificación, el vector es purificado de la cultura bacteriana.
Animales transgénicos se realizan mediante la inyección de DNA purificado en embriones. En los peces y las ranas, las construcciones generalmente se inyecta directamente en la yema de huevo o citoplasma de embriones en estadío de una célula. Por transgénesis mediada por transposones, una transcripción que codifican la enzima transposasa se agrega a la mezcla de inyección.
En ratones, es posible transgénesis por manipulación de huevos recién fertilizados en que los pronúcleos del espermatozoide y el óvulo todavía no han fundido. La construcción se inyecta directamente en el pronucleo más grande, donde puede integrarse en el genoma como la célula se divide. Los huevos deben trasplantarse luego en el útero de una hembra seudopreñada para el desarrollo.
Eficiencia de la transgénesis varía, por lo animales deben ser examinados para identificar en que la construcción ha integrado con éxito en el genoma de la progenie. Esto puede hacerse buscando una etiqueta fluorescente que fue insertada para facilitar la identificación, o a través de análisis moleculares como la PCR de DNA genómica aislado de pedazos pequeños de tejido.
Un segundo enfoque de la ingeniería genética se centra en gen específico dirigido a para interrumpir la función génica. Existen múltiples enfoques para lograr este objetivo. Un método relativamente nuevo, conocido como la edición del genoma, aprovecha de secuencia específico enzimas llamadas nucleasas, que corta la espina dorsal de la DNA y causan mutaciones en los genes, el ADN se repara.
Otro método de segmentación consiste en el uso de la recombinación homóloga para reemplazar un gen con ADN extraño o bien o una copia del gen flanqueado por secuencias de reconocimiento para las enzimas conocidas como recombinasas. Cuando las recombinasas están presentes, la secuencia flanqueada será suprimida desde el genoma. Esto se conoce como un condicional knockout, y control de la supresión del gen se logra expresar la enzima en tejidos específicos o en ciertos puntos del tiempo.
Vamos a revisar un procedimiento general para la generación de ratones knockout por recombinación homóloga. Aquí, una construcción debe ser preparada en que parte del ADN genómico secuencia se sustituye por ADN extraño. Este ADN codifica a menudo otro gen, como para la resistencia a los antibióticos, que proporciona una manera para seleccionar exitosamente modificado células en pasos posteriores.
Para comenzar el procedimiento, las células madre embrionarias son recogidas de la masa celular interna de un embrión temprano de ratón conocido como blastocisto. La construcción lineal entonces se entrega a las células a través de electroporación, en la que impulsos eléctricos generan poros transitorios en la membrana celular. Las células entonces se permiten incubar en presencia de un antibiótico para eliminar las células sin el transgen.
Después de este paso de selección, se puede inyectar las células madre en otro embrión de ratón en la fase de blastocisto. Los embriones se transfieren al útero de un ratón hembra para continuar con el desarrollo. Las crías resultantes serán quimeras, que se componen de células de tipo salvaje y golpe de gracia. Algunas quimeras tendrá células de octavos de final dentro de su línea germinal, que transmitirá el gen interrumpido cuando se crían, que luego se establecerá una nueva línea de octavos de final.
Han aprendido los conceptos básicos de genética de la ingeniería de modelos de desarrollo, así que ahora vamos a ven algunas aplicaciones prácticas.
Estudios del desarrollo suelen ser proteínas fluorescente etiquetas para identificar las células y estudiar su desarrollo. Uso de promotores específicos de tejido, organismos transgénicos pueden diseñarse a proteínas fluorescentes expresa en células específicas, como la cresta neural. Utilizando técnicas de imagen avanzadas, las células fluorescentes pueden ser reflejadas en tiempo real, permitiendo a los investigadores visualizar directamente eventos de desarrollo complejo.
Otro uso importante de la ingeniería genética es el estudio de genes específicos y su papel en fenotipos de la enfermedad. Aquí, se introducen mutaciones específicas en un gen de ratón específicos con nucleasas, como TALENs. PCR se muestra si el ratón tiene cero, una o dos copias del gen mutado. Los embriones que llevan dos copias mutantes ahora pueden ser estudiados en detalle para determinar la función del desarrollo del gen.
Usando el condicionales nocauts, los científicos pueden determinar la función de un gen dentro de un conjunto restringido de las células. Aquí, un gen flanqueado loxP se expresó en todo el embrión entero, pero Cre fue expresado en las células endoteliales, causando una canceladura del gene en el corazón y los vasos sanguíneos. Este tejido-específica resultó en un cambio mensurable en la frecuencia cardíaca embrionaria y muestra cómo poner a prueba la función localizada de un gen sin alterar todo el organismo.
Sólo ha visto la introducción de Zeus a la tecnología transgénica. Estas técnicas le ayudarán a entender los conceptos básicos de la ingeniería genética, algunos de los métodos que intervienen, y cómo se aplica en ciencia cotidiana. Ingeniería genética pueden aplicarse extensamente a través de muchos organismos y seguirá siendo una herramienta importante para estudiar y entender el papel de la genética en enfermedades del desarrollo, así como los que aparecen durante la edad adulta. ¡Gracias por ver!
