Biólogos del desarrollo usan la asignación sino como una herramienta para linajes celulares de rastro mientras que un organismo madura. Esto se hace por el etiquetado de células en una fase embrionaria y luego seguimiento de ellos y su progenie en todo el desarrollo del organismo. Asignación de destino también se utiliza para estudiar la migración celular y la diferenciación durante el desarrollo, así como la regeneración y reparación durante la vida adulta.
Este video proporciona una visión general de asignación de destino, explicar un protocolo que se utiliza para generar un mapa de destino en el pez cebra y muestran algunas formas en que actualmente se está aplicando esta técnica en los laboratorios.
Antes de saltar en los detalles de procedimiento, vamos a discutir lo que un mapa de destino es y cómo se construye.
En clásico sino asignación de experimentos, los científicos tiñen grupos de células en un embrión, como en la etapa de gástrula, con un tinte que pasarían a todos los descendientes de estas células. Después de permitir que el embrión a desarrollar durante un tiempo, han consultado las células en el organismo más maduro. Luego se observó la localización de células en el organismo maduro. Se combinaron los resultados de varios experimentos similares permitidos la construcción de un diagrama conocido como mapa de destino.
Por lo tanto, un mapa de destino es un plan general que describe el destino de cada parte de un embrión temprano. Estos mapas ayudan a los científicos a determinar cosas como que las células embrionarias se diferencian en que las células adultas funcionales, y cómo migrar y organizar en estructuras maduras.
Los científicos han utilizado muchos organismos modelo para crear mapas de destino, incluyendo ranas, nematodos, pescados, pollos y ratones. Algunos organismos modelo, como el pez cebra Danio rerio, tienen una ventaja adicional en este tipo de experimento. Desde que son pequeños y permanecen transparentes durante gran parte del proceso de desarrollo, los científicos pueden controlar fácilmente células consultando el pescado bajo un microscopio de luz. Lo importante, avances en técnicas de etiquetado ahora la célula permiten a los científicos precisamente marcar celdas individuales y trazarlos a medida que se desarrolla el organismo, que ayuda en la creación de un mapa extremadamente detallado del destino.
Ahora que tienes una idea sobre lo que el destino los mapas son, vamos a discutir un protocolo para la asignación de destino en el pez cebra que utiliza fotoactivación. Este relativamente nuevo enfoque depende de las proteínas photoactivatable. Estas son las proteínas fluorescentes especiales, que están "enjauladas," lo que significa que se llevan a cabo en una conformación específica para evitar la fluorescencia. Una aplicación de un pulso de láser controlado provoca un cambio conformacional, conocido como "uncaging", que resulta en fluorescencia visible.
Para realizar este experimento, estas proteínas especializadas enjauladas se sintetizan primero y luego inyectadas en embriones de pez cebra de etapa de células de uno o dos. A continuación, los embriones pueden madurar hasta la etapa de desarrollo deseada antes de fotoactivación.
Entonces, para preparar el pescado para la fotoactivación, los embriones son dechorionated para hacer accesible el tejido diana. A continuación, se montan en un medio ópticamente claro, tales como baja fusión agarosa de temperatura, que con seguridad les mantiene en una posición estable. Las muestras son alineadas para exponer el área de interés y montadas en un microscopio equipado con láser. Un pulso de láser se aplica a las células que contienen específica área de interés, inducir la fotoactivación.
Tras el tratamiento con láser, embriones cuidadosamente se quitan de la agarosa y devuelto a su medio natural hasta llega a la etapa de desarrollo deseada. Para rastrear las células Fotoactivado, embriones se integran otra vez en baja fusión agarosa de temperatura, y las células de fotoactivado luego pueden visualizarse y rastrearla con fluorescencia directa o immunostaining.
Ahora que tienes una comprensión global de un protocolo de asignación de destino, echemos un vistazo a algunos experimentos de laboratorio que se aprovechan de este procedimiento.
Además de estudiar el desarrollo embrionario, asignación de destino puede utilizarse para examinar la reparación en los sistemas maduros. En este experimento, fue quitado por ablación de una retina de pez cebra transgénico un subtipo específico de la célula. Los científicos entonces remontados genéticamente marcado residente células madre adultas para decidir su destino después de lesión. Finalmente, análisis de imágenes fue realizada, que demostró la activación de las células madre adultas y reparación de tejidos posterior.
Los científicos también están utilizando protocolos similares para entender el destino de las células madre trasplantadas. Aquí, con la etiqueta genéticamente células madre embrionarias humanas, o hESCs, se trasplantaron en un modelo en ratones inmunodeprimidos. Las células implantadas se permitieron diferenciar durante 8-12 semanas, tras lo cual el teratoma resultante, que es un tumor que contiene tejido de múltiples capas del germen, se cosechó, fijo y immunostained para determinar el destino de implanta las células madre. Este tipo de experimento ayuda a los científicos para confirmar el potencial differentiative en vivo de las células madre cultivadas.
Como se mencionó anteriormente, los científicos realizan procedimientos de asignación de destino en diversos organismos modelo, incluyendo los mamíferos. En este estudio en particular, los científicos marcaron las células en una región específica de un embrión temprano de ratón usando el enfoque genético inducible. Esto se hace mediante la administración de un agente inductor a un ratón embarazado llevando descendencia genéticamente modificado. Las células marcadas fueron seguidas a lo largo de etapas tardías del desarrollo, que ayudó a los científicos a determinar su destino final.
Sólo has visto video de Zeus en la asignación de destino. Este video proporciona una idea en la creación de mapas de destino, repasa un destino específico protocolo de mapeo y discute algunas de las modificaciones y aplicaciones de esta técnica muy útil. ¡Como siempre, gracias por ver!
