Name: inducing a site specific replication blockage in e. coli using a fluorescent repressor operator system
Uploaded: 2016-08-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System at JoVE.com

This work was supported by the Australian Research Council [DP11010246].

1. El bloqueo de la replicación con FROS <ol><li> La inducción de la replicación de bloqueo <ol><li> Diluir un cultivo de una noche fresco de una E. cepa de E. coli que lleva una matriz de tetO y pKM1 18 a OD 600 nm = 0,01 en un medio complejo diluido (0,1% de triptona, 0,05% de extracto de levadura, 0,1% NaCl, M KH 2 PO 4, 0,72 MK 2 HPO 4 0,17) con antibióticos como se requiere para la selección. Nota: No añadir tetraciclina para la selección, ya que no es compatible con este sistema. Hacer que el volumen del cultivo equivalente a 10 ml por muestra requeridos. Por ejemplo, el volumen de cultivo para el diseño experimental en la Figura 1 es de 60 ml. </li><li> Crecer a 30 ° C con agitación hasta una DO600 nm = 0,05-0,1. Retirar una muestra de 10 ml para servir como control no inducido y añadir 0,1% de arabinosa al cultivo restante para inducir la producción de TetR-YFP de pKM1. Continuar para crecer tanto la no inducida e inducidaculturas. Después de 1 hora, comprobar la presencia de un solo punto focal dentro de cada célula del cultivo inducido mediante microscopía de fluorescencia (véase la sección 2). </li><li> Si se confirman bloqueado las células inducidas (más del 70% de las células tienen un único punto de mira), registre la OD 600 nm y tomar una muestra de 7,5 ml para el análisis de los geles 2-D (véase la sección 3). Tomar una muestra equivalente a partir del cultivo de control no inducido. </li></ol></li><li> Al soltar el bloqueo de replicación <ol><li> Para liberar el bloque de replicación, añadir 100 ng ml -1 de la anhidrotetraciclina inductor gratuito (AT) a una muestra de las células bloqueadas 10 ml. Continuará creciendo a 30 ° C durante 10 minutos y tomar muestras para la densidad celular (1 ml), análisis de microscopía (10 l) y geles de agarosa al 2 dimensiones neutro-neutro (7,5 ml). </li></ol></li><li> La inducción del colapso de la replisome <ol><li> Si las células contienen un alelo sensible a la temperatura, tales como TS dnaB o TS dnaC que requiere deactivación, mueva el frasco que contiene las células bloqueadas a 42 ° C. Tomar muestras para su análisis en puntos de tiempo requeridos (por ejemplo, 1 hora después de la incubación). Después de que las células se han incubado a 42 ° C durante 1 hr, cambiar las células a 30 ° C durante 10 min (ver Figura 1). Nota: Las células se pueden desplazar a 30 ° C para el análisis de reinicio. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54434/54434fig1.jpg" /> Figura 1:. Aspectos generales del procedimiento de bloques y la liberación experimental FROS replicación de E. cepas de E. coli que llevan la matriz tetO se hacen crecer a 30 ° C. Cuando las células alcanzan un 600 nm OD por encima de 0,05, la producción TetR-YFP se indujo con arabinosa (ara; 0,1%). Continuar creciendo una subpoblación de células no inducidas para actuar como controles en 30 ° C. Una muestra de las células inducidas se analiza a través de microscopía de fluorescencia después de 1-2 horas (véase 2.1). Si la replicación esconfirmó a ser bloqueado, se toman muestras para el análisis 2-D gel indicado por los tubos de ensayo (véase el apartado 3.1) y para las pruebas de viabilidad (opcional). El bloqueo de replicación se puede quitar con anhidrotetraciclina (AT; 0,1 mg / ml) y las células se analizó 10 min más tarde. Si las células llevan un alelo sensible a la temperatura (por ejemplo dnaB ts), esto puede ser inactivado por el desplazamiento de las células bloqueadas a 42 ° C para el análisis correspondiente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54434/54434fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 2. Microscopía de Fluorescencia <ol><li> Preparar una almohadilla de agarosa pipeteando 500 l de agarosa fundido (1% en agua) en un portaobjetos de microscopio; superponer el cubreobjetos inmediatamente antes de que solidifique de agarosa. Almacenar la corredera (s) en los tejidos húmedos a 4 ° C hasta que se necesite. </li><li> Cuando la agarosa se ha solidificado, retirar el cubreobjetos de la almohadilla de agarosa y pipeta de 10 l de bacteriascultura en el centro de la almohadilla para evitar el movimiento de las células durante la visualización. Una vez que la muestra se ha secado (aproximadamente 5 min), vuelva a colocar el cubreobjetos. Coloque una gota de aceite de inmersión sobre la hoja de la cubierta y colocar el portaobjetos bajo la óptica. </li><li> Visualizar las células utilizando microscopía de fase a 100 aumentos. <ol><li> En el cuadro de diálogo adquieren el software de imagen, ajustar el tiempo de exposición a 100 ms. Capturar la imagen seleccionando Adquirir. No mueva el escenario. En el cuadro de diálogo Adquirir, seleccione YFP como la iluminación para el obturador externo vinculado a la cámara. Ajuste el tiempo de exporsure a 1.000 ms. Apagar la luz de la etapa. Capturar la imagen de fluorescencia mediante la selección de Adquisición. Nota: El tiempo puede variar dependiendo de la fuente de luz, microscopio y cámara utilizada. </li><li> Para superponer la fase y las imágenes fluorescentes, seleccionar color Combine desde dentro del menú de pantalla. En el cuadro de diálogo Combinar color, seleccione la imagen YFP como la imagen de fase como el componente verde y blue componente. Haga clic en el color de la cosechadora. Determinar si la población se había bloqueado la replicación con éxito por establecer si la mayoría de las células tienen uno de los focos por célula. Nota: La comparación con una muestra de control sin arabinosa añadida es útil para identificar visualmente la diferencia en la producción eYFP. </li></ol></li></ol> 3. Extracción de ADN de agarosa / Tapones <ol><li> Añadir azida de sodio (concentración final de 0,1%) a los 7,5 ml muestras de cultivo de los pasos 1.1.3 y 1.2.1. Incubar en hielo durante al menos 5 min. Nota: La azida sódica es extremadamente tóxico. Consulte la Hoja de datos de seguridad antes de comenzar el trabajo y no manejarlo hasta que todas las precauciones de seguridad que se hayan leído y comprendido. </li><li> Centrifugar las células 5.000 xg durante 10 minutos para sedimentar las células. Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 200 l de Pett IV (PIV) de tampón (10 mM Tris: HCl (pH 8,0), 1 M NaCl). Microcentrífuga (13, 000 xg durante 2 min) para sedimentar las células. discard el sobrenadante. En esta etapa, el proceso de los gránulos más o almacenar a -20 ° C. </li><li> Resuspender las células con la densidad celular más baja en PIV 50 l y el lugar a 50 ° C. Para todas las demás muestras, ajustar los volúmenes de PIV por lo que la densidad celular final es el mismo en cada tubo (por ejemplo, la muestra 1 (OD 600 nm = 0,128) se resuspendió en 50 l; Muestra 2 (OD 600 nm = 0,138) se resuspendió en 54 l). <ol><li> Añadir un volumen igual de solución recién preparada de agarosa al 0,8% en PIV (concentración final 0,4%;. Por ejemplo, la muestra 1 50 l, Muestra 2 54 l). Asegurar que las muestras, agarosa y PIV están por encima de 50 ° C para evitar la solidificación. </li></ol></li><li> Tratar a un portaobjetos de microscopio con 40 l de una solución que repele el agua de vidrio o silicona apropiado. Frote la diapositiva con un pañuelo de papel hasta que se seque. Nota: Esto se puede hacer con antelación y los portaobjetos tratados almacena a largo plazo a temperatura ambiente. </li><li> Coloque 20 gotas l de tque la suspensión de células / agarosa en la diapositiva para producir tapones que son semiesférica. Nota: La primera muestra (se resuspendió en 50 l PIV) producirá 5 tapones en una diapositiva. </li><li> Cuando los tapones han solidificado, deslice suavemente en un tubo de microcentrífuga y añadir tampón de lisis celular 1 ml (10 mM Tris-HCl [pH 8], 1 M NaCl, ácido 100 etilendiaminotetraacético mM (EDTA), 0,2% desoxicolato de sodio, 0,5% sal de N-lauroilsarcosina de sodio (Sarkosyl), 100 mg ml - 1 lisozima, 50 mg ml - 1 RNasa A). Incubar a 37 ° C durante 2 hr. </li><li> Eliminar el tampón de lisis celular y añadir Sarcosilo / proteinasa K (ESP) solución de 1 ml de EDTA / (0,5 M EDTA, sal de sodio de N-lauroilsarcosina 1% (Sarkosyl), 1 mg ml - 1 de proteinasa K). Incubar a 50 ° C durante la noche o hasta que los tapones son transparentes. Si se requiere una segunda incubación durante la noche, sustituir la solución ESP con tampón fresco después de aproximadamente 18 hr. </li><li> Eliminar elESP tampón y lavar las clavijas 5 veces con 12 ml de Tris-EDTA (TE) tampón (10 mM Tris-HCl, EDTA 1 mM, pH 8,0), lo que permite un equilibrio de 30 min con cada lavado. Almacenar a 4 ° C en 1 ml de tampón TE. </li></ol> 4. neutral-neutral de 2 dimensiones electroforesis en gel <ol><li> Transferir un tapón de agarosa desde el paso 3.8 a un tubo de microcentrífuga y añadir 150 l de tampón de enzima de restricción (1x concentración). Añadir 25-100 unidades de enzima de restricción (por ejemplo, 60 unidades de EcoRV; (véase la Figura 3A)). Digerir a 37 ° C durante 6-8 horas. </li><li> A 4 ° C, se vierte un gel de agarosa al 0,4% (300 ml) en 1 x Tris / borato / EDTA (TBE) en una bandeja de gel de aproximadamente 25 x 25 cm. Insertar un peine para hacer pozos aproximadamente la misma anchura que el diámetro de la clavija. Cuando se establece el gel, retire el peine y mover el gel a temperatura ambiente. </li><li> Deslizar uno de los bloques de agarosa digeridos en un pozo, el posicionamiento de la guía plana de la clavija contra el lado del pozo, donde tADN que va a entrar en el gel. Insertar un solo enchufe de la misma manera en cada segundo también. </li><li> Pipetear fundido 0,4% de agarosa en los pocillos para sellar los tapones en posición. </li><li> Cargar escalera de ADN 1 kb en un pozo vacío, dejando de nuevo una brecha entre la escalera y muestras, y ejecutar el gel durante la noche (16 h, 55 V) en TBE 1x a temperatura ambiente. </li><li> Tinción del gel en un baño de agua que contenía bromuro de etidio (0,3 mg ml -1) para los 20 min. Nota: El bromuro de etidio se considera un potente mutágeno y una toxina. Consulte la Hoja de datos de seguridad antes de comenzar el trabajo y no manejarlo hasta que todas las precauciones de seguridad que se hayan leído y comprendido. </li><li> Visualizar el ADN con un transiluminador UV de onda larga y corta cada fragmento de carril con una recta, incluso cortar, minimizando la inclusión de exceso de agarosa a cada lado del carril. Nota: Por ejemplo, si el fragmento de interés es de 5,5 kb, cortar un fragmento de 7,5 cm para incluir los fragmentos de ADN a partir de 5 kb a approximatEly 12 kb (véase la Figura 3A). </li><li> Coloque el carril de gel escindido en una bandeja de gel en 90 ° a la dirección de la migración del ADN. Nota: Dos filas de 3 fragmentos de gel pueden caber en una bandeja de gel de 25 x 25 cm 2. La primera fila de carriles de gel es en la parte superior de la bandeja, la segunda fila en 12,5 cm. </li><li> Preparar 300 ml de agarosa para la segunda dimensión de gel (0,9% en TBE 1x con 0,3 mg ml-1 de bromuro de etidio). Cuando la agarosa se enfría a 50 ° C, pipetear la agarosa fundida alrededor de los cortes de gel para solidificar su posición. Verter la agarosa restantes en la bandeja hasta una profundidad que es al menos la altura de los cortes de gel. </li><li> Una vez se solidifica el gel, a electroforesis a 4 ° C en TBE 1x que contenía 0,3 mg ml -1 de bromuro de etidio a 220 V hasta que el ADN ha migrado aproximadamente 10 cm. Nota: 4 hr es suficiente para un fragmento de 5,5 kb, pero un fragmento más pequeño será necesario menos tiempo. </li><li> Escindir los bloques en los que el ADN genómico está presente ucantar el borde de una regla de metal, incluyendo el gel por encima de él para incluir el ADN que no es visible (véase la Figura 3C). </li></ol> 5. hibridación Southern <ol><li> Preparación de la solución <ol><li> Preparar tampón de despurinización (solución 0,125 M HCl). Nota: Este tampón puede ser reutilizado y es estable a temperatura ambiente por hasta 1 mes. </li><li> Preparar tampón de desnaturalización (NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 M). Nota: La desnaturalización de amortiguación puede ser reutilizado una vez y es estable durante un máximo de 3 meses a temperatura ambiente. </li><li> Preparar tampón de neutralización (NaCl 1,5 M, Tris 0,5 M). Ajustar a pH 7,5 con HCl. Nota: Tampón de neutralización puede ser reutilizado una vez y es estable durante un máximo de 3 meses a temperatura ambiente. </li><li> Preparar Saline citrato de sodio (SSC) de tampón 10x (M citrato 0,15 Tri-sodio, 1,5 M NaCl, pH es 7-8) para su uso en los pasos 5.2.4 y 5.2.6. A partir de este tampón, hacer una SSC 2x social (para su uso en el paso 5.2.9). Nota: SSC 10x SSC 2x y unare estable a temperatura ambiente durante 3 meses. </li><li> Preparar Modificado Buffer 19 Church y Gilbert hibridación (tampón fosfato 0,5 M [pH 7,2], 7% (w / v) de dodecilsulfato de sodio (SDS), EDTA 10 mM). Deja a 65 ° C para disolver a fondo antes de su uso. </li></ol></li><li> Transferir <ol><li> Enjuague los bloques de gel extirpados en solución despurinización durante 10 min a RT en un agitador o agitador orbital. Mantener la velocidad de agitación baja para evitar daños en los bloques de agarosa. </li><li> Enjuague los bloques de gel brevemente con agua destilada y después con tampón de desnaturalización durante 30 min. Enjuague de nuevo brevemente en agua destilada y luego se incuban los bloques de gel en tampón de neutralización de 30 min con agitación suave a temperatura ambiente. </li><li> Cortar una membrana de nylon con el tamaño exacto del gel (s). Cortar una muesca en la esquina superior derecha para ayudar en la orientación de la membrana en los pasos futuros. Nota: Dos bloques de gel (6 muestras) se puede visualizar en una membrana. </li><li> Vierta suficiente 10x SSC en un tray para que no se seque durante la noche. Crear una plataforma aproximadamente 5 cm por encima del nivel de la memoria intermedia. Saturar 3 hojas de papel de cromatografía 3MM con 10x SSC y lugar en la plataforma. Cortar el papel de cromatografía de modo que es lo suficientemente largo para ser sumergido en tampón en ambos extremos y lo suficientemente amplia como para adaptarse a la membrana de gel sobre. </li><li> El gel de sílice (s) en la parte superior del papel cromatográfico saturado. Enmarcar el gel con una envoltura de plástico para evitar que el buffer sin pasar por el gel durante la transferencia. Con cuidado, colocar la membrana de corte en la parte superior del gel (s). Eliminar burbujas de aire entre la membrana y el gel haciendo rodar una botella o una pipeta serológica suavemente a través de la membrana. </li><li> Cortar tres hojas de papel de cromatografía 3MM con el mismo tamaño que el de la membrana. Saturar las hojas de papel de cromatografía con 10x SSC y colocar en la parte superior de la membrana. Eliminar las burbujas de aire que se han formado. </li><li> toallas de papel pila por lo menos 5 cm de alto en la parte superior del papel secante seguido de un soporte sólido (apropeso ximate de 1 kg para una membrana de 23 x 16 cm). Permitir la transferencia de proceder durante la noche. </li><li> Exponer a la membrana (ADN hacia arriba) a 1,200 J / m 2 de UV para reticular el ADN a la membrana. No enjuague antes de este paso. </li><li> Enjuague la membrana a fondo en SSC 2x para prevenir la elevada fondo en las imágenes blot. Utilice la mancha de inmediato para la hibridación (véase 5.3) o secar a temperatura ambiente, envolver en papel film y se almacena a 4 ° C. </li></ol></li><li> Hibridación <ol><li> Precalentar el horno de hibridación y botellas a 55 ° C. </li><li> Añadir 100 mg ml -1 albúmina de suero bovino (BSA) y 10 mg ml -1 ADN no específica (por ejemplo, ADN de esperma de salmón) a tampón de hibridación precalentado. </li><li> Para permitir una cobertura uniforme del tampón de hibridación cuando la membrana se enrolla, colocar la mancha en un cuadrado de tamaño similar de malla de nylon con el lado unido al ADN de la membrana hacia arriba. Rollo de la mancha lo largo de su borde largo. Diapositivala mancha / malla dentro de una botella de hibridación. Añadir una cantidad apropiada de tampón de hibridación precalentado a desenrollar el blot (por ejemplo, 30 ml para una membrana de 23 x 16 cm 2). </li><li> Incubar en un horno precalentado, la rotación de las botellas, por 1 hr. </li><li> Preparar la sonda mediante la mezcla de 50 ng de producto de PCR purificado homóloga a la región de interés, 150 ng de cebadores hexámeros aleatorios, tampón para el fragmento Klenow y H 2 O para hacer un volumen de 13 l. Hervir durante 3 minutos y después se colocan inmediatamente en hielo. Añadir 1 l de 1 mM dCTP mezcla / dGTP / dTTP, 1 l de fragmento Klenow (5 U) y 50 Ci desoxiadenosina radiomarcado 5&#39;-trifosfato en el fosfato alfa (α 32 P-dATP). </li><li> Incubar a temperatura ambiente durante 1 hr. Añadir 1 l de 1 mM de la mezcla dNTP y 1 l de fragmento de Klenow. Incubar 20 min a RT. </li><li> Hervir la sonda durante 5 minutos y añadir de inmediato a los tubos de hibridación. Hibridar durante la noche a 55 ° C, con la rotación. </li><li> Decantar el probe de membrana. Nota: La sonda es capaz de ser reutilizada una vez. </li><li> Enjuague la membrana brevemente en pre-calentado, tampón de lavado de baja rigurosidad (2x SSC, 0,1% (w / v) SDS). Añadir un nuevo buffer de lavado de baja rigurosidad e incubar durante 5 minutos a 55 ° C con rotación. Repetir. </li><li> Lavar dos veces en tampón de lavado rigurosidad media (1x SSC, 0,1% (w / v) SDS) durante 10 minutos a 55 ° C con rotación. </li><li> Lavar dos veces en tampón de lavado de alta rigurosidad (0,1 x SSC, 0,1% (w / v) SDS) durante 5 min a 55 ° C con rotación. </li><li> Retire la membrana y aplique con el tejido para eliminar el exceso de líquido. Envolver en papel de plástico asegurando que no hay restos de humedad en la envoltura de plástico y colocar en casete de la exposición con una pantalla de fósforo de almacenamiento pre-troquelada. Cierre la casete y exponer por lo menos 2 h antes de la visualización utilizando un generador de imágenes de fósforo. </li></ol></li></ol>

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	<li>Mirkin, E. V., Mirkin, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+stalling+at+natural+impediments.">Replication fork stalling at natural impediments.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 71 (1), 13-35 (2007).</li><li>Gupta, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-DNA+complexes+are+the+primary+sources+of+replication+fork+pausing+in+Escherichia+coli.">Protein-DNA complexes are the primary sources of replication fork pausing in Escherichia coli.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (18), 7252-7257 (2013).</li><li>McGlynn, P., Guy, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+forks+blocked+by+protein-DNA+complexes+have+limited+stability+in+vitro.">Replication forks blocked by protein-DNA complexes have limited stability in vitro.</a> J Mol Biol. 381 (2), 249-255 (2008).</li><li>Tanner, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+studies+of+fork+dynamics+in+Escherichia+coli+DNA+replication.">Single-molecule studies of fork dynamics in Escherichia coli DNA replication.</a> Nat Struct Mol Biol. 15 (2), 170-176 (2008).</li><li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis.">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457 (7227), 336-339 (2009).</li><li>Rudolph, C. J., Upton, A. L., Lloyd, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+stalling+and+cell+cycle+arrest+in+UV-irradiated+Escherichia+coli.">Replication fork stalling and cell cycle arrest in UV-irradiated Escherichia coli.</a> Genes Dev. 21 (6), 668-681 (2007).</li><li>Jeiranian, H. A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+replication+reduces+RecA-mediated+repair+of+UV-damaged+plasmids+introduced+into+competent+Escherichia+coli.">Inefficient replication reduces RecA-mediated repair of UV-damaged plasmids introduced into competent Escherichia coli.</a> Plasmid. 68 (2), 113-124 (2012).</li><li>Le Masson, M., Baharoglu, Z., Michel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ruvA+and+ruvB+mutants+specifically+impaired+for+replication+fork+reversal.">ruvA and ruvB mutants specifically impaired for replication fork reversal.</a> Mol Microbiol. 70 (2), 537-548 (2008).</li><li>Wang, X., Liu, X., Possoz, C., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+Escherichia+coli+chromosome+arms+locate+to+separate+cell+halves.">The two Escherichia coli chromosome arms locate to separate cell halves.</a> Genes Dev. 20 (13), 1727-1731 (2006).</li><li>Lau, I. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+organization+of+replicating+Escherichia+coli+chromosomes.">Spatial and temporal organization of replicating Escherichia coli chromosomes.</a> Mol Microbiol. 49 (3), 731-743 (2003).</li><li>Gordon, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+and+low+copy+plasmid+segregation+in+E.+coli:+visual+evidence+for+distinct+mechanisms.">Chromosome and low copy plasmid segregation in E. coli: visual evidence for distinct mechanisms.</a> Cell. 90 (6), 1113-1121 (1997).</li><li>Possoz, C., Filipe, S. R., Grainge, I., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+of+controlled+Escherichia+coli+replication+fork+stalling+and+restart+at+repressor-bound+DNA+in+vivo.">Tracking of controlled Escherichia coli replication fork stalling and restart at repressor-bound DNA in vivo.</a> EMBO J. 25 (11), 2596-2604 (2006).</li><li>Payne, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+blockage+by+transcription+factor-DNA+complexes+in+Escherichia+coli.">Replication fork blockage by transcription factor-DNA complexes in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 34 (18), 5194-5202 (2006).</li><li>Brewer, B. J., Fangman, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+localization+of+replication+origins+on+ARS+plasmids+in+S.+cerevisiae.">The localization of replication origins on ARS plasmids in S. cerevisiae.</a> Cell. 51 (3), 463-471 (1987).</li><li>Jeiranian, H. A., Schalow, B. J., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+UV-induced+replication+intermediates+in+E.+coli+using+two-dimensional+agarose-gel+analysis.">Visualization of UV-induced replication intermediates in E. coli using two-dimensional agarose-gel analysis.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li><li>Southern, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+specific+sequences+among+DNA+fragments+separated+by+gel+electrophoresis.">Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis.</a> J Mol Biol. 98 (3), 503-517 (1975).</li><li>Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage-induced+replication+fork+regression+and+processing+in+Escherichia+coli.">DNA damage-induced replication fork regression and processing in Escherichia coli.</a> Science. 299 (5609), 1064-1067 (2003).</li><li>Mettrick, K. A., Grainge, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+blocked+replication+forks+in+vivo.">Stability of blocked replication forks in vivo.</a> Nucleic Acids Res. , (2015).</li><li>Church, G. M., Gilbert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+sequencing.">Genomic sequencing.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (7), 1991-1995 (1984).</li><li>Michel, B., Grompone, G., Flores, M. J., Bidnenko, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+pathways+process+stalled+replication+forks.">Multiple pathways process stalled replication forks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12783-12788 (2004).</li><li>Michel, B., Boubakri, H., Baharoglu, Z., LeMasson, M., Lestini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination+proteins+and+rescue+of+arrested+replication+forks.">Recombination proteins and rescue of arrested replication forks.</a> DNA Repair (Amst). 6 (7), 967-980 (2007).</li><li>Carl, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+mutants+with+temperature-sensitive+synthesis+of+DNA.">Escherichia coli mutants with temperature-sensitive synthesis of DNA.</a> Mol Gen Genet. 109 (2), 107-122 (1970).</li><li>Nawotka, K. A., Huberman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+gel+electrophoretic+method+for+mapping+DNA+replicons.">Two-dimensional gel electrophoretic method for mapping DNA replicons.</a> Mol Cell Biol. 8 (4), 1408-1413 (1988).</li><li>Cole, R. S., Levitan, D., Sinden, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+psoralen+interstrand+cross-links+from+DNA+of+Escherichia+coli:+mechanism+and+genetic+control.">Removal of psoralen interstrand cross-links from DNA of Escherichia coli: mechanism and genetic control.</a> J Mol Biol. 103 (1), 39-59 (1976).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

During chromosome duplication, the replication machinery will encounter various impediments that prevent its progress. To ensure the entire single-origin chromosome is replicated, bacteria have numerous pathways for repair of the DNA that then enables the replisome to be reloaded20,21. Lesions, single stranded breaks, double stranded breaks and proteins tightly bound to the DNA may each be dealt with using a dedicated pathway, although there is likely to be significant overlap in these pathways. The most commo...

Durante la replicación del ADN, la replisome se enfrenta a obstáculos en el ADN que deterioran su progresión. Daño del ADN incluyendo lesiones y vacíos, así como estructuras aberrantes pueden prevenir la replisome de proceder 1. Recientemente, se ha encontrado que las proteínas unidas al ADN son la fuente más común de impedimento a la replicación progresión tenedor 2. El conocimiento de los eventos siguientes el encuentro de la replisome con un bloque de nucleoproteína previamente ha sido limitado por la incapacidad para inducir un bloque de este tipo en el cromosoma de una célula viva en una ubicación conocida. El análisis in vitro ha mejorado nuestra comprensión del comportamiento cinético de un replisome activa cuando se encuentra con una obstrucción nucleoproteína 3, así como los detalles mecanicistas de la propia 4,5 replisome. El conocimiento actual de la reparación de la replicación se realiza generalmente con UV como agente dañino y estudió el uso de ADN plásmido in vivo 6-8 </sarriba&gt;. Mientras que las proteínas que pueden estar implicados en la reparación del ADN después de que se encuentra un bloque de nucleoproteína in vivo son generalmente comprendidas a partir de estos estudios, si hay variaciones en los eventos moleculares dentro de las vías de reparación debido a la causa distinta en el bloque de la replicación sigue siendo todavía estar determinado. A continuación, describimos un sistema que permite a un bloque de nucleoproteína que se establecerá en una ubicación específica del cromosoma usando un sistema de operador represor fluorescente (FROS). Utilizamos una cepa de E. coli que ha tenido una serie de 240 sitios teto incorporados en el cromosoma 9. Cada sitio tetO dentro de la matriz tiene una secuencia aleatoria de 10 pb que lo flanquean para aumentar la estabilidad de la matriz mediante la prevención de la recombinación mediada por RecA dentro de la matriz. Esta matriz, y variaciones de la misma, se utilizaron originalmente para entender E. coli dinámica de los cromosomas 10,11, pero luego fueron adaptados a prevent replicación in vivo 12. La matriz se ha encontrado que se mantiene de manera estable y para bloquear cerca de 100% de las horquillas de replicación cuando se une por TetR 10,12. El uso de la matriz Laco similares in vitro ha encontrado tan pocos como 22 sitios eran suficientes para bloquear el 90% de la replicación, aunque esta matriz más corto fue menos eficaz in vivo 13. Para adaptar la matriz para crear un bloqueo nucleoproteína, la proteína represora debe ser altamente producida en exceso en condiciones optimizadas donde se une a la matriz para crear un control de carretera. La formación de la obstrucción, y su posterior liberación, pueden ser controlados mediante el uso de microscopía de fluorescencia si se utiliza una variante marcado con fluorescencia del represor Tet. El estado de la replicación en cada celda se indica mediante el número de focos visto, donde un único punto focal significa sólo una copia de la matriz está presente dentro de la célula y múltiples focos son indicativos de replicación activa. Esta re activaplicatura está habilitada cuando el bloqueo nucleoproteína se invierte por la adición del inductor gratuito que disminuye la afinidad de unión de TetR para el sitio operador suficientemente para que el replisome para proceder a través de la matriz. La proteína represora es todavía capaz de unirse al ADN con afinidad suficientemente alta para que los ahora múltiples copias de la matriz pueden ser visualizados. Más detalles intrincados de los eventos en el bloqueo de la nucleoproteína se pueden descubrir mediante electroforesis en gel neutro neutro de dos dimensiones de agarosa y la hibridación de Southern 14-16. Estas técnicas permiten el análisis de estructuras de ADN en toda la población. Los intermediarios de replicación que se forman durante el evento, y potencialmente permanecen sin reparar, puede ser visualizado. Mediante la variación de la enzima de restricción y la sonda se utilizan, los intermedios se pueden visualizar no sólo en la región de matriz, pero también aguas arriba de la matriz cuando el tenedor de replicación retrocede 17,18. losregresión se hayan producido después de la disociación replisome; los principales y menos hebras nacientes separan de las cadenas de molde y recocido entre sí como las cadenas de molde simultáneamente re-recocido resulta en una estructura de ADN de cuatro direcciones (una unión de Holliday). El uso de este sistema se ha demostrado que el tenedor de replicación no es estable cuando se encuentra con este bloque 18. Además, los derivados sensibles a la temperatura de los componentes replisome se pueden utilizar para evitar la recarga de la tenedor de replicación una vez que se ha colapsado. Una vez que se estableció un bloque, la cepa se puede desplazar a una temperatura no permisiva para asegurar una desactivación síncrona del replisome y una prevención controlada de recarga. Esta desactivación inducida por la temperatura asegura todas las horquillas dentro de la población se han derrumbado en un momento dado y permite la evaluación de lo que sucede cuando el replisome colapsa, cómo se procesa el ADN, y lo que se requiere para volveriniciar el proceso de replicación del ADN. Una ventaja del sistema descrito aquí es que el bloque de nucleoproteína es completamente reversible; Por lo tanto, la capacidad de las células para recuperarse de la nucleoproteína bloque es capaz de seguir. La adición de anhidrotetraciclina a las células aliviará la estrecha unión del represor, permitiendo que un tenedor de replicación para proceder a través de la célula y para recuperar la viabilidad. El alivio de la obstrucción se puede visualizar por electroforesis en gel de agarosa de dos dimensiones neutral-neutral después de 5 min, y por microscopía dentro de 10 min. Además, el análisis de viabilidad puede revelar la capacidad de la cepa para recuperarse de la obstrucción replicación y continuar proliferando. Al alterar el fondo genético de las cepas utilizadas en el procedimiento experimental descrito aquí, las vías de reparación de este tipo de obstrucción puede ser dilucidado.

<table><tbody><tr><td>Tryptone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16922</td><td>Growth media component</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>VWR</td><td>27810.364</td><td>Growth media component</td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92144</td><td>Growth media component</td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>Growth media component; Potassium buffer component</td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td>Growth media component; Potassium buffer component</td></tr><tr><td>L-Arabinose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256</td><td>For induction of TetR-YFP production</td></tr><tr><td>Anhydrotetracycline hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>37919</td><td>Release of replication bloackage</td></tr><tr><td>Axioskop 2 Fluorescence microscope</td><td>Zeiss</td><td>452310</td><td>Visualization of cells</td></tr><tr><td>eYFP filter set</td><td>Chroma Technology</td><td>41028</td><td>Visualization of YFP</td></tr><tr><td>CCD camera</td><td>Hamamatsu</td><td>Orca-AG</td><td>Visualization of cells</td></tr><tr><td>MetaMorph&amp;nbsp; Software (Molecular Devices)</td><td>SDR Scientific</td><td>31282</td><td>Version 7.8.0.0 used in the preparation of this manuscript</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td>For agarose plugs and gel electrophoresis</td></tr><tr><td>Original Glass Water Repellent (Rain-X)</td><td>Autobarn</td><td>DIO1470</td><td>For agarose plug manufacture</td></tr><tr><td>TRIS</td><td>VWR</td><td>VWRC103157P</td><td>TE, TBE buffer component</td></tr><tr><td>Ethylene diaminetetraacetic acid</td><td>Ajax Finechem</td><td>AJA180</td><td>0.5 M EDTA disodium salt solution adjusted to pH 8.0 with NaOH.</td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Bacteriostatic agent</td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td>TE buffer component</td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td>Cell lysis buffer component</td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine sodium salt (Sarkosyl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5125</td><td>Cell lysis and ESP buffer component</td></tr><tr><td>Rnase A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td>Cell lysis buffer component</td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Amresco</td><td>6300</td><td>Cell lysis buffer component</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Amresco</td><td>AM0706</td><td>ESP buffer component</td></tr><tr><td>Sub-Cell Model 192 Cell</td><td>BioRad</td><td>1704507</td><td>Electrophoresis system</td></tr><tr><td>UV transilluminator 2000</td><td>BioRad</td><td>1708110</td><td>Visualization of DNA</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>BioRad</td><td>1610433</td><td>Visualization of DNA</td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>VWR</td><td>PROL20185.360</td><td>TBE component</td></tr><tr><td>Hybond-XL nylon memrbane</td><td>Amersham</td><td>RPN203S</td><td>Zeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159) can also be used</td></tr><tr><td>3MM Whatman chromatography paper</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3030690</td><td>Southern blotting</td></tr><tr><td>HL-2000 Hybrilinker</td><td>UVP</td><td>95-0031-01/02</td><td>Crosslinking of DNA and hybridization</td></tr><tr><td>Deoxyribonucleic acid from salmon sperm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31149</td><td>Hybridization buffer component</td></tr><tr><td>Sodium hydroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td>Denaturation buffer component</td></tr><tr><td>Trisodium citrate dihydrate</td><td>VWR</td><td>PROL27833.363</td><td>Transfer buffer</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulphate (SDS)</td><td>Amresco</td><td>227</td><td>Wash buffer component</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>Hybridization buffer component</td></tr><tr><td>Random Hexamer Primers</td><td>Bioline</td><td>BIO-38028</td><td></td></tr><tr><td>Klenow fragment</td><td>New England BioLabs</td><td>M0212L</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Set</td><td>Bioline</td><td>BIO-39025</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&amp;rsquo;-triphosphate-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P-ATP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A</td><td></td></tr><tr><td>Storage Phosphor Screen</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>GEHE28-9564-76</td><td>BAS-IP MS 3543 E multipurpose standard 35 cm x 43 cm screen</td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9558-09</td><td>Visualization of blot</td></tr><tr><td>Hybridization bottle</td><td>UVP</td><td>07-0194-02</td><td>35 mm x 300 mm</td></tr></tbody></table>

inducing a site specific replication blockage in e. coli using a fluorescent repressor operator system

Los obstáculos presentes en el ADN, incluyendo proteínas unidas herméticamente y varias lesiones, pueden inhibir seriamente la progresión de la maquinaria de replicación de la célula. El estancamiento de un replisome puede conducir a su disociación de los cromosomas, ya sea en parte o en su totalidad, lo que lleva al colapso del tenedor de replicación. La recuperación de este colapso es una necesidad para que la célula con precisión completa la duplicación cromosómica y, posteriormente, dividir. diversos mecanismos, por lo tanto, cuando se produce el colapso, la célula ha evolucionado que se realizan para restaurar el tenedor de replicación del ADN y permitir que se completen con alta fidelidad. Anteriormente, estas vías de reparación de replicación en bacterias se han estudiado utilizando los rayos UV, que tiene la desventaja de no ser localizado en un sitio conocido. Este manuscrito describe un sistema que utiliza un sistema de fluorescencia represor de operador (FROS) para crear un bloque de proteína específica de sitio que puede inducir el estancamiento y el colapso de la replicación foRKS en Escherichia coli. Protocolos detalle cómo el estado de la replicación se puede visualizar en las células vivas individuales mediante microscopía de fluorescencia y la replicación del ADN intermedios pueden ser analizados por electroforesis en gel de agarosa al 2-dimensional. Mutantes sensibles a la temperatura de los componentes replisome (por ejemplo DnaBts) se pueden incorporar en el sistema para inducir un colapso síncrono de las horquillas de replicación. Por otra parte, las funciones de las proteínas de recombinación y helicasas que están implicados en estos procesos pueden ser estudiados utilizando knockouts genéticos dentro de este sistema.

El FROS es un bloque de nucleoproteína inducible, específico del sitio que permite intermediarios de replicación para ser visualizados en las células vivas 12,18. Un diseño experimental general para el muestreo de células se ilustra en la Figura 1. El momento de la toma de muestras y variaciones en los antecedentes genéticos hacen de este un sistema versátil para el estudio de la reparación de un bloque de este tipo. El esquema ilustra cómo sensibles...

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Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.

Induciendo un bloqueo de replicación de sitios en específico<i&gt; E. coli</i&gt; El uso de un sistema fluorescente represor operador

Obstacles present on DNA, including tightly-bound proteins and various lesions, can severely inhibit the progression of the cell&#39;s replication ...

inducing-site-specific-replication-blockage-e-coli-using-fluorescent

Research

JoVE Journal

Biology

Inducing a Site Specific Replication Blockage in E. coli Using a Fluorescent Repressor Operator System

8.9K vistas.  University of Newcastle. We describe here a system utilizing a site-specific, reversible in vivo protein block to stall and collapse replication forks in Escherichia coli. The establishment of the replication block is evaluated by fluorescence microscopy and neutral-neutral 2-dimensional agarose gel electrophoresis is used to visualize replication intermediates.

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Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In bacteria, the impact of the genetic context on the function of a genetic element can be difficult to assess. Several mechanisms, including topological effects, transcriptional interference from neighboring genes, and/or replication-associated gene dosage, may affect the function of a given genetic element. Here, we describe a method that permits the random integration of a DNA element into the chromosome of Escherichia coli and select the most favorable locations using a simple growth competition experiment. The method takes advantage of a well-described transposon-based system of random insertion, coupled with a selection of the fittest clone(s) by growth advantage, a procedure that is easily adjustable to experimental needs. The nature of the fittest clone(s) can be determined by whole-genome sequencing on a complex multi-clonal population or by easy gene walking for the rapid identification of selected clones. Here, the non-coding DNA region DARS2, which controls the initiation of chromosome replication in E. coli, was used as an example. The function of DARS2 is known to be affected by replication-associated gene dosage; the closer DARS2 gets to the origin of DNA replication, the more active it becomes. DARS2 was randomly inserted into the chromosome of a DARS2-deleted strain. The resultant clones containing individual insertions were pooled and competed against one another for hundreds of generations. Finally, the fittest clones were characterized and found to contain DARS2 inserted in close proximity to the original DARS2 location.

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Here, the power of a transposon-mediated random insertion of a non-coding DNA element was used to resolve its optimal chromosomal position.

Determinación de la óptima Localización cromosómica de un elemento de DNA en Escherichia coli utilizando un nuevo enfoque mediada por transposones

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Investigación

Genética

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the increase in gene copy number per cell provided by multicopy plasmids could accelerate the evolution of plasmid-encoded genes. In this work, we present an experimental system to test the ability of multicopy plasmids to promote gene evolution. Using simple molecular biology methods, we constructed a model system where an antibiotic resistance gene can be inserted into Escherichia coli MG1655, either in the chromosome or on a multicopy plasmid. We use an experimental evolution approach to propagate the different strains under increasing concentrations of antibiotics and we measure survival of bacterial populations over time. The choice of the antibiotic molecule and the resistance gene is so that the gene can only confer resistance through the acquisition of mutations. This &#34;evolutionary rescue&#34; approach provides a simple method to test the potential of multicopy plasmids to promote the acquisition of antibiotic resistance. In the next step of the experimental system, the molecular bases of antibiotic resistance are characterized. To identify mutations responsible for the acquisition of antibiotic resistance we use deep DNA sequencing of samples obtained from whole populations and clones. Finally, to confirm the role of the mutations in the gene under study, we reconstruct them in the parental background and test the resistance phenotype of the resulting strains.

Here we present an experimental method to test the role of multicopy plasmids in the evolution of antibiotic resistance.

Prueba el papel de Multicopy plásmidos en la evolución de resistencia a los antibióticos

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

The method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of curli genes under the control of a strong and metal-overinducible promoter, and in visualizing and quantifying the resulting gain of bacterial adherence. This method applies appropriate engineering principles of abstraction and standardization of synthetic biology, and results in the BBa_K540000 Biobrick (Best new Biobrick device, engineered, iGEM 2011).
The first step consists in the design of the synthetic operon devoted to curli overproduction in response to metal, and therefore in increasing the adherence abilities of the wild type strain. The original curli operon was modified in silico in order to optimize transcriptional and translational signals and escape the "natural" regulation of curli. This approach allowed to test with success our current understanding of curli production. Moreover, simplifying the curli regulation by switching the endogenous complex promoter (more than 10 transcriptional regulators identified) to a simple metal-regulated promoter makes adherence much easier to control.
The second step includes qualitative and quantitative assessment of adherence abilities by implementation of simple methods. These methods are applicable to a large range of adherent bacteria regardless of biological structures involved in biofilm formation. Adherence test in 24-well polystyrene plates provides a quick preliminary visualization of the bacterial biofilm after crystal violet staining. This qualitative test can be sharpened by the quantification of the percentage of adherence. Such a method is very simple but more accurate than only crystal violet staining as described previously 1 with both a good repeatability and reproducibility. Visualization of GFP-tagged bacteria on glass slides by fluorescence or laser confocal microscopy allows to strengthen the results obtained with the 24-well plate test by direct observation of the phenomenon.

The design of a synthetic operon encoding both the secretory apparatus and the structural monomers of curli fibers is described. Overproduction of these amyloids and adherent polymers allows a measurable gain of adherence of the E. coli chassis1. Easy ways to visualize and quantify adherence are explained.

Ingeniería bacterias adherentes mediante la creación de un único operón sintético curli

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

Bioingeniería

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite this similarity, these bacteria show extreme variations in characteristics like growth behavior, intensity of light emission or regulation of bioluminescence. The method presented here is a newly developed assay that combines recording of cell growth and bioluminescent light emission intensity over time utilizing a plate reader. The resulting growth and light emission characteristics can be linked to important features of the respective bacterial strain, such as quorum sensing regulation. The cultivation of a range of bioluminescent bacteria requires a specific medium (e.g., artificial sea water medium) and defined temperatures. The easy to handle, non-bioluminescent standard-research bacterium Escherichia coli (E. coli), on the other hand, can be cultivated inexpensively in high quantities in laboratory scale. Exploiting E. coli by introducing a plasmid containing the whole lux operon can simplify experimental conditions and additionally opens up many possibilities for future applications. The expression of all lux genes utilizing an E. coli expression strain was achieved by construction of an expression plasmid via Gibson cloning and insertion of four fragments containing seven lux genes and three rib genes of the lux-rib operon into a pET28a vector. E. coli based lux gene expression can be induced and controlled via Isopropyl-&#946;-D-thiogalactopyranosid (IPTG) addition resulting in bioluminescent E. coli cells. The advantages of this system are to avoid quorum sensing regulation restrictions and complex medium compositions along with non-standard growth conditions, such as defined temperatures. This system enables analysis of lux genes and their interplay, by the exclusion of the respective gene from the lux operon, or even addition of novel genes, exchanging the luxAB genes from one bacterial strain by another, or analyzing protein complexes, such as luxCDE.

In Situ Measurement and Correlation of Cell Density and Light Emission of Bioluminescent Bacteria

Bioluminescent bacteria regulate light production through a variety of mechanisms, such as quorum sensing. This novel method allows the in situ investigation of bioluminescence and the correlation of light emission to cell density. An artificial bioluminescent Escherichia coli system allows the characterization of lux operons, Lux proteins, and their interplay.

In Situ Medición y correlación de la densidad celular y emisión de luz de bacterias bioluminiscentes

There is a considerable number of bacterial species capable of emitting light. All of them share the same gene cluster, namely the lux operon. Despite ...

Bioquímica

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some factors act directly on virulence genes; others control pathogenesis by adjusting the expression of downstream regulators or the accumulation of signals that affect regulator activity. While regulation has been studied extensively during in vitro growth, relatively little is known about how gene expression is adjusted during infection. Such information is important when a particular gene product is a candidate for therapeutic intervention. Transcriptional approaches like quantitative, real-time RT-PCR and RNA-Seq are powerful ways to examine gene expression on a global level but suffer from many technical challenges including low abundance of bacterial RNA compared to host RNA, and sample degradation by RNases. Evaluating regulation using fluorescent reporters is relatively easy and can be multiplexed with fluorescent proteins with unique spectral properties. The method allows for single-cell, spatiotemporal analysis of gene expression in tissues that exhibit complex three-dimensional architecture and physiochemical gradients that affect bacterial regulatory networks. Such information is lost when data are averaged over the bulk population. Herein, we describe a method for quantifying gene expression in bacterial pathogens in situ. The method is based on simple tissue processing and direct observation of fluorescence from reporter proteins. We demonstrate the utility of this system by examining the expression of Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), whose gene product is required for immune evasion and full virulence ex vivo and in vivo. We show that nuc-gfp is strongly expressed in renal abscesses and reveal heterogeneous gene expression due in part to apparent spatial regulation of nuc promoter activity in abscesses fully engaged with the immune response. The method can be applied to any bacterium with a manipulatable genetic system and any infection model, providing valuable information for preclinical studies and drug development.

Described here is a method for analyzing bacterial gene expression in animal tissues at a cellular level. This method provides a resource for studying the phenotypic diversity occurring within a bacterial population in response to the tissue environment during an infection.

Un método basado en la fluorescencia para el estudio de regulación de los genes bacterianos en los tejidos infectados

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process starts by screening for colonies that survive on minimal media, assuming that only Escherichia coli harboring the correct plasmid will be able to thrive in the specific conditions. Since the process of building large genetic circuits, requiring the assembly of many DNA parts, is challenging, circuit components are often distributed between multiple plasmids at different copy numbers requiring the use of several antibiotics. Mutations in the plasmid can destroy transcription of the antibiotic resistance genes and interject with resources management in the cell leading to necrosis. The selected colony is set on a glass-bottom Petri dish and a few focus planes are selected for microscopy tracking in both bright field and fluorescent domains. The protocol maintains the image focus for more than 12 hours under initial conditions that cannot be regulated, creating a few difficulties. For example, dead cells start to accumulate in the lenses' field of focus after a few hours of imaging, which causes toxins to buildup and the signal to blur and decay. Depletion of nutrients introduces new metabolic processes and hinder the desired response of the circuit. The experiment's temperature lowers the effectivity of inducers and antibiotics, which can further damage the reliability of the signal. The minimal media gel shrinks and dries, and as a result the optical focus changes over time. We developed this method to overcome these challenges in Escherichia coli, similar to previous works developing analogous methods for other micro-organisms. In addition, this method offers an algorithm to quantify the total stochastic noise in unaltered and altered cells, finding that the results are consistent with flow analyzer predictions as shown by a similar coefficient of variation (CV).

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

This work presents a microscopy method that allows live imaging of a single cell of Escherichia coli for analysis and quantification of the stochastic behavior of synthetic gene circuits.

Medición continua del ruido biológico en Escherichia Coli mediante microscopía de lapso de tiempo

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

Mapeo bacterianas redes funcionales y vías en<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Utilizando matrices sintéticas genéticos

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Biología

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage (CoTrAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method makes it possible to count the numbers of protein molecules produced in one cell during sequential, five-minute time windows. It requires a fluorescence microscope with laser excitation power density of ~0.5 to 1 kW/cm2, which is sufficiently sensitive to detect single fluorescent protein molecules in live cells. The fluorescent reporter used in this method consists of three parts: a membrane targeting sequence, a fast-maturing, yellow fluorescent protein and a protease recognition sequence. The reporter is translationally fused to the N-terminus of a protein of interest. Cells are grown on a temperature-controlled microscope stage. Every five minutes, fluorescent molecules within cells are imaged (and later counted by analyzing fluorescence images) and subsequently photobleached so that only newly translated proteins are counted in the next measurement.
Fluorescence images resulting from this method can be analyzed by detecting fluorescent spots in each image, assigning them to individual cells and then assigning cells to cell lineages. The number of proteins produced within a time window in a given cell is calculated by dividing the integrated fluorescence intensity of spots by the average intensity of single fluorescent molecules. We used this method to measure expression levels in the range of 0-45 molecules in single 5 min time windows. This method enabled us to measure noise in the expression of the &lambda; repressor CI, and has many other potential applications in systems biology.

Single-molecule Imaging of Gene Regulation In vivo Using Cotranslational Activation by Cleavage CoTrAC

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC), to image the production of protein molecules in live cells with single-molecule precision without perturbing the protein's functionality. This method has been used to follow the stochastic expression dynamics of a transcription factor, the &lambda; repressor CI 1.

Una sola molécula de imágenes del Reglamento Gene<em&gt; En vivo</em&gt; Utilización de la activación cotraduccional por escisión (COTRAC)

We describe a fluorescence microscopy method, Co-Translational Activation by Cleavage (CoTrAC) to image the production of protein molecules in live cells ...

Generation of Marked and Markerless Mutants in Model Cyanobacterial Species

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation of cyanobacteria, especially model organisms such as Synechocystis sp. PCC6803 and Synechococcus sp. PCC7002, is a key tool for both basic and applied research. Generation of unmarked mutants, whereby chromosomal alterations are introduced into a strain via insertion of an antibiotic resistance cassette (a manipulatable fragment of DNA containing one or more genes), followed by subsequent removal of this cassette using a negative selectable marker, is a particularly powerful technique. Unmarked mutants can be repeatedly genetically manipulated, allowing as many alterations to be introduced into a strain as desired. In addition, the absence of genes encoding antibiotic resistance proteins in the mutated strain is desirable, as it avoids the possibility of 'escape' of antibiotic resistant organisms into the environment. However, detailed methods for repeated rounds of genetic manipulation of cyanobacteria are not well described in the scientific literature. Here we provide a comprehensive description of this technique, which we have successfully used to generate mutants with multiple deletions, single point mutations within a gene of interest and insertion of novel gene cassettes.

Introducing multiple genomic alterations into cyanobacteria is an essential tool in the development of strains for industrial and basic research purposes. We describe a system for generating unmarked mutants in the model cyanobacterial species Synechocystis sp. PCC6803 and marked mutants in Synechococcus sp. PCC7002.

Generación de mutantes sin marcadores marcados y en el modelo de especies de cianobacterias

Cyanobacteria are ecologically important organisms and potential platforms for production of biofuels and useful industrial products. Genetic manipulation ...

Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far elusive how DSBs affect transcription. A reason for this was the lack of suitable tools to simultaneously monitor transcription and the induction of a genic DSB with sufficient temporal and spatial resolution. This work describes a set of new reporters that directly visualize transcription in live cells immediately after the induction of a DSB in the DNA template. Bacteriophage RNA stem-loops are employed to monitor the transcription with single-molecule sensitivity. For targetting the DSB to a specific gene region, the reporter genes are engineered to contain a single recognition sequence of the homing endonuclease I-SceI, otherwise absent from the human genome. A single copy of each reporter gene was integrated into the genome of human cell lines. This experimental system allows the detection of single RNA molecules generated by the canonical gene transcription or by DNA break-induced transcription initiation. These reporters provide an unprecedented opportunity for interpreting the reciprocal interactions between transcription and DNA damage and to disclose hitherto unappreciated aspects of DNA break-induced transcription.

This protocol presents a new reporter gene system and the experimental setup to detect transcription at DNA double-strand breaks with single-molecule sensitivity.

Imágenes de células vivas de la actividad transcripcional en roturas de doble cadena de ADN

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far ...

Induciendo un bloqueo de replicación de sitios en específico

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