D.M.O. acknowledges European Research Council grant No. 337187 and the Marie-Curie Career Integration Grant No. 334303. P.W.W. acknowledges the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada's Discovery Grant program.

Nota: Etapas 1 y 2 tienen lugar antes del día de las imágenes; asegurar que todos los medios de comunicación y los suplementos a utilizar antes o el día de la proyección de imagen se equilibran. Equilibrado se consigue mediante el calentamiento de los medios de comunicación y los suplementos a 37 ° C en una incubadora con 5% de CO 2. Todas las etapas de trabajo de cultivo celular y cubreobjetos de chapado se llevan a cabo en condiciones estériles en una campana de flujo laminar. La transfección 1. celular <ol><li> Transfectar las células T para obtener imágenes 24 hr antes del experimento con un plásmido que codifica una fusión fluorescente construir para el etiquetado GFP F-actina y formación de imágenes. Nota: Las células deben dividirse las 24 horas antes de la transfección (48 horas antes de la proyección de imagen) para asegurar las células están en óptima salud y en su fase de crecimiento logarítmico. <ol><li> Colocar 5 ml de suplemento de RPMI (RPMI 1640 más del 10% de FBS y 1% Pen-Strep (opcional)) en un solo pocillo de una placa de 6 pocillos en la incubadora se equilibre. </li><li> Pellet 2 x 10 7 células T cultoured a 37 ° C 5% de CO 2 en el suplemento RPMI usando un tubo de centrífuga a 327 xg durante 5 min y lavar en un volumen igual de medio de electroporación pre-calentado. Nota: medio electroporación es un medio de suero reducido que contiene tampones y suplementos (ver consumibles). </li><li> Después de volver a la granulación a 327 xg durante 5 min, resuspender las células en 500 l de medios de electroporación y se añade lentamente a una cubeta, añadir 5 g de plásmido en dH 2 O de grado PCR para el etiquetado de F-actina. </li><li> Golpee suavemente la cubeta en el espacio de trabajo de la campana para asegurar la eliminación de las burbujas de aire en los medios de comunicación, que pueden causar la formación de arcos de la electricidad y para distribuir las células uniformemente dentro de los medios de comunicación. </li><li> Encienda el aparato de electroporación y el voltaje ajustado a 300 V y la capacitancia a 290 Ω. Muestra electroporar utilizando un decaimiento exponencial durante 20 ms. Nota: Optimización puede ser necesaria para las diferentes células y diferentes construcciones de plásmidos. </li><li> Una vez que el protocolo de transfección escompletos, almacenar células en hielo durante 1 min antes de continuar. </li><li> Transferir cuidadosamente las células de la cubeta a la placa de 6 pocillos que contiene 5 ml de suplemento de RPMI equilibrada desde el paso 1.1.1. </li><li> Se incuban las células O / N a 37 ° C + 5% de CO 2. </li></ol></li></ol> 2. Cubreobjetos Coat y Pre-caliente Suplemento Imaging <ol><li> Cubreobjetos capa con anticuerpos para inducir la estimulación de células T. <ol><li> Escudo cada cámara de un cubreobjetos 8 pocillos con 1 mg / ml αCD3 y αCD28 en 200 l de PBS. </li><li> Almacenar a 4 ° CO / N. Alternativamente, cubreobjetos capa 2 horas antes de la proyección de imagen y mantienen en una incubadora a 37 ° C para reducir la deriva durante el proceso de formación de imágenes, minimizando los cambios de temperatura en el cubreobjetos. </li></ol></li><li> Crear una muestra de prueba cubreobjetos con microesferas fluorescentes 0,1 micras sub-difracción. <ol><li> Vortex solución madre de los granos para evitar grumos. </li><li> En una nueva, cubreobjetos limpio de le mismo tipo que los utilizados en el paso 2.1.1, pipeta de 5 l de microesferas fluorescentes solución madre sobre la superficie (según las instrucciones del fabricante). </li><li> Corre solución de microesferas sobre el cubreobjetos con punta de la pipeta. </li><li> Deje que se seque, luego aplique 200 l medio de montaje tales como PBS. Nota: el medio de montaje debe coincidir con la utilizada para muestras de células de imágenes. </li></ol></li><li> Equilibrar HBSS (+ 20 mM HEPES, en adelante denominado &quot;suplemento HBSS &#39;) en un tubo de centrífuga colocando en una incubadora O comprobar la validez de frío / N a 37 ° C + 5% de CO 2. Nota: la adición de HEPES es para amortiguar CO 2, si se utiliza una cámara de incubación con CO 2 de entrada saltarse esta suplementación. </li></ol> 3. Microscopio Set-up <ol><li> Encienda la incubadora de etapa superior del microscopio y lugar suficiente agua destilada TIRF-SIM en el depósito del microscopio para cubrir la totalidad de la base del elemento de calefacción. Deje que el agua Equilibrate a 37 ° C. Añadir el collar de calentamiento a la lente objetivo, también se establece en 37 ° C. Nota: Debido a la sensibilidad de la puesta a punto, estos pasos se llevan a cabo la noche anterior para los componentes ópticos están a una temperatura estable antes de la imagen. </li><li> Coloque el TIRF 488 bloque de rejilla compatible en la trayectoria de la luz del microscopio y seguro en su lugar. <ol><li> Cambie el modo de canal y el cable de fibra a la posición &#39;Individual&#39; en el escenario cama láser y microscopio, respectivamente, para acoplarse a la trayectoria óptica correcta para el modo TIRF-SIM. Nota: Saltarse este paso dará lugar a un error (Figura 1 A) dentro de la ventana del software. </li></ol></li><li> Encienda todos los componentes del microscopio y la computadora y abrir el software de control de la adquisición. <ol><li> Abra el panel de OC, Ti Pad, N-SIM Pad y ND Adquisición ventanas (Figura 1B). En el &#39;Panel de OC&#39; seleccione la opción &#39;TIRF 488&#39; (Figura 2B, flecha amarilla). </li&gt; <li> En la ventana N-SIM Pad, seleccione el &#39;TIRF-SIM &quot;y ajustes&#39; Moving &#39;(Figura 2C, flechas amarillas). Seleccione el botón de configuración (Figura 1C, caja amarilla) y seleccione &#39;TIRF 488 (de 100x TIRF 488 nm)&#39; en el menú desplegable, de favoritos Aplicar &#39;y&#39; OK &#39;. </li><li> Establezca los ajustes de la cámara dentro de los &#39;ajustes&#39; DU897 a: Velocidad de cuadros 50 ms, modo de lectura, EM Ganancia 3 MHz a 14 bits, y EM Ganancia multiplicador 300 con una ganancia de conversión de 1 (Figura 1C, caja verde). Nota: Véase representativos Resultados para consideraciones de velocidad de cuadro. </li><li> Calibrar la iluminación del microscopio para TIRF-SIM seleccionando el objetivo 100x 1,49 NA CFI Apocromático TIRF, en la &#39;N-SIM Pad&#39; gire a la potencia del láser 488 nm a 10%. Nota: tamaño de píxel de las imágenes en bruto es 60 nm, con un campo de 512 x 512 pixel de vista. </li><li> Limpie la lente del objetivo utilizando tejido de lentes para eliminar el polvo y el aceite. </li></ol></li&gt; <li> Encuentra el plano focal TIRF-SIM. <ol><li> Comience con el objetivo de la posible plano z más bajo. Coloque una gota de aceite de la lente del objetivo y añadir la muestra de microesferas fluorescentes desde el paso 2.2 de la platina del microscopio. </li><li> Seleccione la función Perfect Sistema de enfoque (PFS), ubicado en el cuerpo del microscopio. </li><li> Mueva lentamente el objetivo a través del plano z hasta que el botón PFS deja de parpadear para confirmar el plano focal se ha alcanzado. </li><li> Cambie a la vista &#39;en vivo&#39; en el software de control y la imagen de las microesferas para ajustes finales realizados mediante el uso de la rueda de micro-manipulador PFS. </li></ol></li><li> Observe la iluminación uniforme sin emisión de fluorescencia fuera de foco por encima de la onda evanescente 75 nm. Nota: Confirme iluminación estructurada se cumple mediante la observación de un patrón de iluminación fluctuante de la muestra de microesferas fluorescentes. </li><li> Mida la muestra de microesferas fluorescentes y cuantificar la resoluc de imagen mejoradaión observando la anchura a media altura (FWHM) del perfil de intensidad. <ol><li> Abra el software Analizar (v4.20.01), con el módulo de NIS-N-SIM Análisis instalada y seleccione &quot;Aplicaciones&quot; -&gt; &quot;ventana demostración N-SIM&quot;. </li><li> Con el contraste de modulación de iluminación (IMC) y supresión de ruido de alta resolución (HRNS) se establece en 1 para conjuntos de datos TIRF-SIM (Figura 2), reconstruir la imagen de la muestra de microesferas para generar una imagen reconstruida de 1.024 x 1.024 píxeles con un tamaño de píxel de 30 Nuevo Méjico. </li><li> Con la herramienta perfil de la línea con un ancho de 1 píxel (Figura 3A, caja amarilla), trazar una línea a través del centro de un solo microesfera. </li><li> Seleccione el botón FWHM (Figura 3B, caja amarilla) y haga clic en los máximos de intensidad de la distribución de Gauss, seguido por su minima intensidad. </li><li> Confirmar la FWHM de la microesfera está en el intervalo de 100 nm (Figura 3C). Nota: la resolución achCuando la imagen muestras biológicas ieved variarán dependiendo de la relación señal a ruido de la eficiencia del etiquetado y la fluorescencia de fondo. </li></ol></li></ol> 4. Preparación de muestras para Imaging <ol><li> Preparación Coverslip. <ol><li> Recuperar cubreobjetos recubiertos de αCD desde el paso 2.1 de la nevera o incubadora y eliminar PBS que contenía αCD3 y αCD28 de cada pocillo. </li><li> Añadir 200 l de HBSS suplemento pre-calentado desde el paso 2.3 a cada pocillo de la cubreobjetos. Lavar y quitar para asegurar una mínima αCD3 y αCD28 se deja en solución. Añadir otros 200 l de HBSS el suplemento a los pocillos de cubreobjetos. </li><li> Limpie la parte inferior del cubreobjetos con papel para lentes para eliminar el aceite y las partículas. </li></ol></li><li> Posición cubreobjetos sobre la platina del microscopio y encontrar el plano focal TIRF del cubreobjetos usando el plano z PFS como se encuentra en el paso 3.4. </li><li> Preparación de las células. <ol><li> Pipetear 200 l de la con los medios de comunicacióncontienen células transfectadas del paso 1.1.8 en un tubo de microcentrífuga. </li><li> Células de pellets en un micro-centrifugar a 268 xg durante 20 segundos y retirar medios celulares. </li><li> Resuspender las células en 200 l precalentado suplemento HBSS desde el paso 2.3. </li></ol></li></ol> 5. Las células Imaging <ol><li> Tome suplemento de HBSS que contiene células al microscopio y la pipeta suavemente 200 l en uno de los pozos. </li><li> Si bien se mantiene en el plano focal TIRF en el cubreobjetos (en el modo SLP), utilice el ocular microscopios de epifluorescencia y la iluminación para rastrear células fluorescentes se aproximan a la cubreobjetos. </li><li> Una vez que las células de la tierra en el cubreobjetos, cambie al modo &#39;Live&#39; en la N-SIM cojín para que la imagen en el monitor y compruebe las células están en el foco en la pantalla del ordenador. </li><li> Para registrar los tiempos de los cursos, abra la ventana ND Adquisición y seleccione la pestaña &#39;Time&#39;, haga clic en &quot;Añadir&quot; y establecer &#39;Intervalo&#39; en Sin demora, &#39;Duración&#39;a 10 minutos, &#39;Loops&#39; se establece en 1. Nota: La duración puede ser cambiado dependiendo del proceso de interés; el software STICS puede extraer resultados cuantitativos con pilas de imágenes de ≈10 marcos cuando fue capturado con &#39;No Delay&#39;. </li><li> Con los ajustes de adquisición idénticos a la muestra de cuentas, iniciar la grabación de datos seleccionando &quot;Ejecutar ahora&quot; en la ventana ND Adquisición. </li></ol> 6. Imágenes Reconstructora SIM <ol><li> Después de imágenes, abra el software Analizar (v4.20.01), con el módulo de NIS-N-SIM Análisis instalada y seleccione &quot;Aplicaciones&quot; -&gt; &quot;ventana demostración N-SIM&quot;. </li><li> Con el contraste de modulación de iluminación (IMC) y la supresión de ruido de alta resolución (HRNS) establece en 1 para los conjuntos de datos TIRF-SIM (Figura 2), la reconstrucción de una (o múltiple con la función por lotes) Archivo SIM prima para producir una imagen SIM reconstruida. </li><li> Confirmar el archivo reconstruida tiene un tamaño de píxel de 30 nm, se indica en elbarra de estado de la imagen. Nota: Tamaño de píxel no afecta análisis STICS pero debe ser al menos 2x menor dimensión que la resolución espacial PSF con el fin de garantizar la correlación espacial entre los píxeles. </li><li> Exportar los datos como archivos .tiff, listos para el análisis STICS. </li></ol> Análisis 7. STICS <ol><li> Descargue y extraiga el STIC (C) S paquete de software Matlab (laboratorio de Wiseman, disponible como información complementaria). El stics_vectormapping.m guión es el núcleo de un solo análisis STICS canal y las primeras 30 líneas de código se utilizan para definir los parámetros de entrada como se define en la sección 2.1 del manual. Abrir este script y definir los parámetros de entrada para el análisis de datos TIRF-SIM. Se sugiere añadir también la carpeta S STIC (C) con subcarpetas a la máquina ruta local Matlab, como se detalla en el apéndice del manual. <ol><li> Definir los parámetros de entrada para el análisis de datos mediante la edición de las líneas correspondientes del código </li><li> Para llevar a cabo analisis de los datos TIRF-SIM para generar 1 de vectores mapa, establezca los parámetros temporales a subregión temporal en la línea 31 hasta el número máximo de fotogramas y el cambio temporal en la línea de 32 a 1. Para obtener una serie temporal de mapas vectoriales variar estos parámetros . </li><li> Para el filtro de eliminación inmóvil, establezca el parámetro &#39;filtrado&#39; (línea 23) a &#39;Promedio móvil&#39; y establecer el parámetro &#39;MoveAverage&#39; (línea 24) a 21. Nota: Este ajuste se ha demostrado que funciona más lento señales de fluorescencia grandes en movimiento y, ya que se basa en la sustracción de marcos de serie de la estructura que se está analizando. </li><li> Cambio líneas 33-38 para establecer el nombre de los archivos de salida y los títulos de los mapas vectoriales de salida, así como la ruta del directorio de salida y definir en qué formato el mapa vectoriales imágenes se deben guardar. </li></ol></li></ol><table><tbody><tr><td> Tamaño de píxel (micras) </td><td> 0,03 micras </td><td> Línea 19 </td></tr><tr><td> Velocidad de cuadro (s) </td><td> 1 segundo </td><td> Línea 20 </td></tr><tr><td> El tiempo máximo de retardo (frames) </td><td> 20 cuadros </td><td> Línea 21 </td></tr><tr><td> Tamaño Subregión (píxeles) </td><td> 8 píxeles </td><td> Línea 29 </td></tr><tr><td> Espaciamiento Subregión (píxeles) </td><td> 1 pixel </td><td> Línea 30 </td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> Abra los run1ChannelSTICS secuencia de comandos en la ventana Matlab Editor. Cargue la serie de imágenes mediante la ejecución de las líneas 1-23 de este script. Nota: Este script se puede utilizar para cargar y pre-proceso de series de imágenes, trazar los mapas vectoriales e histogramas de velocidad y ejecutar un proceso por lotes para muchos archivos. Si es necesario, recortar la imagen de una región de interés mediante el uso de la línea 24-26 de este script. <ol><li> Ejecutar líneas 29-35 de run1ChannelSTICS para iniciar el análisis STICS. Cuando se le solicite, seleccione un polígono para indicar una región específica de interés (ROI), si se desea. Asegúrese de que la ROI no se solapa con el borde de la celda, como se producen artefactos de límite cuando STICS analiza estas reregiones. </li><li> Ejecutar líneas 38-52 para mostrar los mapas de vectores. Para trazar el histograma magnitud de la velocidad, correr las líneas 53-72. </li></ol></li></ol>

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial interests.

Esta técnica permitirá a los investigadores a imagen y cuantificar previamente detalles irresolubles en células que expresan la fluorescencia. En nuestros resultados nos muestran que la F-actina fluye en una forma simétrica de la periferia de la célula hacia el centro de la celda en la célula T es. Estos resultados son consistentes con los resultados anteriores de la línea 1D datos de perfil quimógrafo 13 y se extienden la capacidad de análisis de datos 2D y super-resolución. <p class="jove_cont...

El objetivo del experimento es a la imagen y caracterizar el flujo molecular de filamentous- (F-) de actina en las células T de estar, más allá del límite de difracción con el fin de establecer la dirección del flujo y la magnitud durante la sinapsis inmunológica (IS) formación. Esta técnica se llevará a cabo usando un microscopio de iluminación estructurada (SIM) en el modo de fluorescencia total reflexión interna (TIRF), la formación de imágenes de células T Jurkat que forman una sinapsis artificial sobre la activación cubreobjetos recubiertos con anticuerpos anti-CD28 anti-CD3 y. Las formas se encuentra entre una célula T y su objetivo; una célula presentadora de antígeno (APC) al receptor de células T (TCR) 1,2 activación. Como este es el primer paso para determinar si el sistema inmune adaptativo genera una respuesta inmune a una infección, las consecuencias de la capacidad de respuesta a los estímulos incorrecta puede causar una serie de enfermedades. La importancia de la interacción de células T-APC está bien documentada, sin embargo, el papel (s) del madura es después si inicial TCRinternalización gnal son todavía ser plenamente comprendido. Como se cree que el citoesqueleto para ayudar a dos procesos ligados a la activación de TCR (el movimiento de las moléculas en la membrana plasmática y el control de las moléculas de señalización dependientes de la actina del citoesqueleto 3,4), la comprensión de cómo el citoesqueleto reorganiza espacial y temporalmente se dilucidar los pasos de la reorganización molecular durante la formación de sinapsis. Se cree que el flujo retrógrado de F-actina de corral racimos de TCR hacia el centro de la sinapsis inmunológica, se cree que esta translocación a ser vital para dejar de señal y el reciclado; ayudar al delicado equilibrio de la activación de las células T 5. Mientras que la microscopía de fluorescencia estándar es una herramienta flexible que sigue ofreciendo una visión sobre muchos eventos biológicos, incluyendo interacciones célula-célula, está limitado por la capacidad del sistema para resolver con precisión múltiples fluoróforos que residen más cerca que el diffrlímite de acción (≈200 nm) uno del otro. Como muchos eventos moleculares dentro de las células involucran poblaciones densas de moléculas y exhiben reordenamiento dinámico, ya sea en reposo o con la estimulación específica, microscopía óptica convencional no proporciona una imagen completa. El uso de imágenes de súper resolución ha permitido a los investigadores para eludir el límite de difracción usando una variedad de técnicas. Microscopía sola molécula de localización (SMLM), tales como palma y 6,7 STORM tiene la capacidad de resolver la ubicación de las moléculas hasta una precisión de alrededor de 20 nm, sin embargo, estas técnicas se basan en largos tiempos de adquisición, la construcción de una imagen sobre muchos marcos . Generalmente esto requiere muestras sean fijos o estructuras para exhibir baja movilidad fluoróforos tan solo no están mal interpretado como múltiples puntos. Si bien el agotamiento de la emisión estimulada (STED) de imágenes permite super-resolución a través de muy selectivo de excitación confocal 8, el escaneo requeridoenfoque puede ser lento sobre los campos de células enteras de vista. STED también demuestra fototoxicidad significativa para resoluciones más altas debido al aumento de la potencia del haz de agotamiento. Microscopía de iluminación estructurada (SIM 9) ofrece una alternativa a estos métodos, capaces de duplicar la resolución de un microscopio de fluorescencia estándar y es más compatible con imágenes de células vivas que las técnicas actuales SMLM. Utiliza los poderes de láser más bajos, en un sistema de gran campo para los campos de células enteras de vista; proporcionando una mayor velocidad de adquisición, y es compatible con el etiquetado fluoróforo estándar. La naturaleza de campo amplio de SIM también permite la utilización de fluorescencia total reflexión interna (TIRF) para la excitación altamente selectivo, con profundidades de penetración en la dimensión axial de &lt;100 nm. Espectroscopia de correlación de imagen (ICS) es un método de correlación de las fluctuaciones en la intensidad de fluorescencia. Una evolución del ICS; Im espacio-temporaledad correlación de espectroscopia (STICS 10) correlaciona señales fluorescentes intracelulares en tiempo y espacio. Al correlacionar las intensidades de píxeles y la zona píxeles en marcos rezagados a través de una función de correlación, se obtiene información sobre las velocidades de flujo y direccionalidad. Para asegurar objetos estáticos no interfieren con el análisis STICS, un filtro de objetos inmóviles se implementa, que funciona restando una media móvil de las intensidades de los píxeles. La técnica que aquí se presenta se cree que es la primera demostración de la espectroscopia de correlación de imágenes que se aplica a los datos de microscopía de super-resolución para cuantificar el flujo molecular en células vivas 11. Este método mejora en las imágenes de difracción limitada del flujo de F-actina a través de análisis STICS 12 y se adaptaría a los investigadores que deseen determinar el flujo molecular bidimensional en células vivas, a partir de los datos adquiridos con resoluciones espaciales más allá del límite de difracción de la luz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="799">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Consumables:</td>
			<td style="width:245px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Jurkat E6.1 cells</td>
			<td>APCC</td>
			<td>ATTC TIB-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21875-091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin-Strepromycin&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>&#160;Life Technologies</td>
			<td>14025-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">#1.5 8-well Labtek coverslips</td>
			<td>NUNC, Labtek</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LifeAct GFP construct</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>60101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">OptiMem</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>51985-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-CD3</td>
			<td>Cambridge Bioscience</td>
			<td>317315</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">anti-CD28</td>
			<td>BD Bioscience / Insight Biotechnology</td>
			<td>555725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>20012-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lens oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Equipment:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gene Pulsar Xcell System</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>165-2660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cuvette (0.4cm)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>165-2088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge (5810R)</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5805 000.327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge (Heraeus)</td>
			<td>Biofuge pico</td>
			<td>75003235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stage-top incubator</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td>INUH-TIZSH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nikon N-SIM microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Contact company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nikon Analyse software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Contact company</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Incubator (190D)</td>
			<td>LEEC</td>
			<td>Contact company</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cortical actin flow in t cells quantified by spatio-temporal image correlation spectroscopy of structured illumination microscopy data

-Actina filamentosa juega un papel crucial en la mayoría de los procesos celulares, incluyendo la motilidad y, en las células inmunes, la formación de una interacción célula-célula clave conocida como la sinapsis inmunológica. F-actina También se especula que desempeñan un papel en la regulación de las distribuciones moleculares en la membrana de las células incluyendo la dinámica de vesículas sub membranosa y la agrupación de proteínas. Si bien las técnicas de microscopía de luz estándar permiten observaciones generalizadas y difracción de limitarse a realizar, muchos eventos celulares y moleculares, incluyendo clustering y el flujo molecular se producen en las poblaciones en longitud escalas muy por debajo de la capacidad de resolución del microscopio óptico estándar. Mediante la combinación de fluorescencia total reflexión interna con el súper resolución de imagen método estructurado iluminación microscopía, se registró el flujo molecular bidimensional de F-actina en la sinapsis inmunitaria de las células T. Espacio-temporal espectroscopia de correlación de imágenes (STICS) y luego se aplicó, que genera resul cuantificablets en forma de histogramas de velocidad y mapas vector que representa la direccionalidad del flujo y la magnitud. Este protocolo describe la combinación de las técnicas de imagen y STICS super-resolución para generar vectores de flujo a nivel sub-difracción de detalle. Esta técnica se utilizó para confirmar un flujo de actina que es simétricamente retrógrada y centrípeta lo largo de la periferia de las células T en la formación de sinapsis.

Ajustes del microscopio Después de lograr con éxito todos los pasos del investigador tendrá iluminación estructurada logrado (SIM) de imágenes del flujo de F-actina en una sinapsis de las células T (Video 1), y se cuantifica este flujo molecular mediante espectroscopia de correlación de imágenes espacio-temporal (Figura 4 11). Antes de grabar las imágenes, asegúrese de la iluminación de l...

Watch this Scientific Journal Video about Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data at JoVE.com

Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy.

Cortical de actina de flujo en células T cuantificados por espacio-temporal de correlación Imagen Espectroscopia de Estructurado Iluminación Microscopía de datos

Filamentous-actin plays a crucial role in a majority of cell processes including motility and, in immune cells, the formation of a key cell-cell ...

cortical-actin-flow-t-cells-quantified-spatio-temporal-image

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

9.6K vistas.  King's College London. To investigate flow velocities and directionality of filamentous-actin at the T cell immunological synapse, live-cell super-resolution imaging is combined with total internal reflection fluorescence and quantified with spatio-temporal image correlation spectroscopy. 

Video: Cortical Actin Flow in T Cells Quantified by Spatio-temporal Image Correlation Spectroscopy of Structured Illumination Microscopy Data

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Transducción retroviral de receptores de células T en ratones las células T

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Investigación

Inmunología e Infección

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

piggyBac Transposón modificación del sistema de células T humanas primarias

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick tissue samples and organs in health and disease. By controlling the scanning pattern in multi-photon microscopy and applying appropriate numerical algorithms, we developed a striped-illumination approach, which enabled us to achieve 3-fold better axial resolution and improved signal-to-noise ratio, i.e. contrast, in more than 100 &#181;m tissue depth within highly scattering tissue of lymphoid organs as compared to standard multi-photon microscopy. The acquisition speed as well as photobleaching and photodamage effects were similar to standard photo-multiplier-based technique, whereas the imaging depth was slightly lower due to the use of field detectors. By using the striped-illumination approach, we are able to observe the dynamics of immune complex deposits on secondary follicular dendritic cells &#8211; on the level of a few protein molecules in germinal centers.

High-resolution intravital imaging with enhanced contrast up to 120 &#181;m depth in lymph nodes of adult mice is achieved by spatially modulating the excitation pattern of a multi-focal two-photon microscope. In 100 &#181;m depth we measured resolutions of 487 nm (lateral) and 551 nm (axial), thus circumventing scattering and diffraction limits.

Muy resuelto Microscopía intravital rayas-iluminación de centros germinales

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

La inducción de la inflamación intestinal murino por transferencia adoptiva de Efector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Alta</sup&gt; T células en ratones inmunodeficientes

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Here a protocol is presented to measure bacterial capture by CD4+ T cells which occurs during antigen presentation via transinfection from pre-infected dendritic cells (DC). We show how to perform the necessary steps: isolation of primary cells, infection of DC, DC/T cell conjugate formation, and measurement of bacterial T cell transfection.

Células T Captura bacterias por transinfection de células dendríticas

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

The Use of Flow Cytometry to Assess the State of Chromatin in T Cells

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to clonal proliferation of only those T cells that bear a receptor that recognizes the antigen. Chromatin decondensation is a hallmark of T cell activation and is required for T cells to acquire the ability to proliferate after antigen engagement. This change in chromatin condensation can be detected using antibodies raised against histone proteins. These antibodies cannot bind to their epitopes in na&#239;ve T cells as well as they can in activated T cells. We describe how to simultaneously stain T cell-specific surface markers, track viability with a fixable dead cell stain, and measure chromatin status via intracellular staining of Histone H3 proteins. Stained cells are analyzed by flow cytometry and chromatin condensation status is measured as the mean fluorescence intensity (MFI) of the Histone H3 stain. Chromatin decondensation during T cell activation is demonstrated as an increase in the MFI

Flow cytometry can be utilized to assess the state of chromatin within T cells. This protocol allows scientists to interpret evidence of chromatin decondensation during T cell activation demonstrated by an increase in the mean florescence intensity (MFI) of fluorescent Histone H3 antibodies

El uso de la citometría de flujo para evaluar el estado de la cromatina en las células T

During a proper immune response, quiescent T cells become activated upon antigen presentation to their antigen-specific T cell receptor. This leads to ...

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis allow the spatial localization and visualization of gangliosides involved in CD4+ T cell activation, that complement expression profiling experiments such as flow cytometry, western blotting or real-time PCR. The quantification of ganglioside expression through flow cytometry and their cellular localization through microscopy can be obtained by the use of anti-ganglioside antibodies with high affinity and specificity. Nonetheless, an adequate handling of cells in suspension involves the treatment of culture plates to promote the necessary adherence required for fluorescence or confocal microscopy acquisition. In this work, we describe a protocol for determining GD3 and GD2 ganglioside expression and colocalization with the TCR during na&#239;ve CD4+ T cell activation. Also, real-time PCR experiments using &#60;40,000 cells are described for the determination of the GD3 and GM2/GD2 synthase genes, demonstrating that gene analysis experiments can be performed with a low number of cells and without the need of additional low input RNA kits.

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

We describe a standard antibody staining protocol for use in microscopy to determine the membrane expression and localization of gangliosides in resting and activated human na&#239;ve CD4+ T cells. Also described are real-time PCR experiments using &#60;40,000 cells that do not require additional low input RNA kits.

Preparación de CD4<sup&gt; +</sup&gt; Las células T para el Análisis de GD3 y GD2 gangliósidos membrana Expresión mediante microscopía

The methods described herein for activation of na&#239;ve CD4+ T cells in suspension and their adherence in coverslips for confocal microscopy analysis ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial and temporal resolution. FCS can quantify the molecular concentration and diffusion coefficient of fluorescently labeled molecules in the cell membrane. This technique has the ability to explore the molecular diffusion characteristics of molecules in the plasma membrane of immune cells in steady state (i.e., without processes affecting the result during the actual measurement time). FCS is suitable for studying the diffusion of proteins that are expressed at levels typical for most endogenous proteins. Here, a straightforward and robust method to determine the diffusion rate of cell membrane proteins on primary lymphocytes is demonstrated. An effective way to perform measurements on antibody-stained live cells and commonly occurring observations after acquisition are described. The recent advancements in the development of photo-stable fluorescent dyes can be utilized by conjugating the antibodies of interest to appropriate dyes that do not bleach extensively during the measurements. Additionally, this allows for the detection of slowly diffusing entities, which is a common feature of proteins expressed in cell membranes. The analysis procedure to extract molecular concentration and diffusion parameters from the generated autocorrelation curves is highlighted. In summary, a basic protocol for FCS measurements is provided; it can be followed by immunologists with an understanding of confocal microscopy but with no other previous experience of techniques for measuring dynamic parameters, such as molecular diffusion rates.

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

Difusión molecular en el plasma membranas de linfocitos primarios medidos por espectroscopia de correlación de fluorescencia

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Human Endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore essential for understanding pathogenicity of different pathogens including HIV. Gamma delta (GD) T cells are the prototype of &#39;unconventional&#39; T cells and represent a relatively small subset of T cells defined by their expression of heterodimeric T-cell receptors (TCRs) composed of gamma and delta chains. This sets them apart from the classical and much better known CD4+ helper T cells and CD8+ cytotoxic T cells that are defined by alpha-beta TCRs. GD T cells often show tissue-specific localization and are enriched in epithelium. GD T cells orchestrate immune responses in inflammation, tumor surveillance, infectious disease, and autoimmunity.
Here, we present a method to reproducibly isolate and analyze human endocervical intraepithelial GD T lymphocytes. We have used endocervical cytobrush samples from women participating in the Women&#39;s Interagency HIV Infection Study (WIHS). Knowledge about GD T cells interactions during conditions in which there is an insult to the vaginal mucosal could be applied to any clinical study in which mucosal vulnerability is addressed, including the development of vaginal microbicides.In addition, knowledge about mucosal GD T cell responses has potential for application of GD T cell-based immune therapy in treating infectious diseases.

We describe here an isolation method to obtain human endocervical intraepithelial lymphocytes for the analysis of intraepithelial gamma delta T cells. This protocol can be extended for the purification of endocervical gamma delta T cells by magnetic beads or by cell sorting.

Aislamiento y Análisis de citometría de flujo, de Human endocervical Gamma Delta T Cells

The female reproductive tract (FRT) mucosal immune system serves as the first line of defense. Better knowledge of the genital mucosa is therefore ...

Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human central nervous system (CNS) autoimmune demyelinating disease, creation of an AQP4-targeted model with both clinical and histologic manifestations of CNS autoimmunity has proven challenging. Immunization of wild-type (WT) mice with AQP4 peptides elicited T cell proliferation, although those T cells could not transfer disease to na&#239;ve recipient mice. Recently, two novel AQP4 T cell epitopes, peptide (p) 135-153 and p201-220, were identified when studying immune responses to AQP4 in AQP4-deficient (AQP4-/-) mice, suggesting T cell reactivity to these epitopes is normally controlled by thymic negative selection. AQP4-/- Th17 polarized T cells primed to either p135-153 or p201-220 induced paralysis in recipient WT mice, that was associated with predominantly leptomeningeal inflammation of the spinal cord and optic nerves. Inflammation surrounding optic nerves and involvement of the inner retinal layers (IRL) were manifested by changes in serial optical coherence tomography (OCT). Here, we illustrate the approaches used to create this new in vivo model of AQP4-targeted CNS autoimmunity (ATCA), which can now be employed to study mechanisms that permit development of pathogenic AQP4-specific T cells and how they may cooperate with B cells in NMO pathogenesis.

Here, we present a protocol to induce paralysis and opticospinal inflammation by transfer of aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells from AQP4-/- mice into WT mice. In addition, we demonstrate how to use serial optical coherence tomography to monitor visual system dysfunction.

Inducción de parálisis y lesión del sistema Visual en ratones por T las células específicas para el Optica del Neuromyelitis Autoantigen Acuaporina-4

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...