발달 생물학자는 유기체가 성숙하는 동안 세포 혈통을 추적하는 도구로 운명 매핑을 사용합니다. 이것은 배아 단계에서 세포를 표지하고 유기체의 발달을 통해 그(것)들과 그들의 자손을 추적하여 행해질 것입니다. 운명 매핑은 또한 발달 도중 세포 이동 및 분화를 연구하고, 성인기 도중 재생 및 복구를 공부하는 것을 이용합니다.

이 비디오는 운명 매핑에 대한 개요를 제공하고, 제브라피시에서 운명 맵을 생성하는 데 사용되는 프로토콜을 설명하고, 이 기술이 현재 실험실에서 적용되고 있는 몇 가지 방법을 보여줍니다.

절차 적 세부 사항에 뛰어 들기 전에 운명지도가 무엇이며 어떻게 구성되었는지 에 대해 논의해 보겠습니다.

고전적인 운명 매핑 실험에서 과학자들은 가스트룰라 단계와 같은 초기 배아의 세포 그룹을 염색했으며, 이 세포의 모든 후손에 전달될 염료를 가지고 있습니다. 배아가 일정 기간 동안 발전하도록 허용한 후, 그들은 더 성숙한 유기체에서 얼룩진 세포를 보았다. 성숙한 유기체에 있는 염색한 세포의 위치는 그 때 주의되었습니다. 몇 가지 유사한 실험의 풀화 된 결과는 운명지도로 알려진 다이어그램의 건설을 허용했다.

따라서, 운명지도는 초기 배아의 각 부분의 운명을 설명하는 전반적인 계획입니다. 이 지도는 과학자가 어떤 배아 세포가 어떤 기능성 성인 세포로 분화하는지, 그리고 성숙한 구조물로 이동하고 구성하는 방법 같이 것을 결정하는 것을 돕습니다.

과학자들은 개구리, 선충, 물고기, 병아리 및 마우스를 포함한 운명지도를 만들기 위해 많은 모델 생물을 사용했습니다. 제브라피쉬 다니오 리리오와같은 일부 모델 유기체는 이러한 유형의 실험에서 추가적인 이점이 있습니다. 그들은 작고 발달 과정의 대부분에 대한 투명 남아 있기 때문에, 과학자들은 쉽게 가벼운 현미경에서 물고기를 보고 세포를 추적 할 수 있습니다. 중요한 것은, 세포 라벨기 기술의 발전은 지금 과학자가 정확하게 단 하나 세포를 표시하고 유기체가 발전할 때 그(것)들을 추적할 수 있게 합니다, 이는 매우 상세한 운명 지도의 창조에 있는 것을 돕습니다.

이제 운명지도가 무엇인지에 대한 아이디어를 가지고 있으므로 사진 활성화를 사용하는 제브라피시의 운명 매핑 프로토콜에 대해 논의해 보겠습니다. 이 상대적으로 새로운 접근은 광액성 단백질에 달려 있습니다. 이들은 "케이지"인 특별한 형광 단백질이며, 이는 형광을 방지하기 위해 특정 형태로 유지된다는 것을 의미합니다. 제어된 레이저 펄스의 적용은 눈에 보이는 형광을 초래하는 "caging"라고 불리는 형태 변화를 일으킵니다.

이 실험을 수행하기 위해, 이러한 전문 케이지 단백질은 먼저 합성된 다음 하나 또는 두 개의 세포 단계 제브라피시 배아로 주입됩니다. 다음으로, 배아는 포토활성화 전에 원하는 발달 단계로 성숙할 수 있다.

그런 다음, 광활성화를 위해 물고기를 준비하기 위해, 배아는 표적 조직에 접근할 수 있도록 비반향된다. 다음으로, 저용온 아가로즈와 같은 광학적으로 맑은 매체에 장착되어 안정적으로 유지합니다. 샘플은 관심 영역을 노출하도록 정렬되고 레이저 장착 현미경에 장착됩니다. 레이저 펄스는 관심 있는 세포를 포함하는 표적 영역에 적용되어 광활성화를 유도합니다.

레이저 처리에 따라, 배아는 아가로즈에서 신중하게 제거되고 원하는 발달 단계에 도달할 때까지 그들의 자연적인 환경으로 돌아갑니다. 광활성화 세포를 추적하기 위해 배아는 다시 낮은 용융 온도 아가로즈에 내장되어 있으며, 광활성화 세포는 직접 형광 또는 면역 스테인닝을 사용하여 시각화및 추적될 수 있다.

이제 운명 매핑 프로토콜에 대한 전반적인 이해가 되었으므로 이 절차를 활용하는 몇 가지 실험실 실험을 살펴보겠습니다.

배아 발달을 연구하는 것 외에도, 운명 매핑은 성숙한 시스템에서 수리를 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 이 실험에서, 특정 세포 아류형은 형질전환 제브라피시 망막에서 abLATED하였다. 과학자는 그 때 상해 다음 그들의 운명을 결정하기 위하여 유전으로 표지된 상주 성인 줄기 세포를 추적했습니다. 마지막으로, 성인 줄기 세포의 활성화와 후속 조직 수리를 입증 한 이미지 분석이 수행되었습니다.

과학자들은 또한 이식 된 줄기 세포의 운명을 이해하기 위해 유사한 프로토콜을 사용하고 있습니다. 여기서, 유전적으로 태그된 인간 배아 줄기 세포, 또는 hESC는 면역 타협마우스 모델로 이식되었다. 이식된 세포는 8-12주 동안 분화할 수 있었고, 그 다음 에 잇따른 세균층으로부터 조직을 포함하는 종양인 결과 기종종은 이식된 줄기세포의 운명을 결정하기 위해 수확, 고정 및 면역염색되었다. 실험의 이 모형은 과학자가 배양된 줄기 세포의 생체 내 분화 잠재력을 확인하는 것을 돕습니다.

앞서 언급했듯이 과학자들은 포유류를 포함한 다양한 모형 유기체에서 운명 매핑 절차를 수행합니다. 이 특정 연구에서, 과학자는 유도할 수 없는 유전 접근을 사용하여 초기 마우스 태아의 특정 지구에 있는 세포를 표시했습니다. 이것은 유전자 변형 자손을 운반하는 임신 한 마우스에 유도제를 투여하여 수행됩니다. 표지된 세포는 과학자들이 궁극적인 운명을 결정하는 것을 도운 나중에 발달 단계를 통해 추적되었습니다.

당신은 운명 매핑에 JoVE의 비디오를 보았다. 이 비디오는 운명 맵을 만드는 데 대한 통찰력을 제공하고, 특정 운명 매핑 프로토콜을 검토하고, 이 매우 유용한 기술의 수정 및 응용 프로그램에 대해 논의했습니다. 언제나처럼, 시청주셔서 감사합니다!