Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo inmunológico humano, como cómo la comunicación entre leucocitos se produce a nivel molecular y celular. La principal ventaja de esta técnica es que las células T humanas no purificadas se pueden analizar ex vivo en un período de tiempo relativamente corto. Demostrando este procedimiento estará Henning Kirchgessner, un técnico de nuestro laboratorio.
Comience mezclando un mililitro de sangre periférica humana recién extraída con 30 mililitros de tampón de lelisis ACK en un tubo cónico de 50 mililitros. Después de ocho minutos a temperatura ambiente, llene el tubo con PBS para un lavado de centrifugación y resusppend el pellet en dos mililitros de medio de cultivo para una incubación de 60 minutos a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, agregue cinco veces 10 a la quinta Staphylococcus aureus enterotoxina B o células Raji cargadas o descargadas por SEB en 500 microlitros de medio de cultivo en tubos FACS individuales, seguidos de 650 microlitros de pan-leucocitos.
Gira hacia abajo los co-cultivos, y resuspender los pellets en 150 microlitros de medio de cultivo fresco para una incubación de 45 minutos a 37 grados centígrados. Luego, vórtice suavemente las células durante 10 segundos a 100 rpm mientras agrega 1,5 mililitros de 1,5%paraformaldehído. Después de 10 minutos a temperatura ambiente, detenga la fijación con un mililitro de PBS complementado con 1%BSA y recoja las células por centrifugación.
Resuspender los pellets en 100 microlitros de PBS más BSA y 0.1%saponina, y agregar las muestras de células a dos pozos individuales de una placa inferior en U de 96 pozos. Después de 15 minutos a temperatura ambiente, centrifugar la placa y resuspender los pellets en 50 microlitros de PBS más BSA y saponina que contiene los anticuerpos conjugados con fluoróforo o compuestos de interés para una incubación de 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente. Al final de la incubación, lavar las células tres veces en 150 microlitros de PBS más BSA y saponina y resuspend los pellets en 60 microlitros de PBS.
Para crear una imagen de las celdas por citometría de flujo, abra el software de análisis, compruebe el nivel de líquido y haga clic en Inicio en el menú Instrumento. A continuación, haga clic en Cargar y cargue los ejemplos en el puerto cuando se le solicite. En la pestaña Iluminación, cambie la potencia del láser de excitación a las longitudes de nanómetro adecuadas.
A continuación, ajuste las puertas para los canales cuatro y 11, y ajuste el área para el canal uno. Para evaluar los ajustes de potencia de gating y láser, cambie el menú Ver a la puerta respectiva y ajuste las puertas y las potencias láser hasta que las celdas y las parejas de celdas sean visibles. A continuación, en la pestaña Adquisición de archivos, defina el nombre de la muestra y el número de imágenes que se deben adquirir y la puerta adecuada para la tinción de CD3 y haga clic en Adquirir para comenzar la adquisición.
Para analizar las imágenes de celda adquiridas, abra el software de análisis adecuado. Siguiendo las instrucciones del menú desplegable Compensación, genere una matriz de compensación y guarde la matriz como comp date ctm. A continuación, abra un archivo de imagen sin procesar de ejemplo y aplique la fecha de composición ctm en la ventana para generar la imagen compensada y los archivos de análisis de datos predeterminados.
Después de abrir los archivos de imagen compensados, convierta las imágenes al modo de color. Ajuste las tablas de búsqueda para obtener colores visibles óptimos en la barra de herramientas Propiedades de la galería de imágenes. Abra el Administrador de máscaras en el menú Análisis y defina las celdas T seleccionando una máscara de umbral del 60% para el canal cinco y rellenando la máscara para crear la máscara de celda T.
A continuación, seleccione Máscara de valle para el canal dos con un ancho de tres píxeles para crear la máscara del valle y combine la celda T y las máscaras del valle para crear la máscara de sinapsis de la célula T. Para calcular la expresión CD3 total en celdas T, abra el Administrador de características y cree la entidad Intensidad, celda T, canal cinco. Para calcular la cantidad total de F-actina en las células T, cree la característica Intensidad, células T, canal seis.
Para evaluar la cantidad de CD3 en sinapsis inmunes, cree la característica Intensidad, Sinapsis de células T, canal cinco. Para determinar la cantidad de F-actina en la sinapsis inmune, cree la característica Intensidad, Sinapsis de células T, canal seis. Por último, para definir el enriquecimiento F-actina y CD3, calcular las proporciones de F-actina o CD3 en la sinapsis inmune y la expresión total de la proteína seleccionada, respectivamente.
En estos gráficos, se muestra una visión general de la estrategia de gating crítica para cuantificar el enriquecimiento proteico en la sinapsis inmune entre las células que presentan antígenos subrogados, o APC, y las células T en leucocitos pan no purificados tomados de una muestra de sangre humana de bajo volumen. Aquí, se muestran imágenes representativas de conjugados T-cell-APC con bajos niveles de CD3 y F-actina dentro de sus sinapsis inmunitarias en ausencia de SEB, mientras que estos conjugados T-cell-APC demuestran un fuerte enriquecimiento cd3 y F-actina en presencia de SEB. En ausencia de superantigen, el 15% de las células T mostraron enriquecimiento de CD3 y F-actina en la sinapsis inmune, mientras que un 29% de enriquecimiento se observa en presencia de superantigen.
De hecho, en ausencia de superantígeno, menos del 20% del total de F-actina en las células se acumula en la sinapsis inmune, con más del 30% observado en la sinapsis en presencia de superantigen. En particular, CD3 se acumula en la sinapsis inmune incluso en ausencia de superantigen, Aunque esta acumulación también se incrementa significativamente por la adición de superantigen, demostrando la aptitud de este método para cuantificar la acumulación de proteínas en la sinapsis inmune T-célula-APC. Una vez masterída, esta técnica se puede completar en seis a siete horas si se realiza correctamente.
Al intentar este procedimiento, es importante recordar incluir todos los controles relevantes, incluidas las muestras sin superantigen, ya que el enriquecimiento de proteínas también se produce si se utilizan APC sin SEB. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la microscopía de superprosorción para responder preguntas adicionales sobre la estructura fina de la sinapsis inmune. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las comunicaciones celulares exploraran la sinapsis inmune en humanos para la investigación básica, ensayos clínicos y ciencia traslacional.
Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo analizar la zona conectiva T-cell-APC y la sinapsis inmune en las células T humanas ex vivo. No olvide que trabajar con materiales humanos primarios puede ser peligroso y que siempre se deben tomar precauciones como usar guantes o trabajar bajo el nivel de bioseguridad dos condiciones durante la realización de este procedimiento.
