L'ingegneria genetica è uno strumento prezioso utilizzato per modificare i genomi degli organismi modello in un processo noto come transgenesi. Nella biologia dello sviluppo, questo approccio è spesso usato per esprimere geni modificati che possono essere visualizzati nei tessuti viventi. In alternativa, l'ingegneria genetica può essere utilizzata per prevenire o interrompere l'espressione proteica per studiare la funzione di sviluppo di geni specifici.
Questo video riassumerà i principi alla base di questa tecnologia, esaminerà alcune procedure di ingegneria genetica ed evidenzierà i modi in cui queste tecniche vengono utilizzate in laboratorio.
Per iniziare, esploriamo alcuni concetti importanti alla base della transgenesi. Ciò comporta l'inserimento di DNA nel genoma di un organismo modello. Ci sono un certo numero di approcci a seconda dell'obiettivo dello studio.
In primo luogo, l'aggiunta di un gene alterato potrebbe rivelare cambiamenti funzionali o morfologici dovuti a una mutazione. Un altro metodo consiste nell'inserire copie aggiuntive del gene wild-type inalterato per studiare gli effetti della sovraespressione, che spesso può essere dannosa quanto una mutazione. Un approccio diverso consiste nell'inserire una proteina di fusione che contiene un tag visualizzabile, come la proteina fluorescente verde, per tracciare la posizione e i tempi dell'espressione genica negli animali vivi.
Il segmento di DNA che verrà inserito nel genoma deve essere attentamente progettato per produrre i modelli di espressione e i risultati desiderati. Il promotore, che è un elemento di sequenza che determina quando e dove un gene è espresso, è una componente cruciale. Alcuni promotori sono espressi ubiquitariamente in quasi tutti i tessuti, mentre altri sono attivi solo in tessuti specifici. I promotori inducibili, che vengono attivati dalla somministrazione chimica o dall'esposizione a temperature elevate, possono anche essere utilizzati per controllare i tempi di espressione genica.
Per essere espresso stabilmente nei tessuti, un transgene deve prima integrarsi nel genoma. Per raggiungere questo obiettivo, i transgeni possono includere sequenze di DNA fiancheggianti che corrispondono ad aree del genoma dell'organismo. Ciò consente al transgene di integrarsi con il DNA ospite attraverso un processo noto come ricombinazione omologa. In alternativa, in alcune specie elementi speciali chiamati trasposoni possono rendere la transgenesi più efficiente includendo siti di riconoscimento per la trasposasi enzimatica, che catalizza l'inserimento casuale del transgene nel genoma.
Ora che conosci alcune delle basi del design transgenico, esaminiamo come creare un animale transgenico. Per realizzare il costrutto transgenico, inizia amplificando il gene di interesse usando la PCR. Questa regione amplificata viene quindi clonata in un vettore, che è un pezzo di DNA che può trasportare il transgene nelle cellule. I vettori contengono tipicamente elementi che consentono un'efficiente amplificazione transgene utilizzando batteri, come E. coli. Dopo questa fase di amplificazione, il vettore viene purificato dalla coltura batterica.
Gli animali transgenici sono fatti iniettando DNA purificato negli embrioni. Nei pesci e nelle rane, i costrutti vengono solitamente iniettati direttamente nel tuorlo o nel citoplasma degli embrioni a una cellula. Per la transgenesi trasposona-mediata, un trascritto che codifica l'enzima transposasi viene aggiunto alla miscela di iniezione.
Nei topi, la transgenesi può essere realizzata mediante la manipolazione di uova appena fecondate in cui lo sperma e i pronuclei dell'uovo non si sono ancora fusi. Il costrutto viene iniettato direttamente nel pronucleo più grande, dove può integrarsi nel genoma mentre la cellula si divide. Le uova devono quindi essere trapiantate nell'utero di una femmina pseudogravia per lo sviluppo.
L'efficienza della transgenesi varia, quindi gli animali devono essere sottoposti a screening per identificare la progenie in cui il costrutto si è integrato con successo nel genoma. Questo può essere fatto cercando un tag fluorescente che è stato inserito per una facile identificazione, o attraverso analisi molecolari come la PCR del DNA genomico isolato da piccoli pezzi di tessuto.
Un secondo approccio all'ingegneria genetica si concentra sul targeting genetico specifico per interrompere la funzione genica. Esistono diversi approcci per raggiungere questo obiettivo. Un metodo relativamente nuovo, noto come genome editing, sfrutta enzimi specifici della sequenza chiamati nucleasi, che tagliano la spina dorsale del DNA e causano mutazioni nei geni mentre il DNA viene riparato.
Un altro metodo di targeting prevede l'uso della ricombinazione omologa per sostituire un gene con DNA estraneo o una copia del gene affiancata da sequenze di riconoscimento per enzimi noti come ricombinasi. Quando le ricombinasi sono presenti, la sequenza affiancata verrà asportata dal genoma. Questo è noto come knockout condizionale e il controllo dell'escissione genica può essere ottenuto esprimendo l'enzima in tessuti specifici o in determinati punti temporali.
Esaminiamo una procedura generale per generare topi knockout mediante ricombinazione omologa. Qui, deve essere preparato un costrutto in cui parte della sequenza di DNA genomico viene sostituita con DNA estraneo. Questo DNA spesso codifica per un altro gene, ad esempio per la resistenza agli antibiotici, che fornisce un modo per selezionare con successo le cellule modificate nelle fasi successive.
Per iniziare la procedura, le cellule staminali embrionali vengono raccolte dalla massa cellulare interna di un embrione di topo precoce noto come blastocisti. Il costrutto linearizzato viene quindi consegnato nelle cellule staminali tramite elettroporazione, in cui gli impulsi elettrici generano pori transitori nella membrana cellulare. Le cellule sono quindi autorizzate a incubare in presenza di un antibiotico per eliminare le cellule senza il transgene.
Dopo questa fase di selezione, le cellule staminali possono essere iniettate in un altro embrione di topo allo stadio di blastocisti. Gli embrioni vengono quindi trasferiti nell'utero di un topo femmina per continuare lo sviluppo. I cuccioli risultanti saranno chimere, che sono composte sia da cellule wild-type che knockout. Alcune chimere avranno cellule knockout all'interno della loro linea germinale, che trasmetteranno il gene interrotto quando vengono allevate, che stabiliranno quindi una nuova linea di knockout.
Hai imparato le basi dell'ingegneria genetica dei modelli di sviluppo, quindi ora diamo un'occhiata ad alcune applicazioni pratiche.
Gli studi sullo sviluppo spesso utilizzano proteine marcate fluorescentemente per identificare le cellule e studiarne lo sviluppo. Utilizzando promotori tessuto-specifici, gli organismi transgenici possono essere progettati per esprimere proteine fluorescenti in cellule specifiche, come la cresta neurale. Utilizzando tecniche di imaging avanzate, le cellule fluorescenti possono essere visualizzate in tempo reale, consentendo ai ricercatori di visualizzare direttamente eventi di sviluppo complessi.
Un altro uso importante dell'ingegneria genetica è quello di studiare geni specifici e il loro ruolo nei fenotipi delle malattie. Qui, le mutazioni mirate vengono introdotte in uno specifico gene di topo usando nucleasi, come i TALEN. La PCR mostra se il topo ha zero, una o due copie del gene mutato. Gli embrioni che trasportano due copie mutanti possono ora essere studiati in dettaglio per determinare la funzione di sviluppo del gene.
Usando knockout condizionali, gli scienziati possono determinare la funzione di un gene all'interno di un insieme ristretto di cellule. Qui, un gene loxP-flanked è stato espresso in tutto l'embrione, ma Cre è stato espresso solo nelle cellule endoteliali, causando una delezione genica nel cuore e nei vasi sanguigni. Questo knockout tessuto-specifico ha provocato un cambiamento misurabile nella frequenza cardiaca embrionale e illustra come testare il ruolo localizzato di un gene senza cambiare l'intero organismo.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla tecnologia transgenica. Queste tecniche ti aiutano a capire le basi dell'ingegneria genetica, alcuni dei metodi coinvolti e come viene applicata nella scienza di tutti i giorni. L'ingegneria genetica può essere ampiamente applicata in molti organismi e continuerà ad essere uno strumento importante per studiare e comprendere il ruolo della genetica nelle malattie dello sviluppo, così come quelle che compaiono durante l'età adulta. Grazie per l'attenzione!
