Damos las gracias a los demás miembros del equipo iGEM INSA Lyon-ENS (Viviane Chansavang, Dumond Mathilde, Duprey Alexandre, Geffroy Mélanie, Gonthier Clémence, Jaulin Margaux, Haag Aurélie, Ly Goki, Poinsot Thomas, Béryl Royer-Bertrand, Soula Julie, Michael Vonzy , Pierre Yves Zundel, Soufiane Bouhmadi, Brette Olivier, Chambonnier Gaël, Izard Laura, Kroiss Aurianne, Philippe Lejeune, Rodrigue Agnès, Rondelet Arnaud, Reverchon Sylvie y Desjardin Valérie), nuestros patrocinadores por su apoyo financiero (bioMérieux, Assystem, EDF, Fundación INSA, ENS-Lyon y el Departamento de Biociencias INSA de Lyon), F. Wisniewski-Dyé para la lectura crítica de este manuscrito y el Dr. Sze CC para el regalo de la tensión. Drogue B. recibe un doctorado comunión de la Región Rhône-Alpes.

1. BioBrick Diseño y Síntesis de la Operon curli <ol><li> Determinar la organización genética y localizar las señales endógenas transcripción y la traducción de los genes curli. Estas informaciones están reunidos en bases de datos especializadas, tales como RegulonDB una o ECOGENE b y terminado por una lectura cuidadosa de las publicaciones pertinentes. Gestión de datos y en preanalítica silico se realizaron con el software Clone c Manager. </li><li> Seleccione las secuencias de codificación pertinentes. Un conjunto de cinco genes absolutamente necesario para la síntesis de curli (CSGB y csgA monómeros de fibra de codificación) y exportación (CSGE CSGF y csgG, que codifica el complejo de la secreción de Curlin) fueron seleccionados para construir el operón sintético. Extraer las secuencias elegidas de la base de datos en formato FASTA. A medida que el clúster csgGFE es antisentido en E. coli genoma, convertir esta secuencia en su counterp complemento inversoarte mediante el uso de las herramientas de Operations Manager Clon&gt; molécula Proceso&gt; Invertir molécula. Pegue la secuencia csgEFG detrás csgBA mediante el uso de la función &quot;Lígate&quot; (Clone&gt; Lígate). </li><li> Añadir el promotor adecuado. Mediante la colocación de los cinco genes seleccionados curli bajo el control del promotor P RCN, curli se prevé que se produce en exceso en presencia de cobalto y níquel. El locus rcn codifica una bomba de eflujo responsable de la desintoxicación Ni y Co (RCNA) y sus afines regulador metalo-(rcnR). RcnR controla la expresión de RCNA y su propio gen en respuesta a Ni y Co 19. La secuencia de RCN comprende CDS rcnR, la región intergénica RCN conjunto más los 41 primeros nucleótidos de RCNA era placedin frente de la secuencia de csgBAEFG quimérico (Figura 1, la secuencia de la construcción entera se proporciona como datos suplementarios). </li><li> Optimizar la transcripciónseñales. Un perfecto sitio de unión al ribosoma (RBS o perfecto = AAGGAGGTATATA) se añadió en frente de la primera ATG de la secuencia de ADN csgBA. Un segundo RBS perfecto se añadió en frente de la secuencia csgEFG. Endógeno RBS para la CSGB y genes CSGF csgG y se conservaron. </li><li> Para adaptarse a las normas iGEM, el dispositivo debe estar flanqueado por una norma BioBrick prefijo y sufijo, que contiene sitios de restricción para Eco RI, Pst I (prefijo) y Spe I y Xba I (sufijo). Pega las secuencias correspondientes en cada extremo del dispositivo d. </li><li> Eliminar cualquier Eco RI, Pst I, Spe I y Xba I en el sitio de reconocimiento del dispositivo. Para facilitar el proceso de montaje adicional, la parte BioBrick sí mismo no puede contener ninguno de estos sitios de restricción. En el análisis de restricción silico del dispositivo reveló un sitio Pst I en la secuencia csgA, un sitio Pst I en la secuencia rcnRy un sitio Eco RI en el gen CSGE. Estos sitios están situados respectivamente en la posición 80 (Mut1), 1340 (Mut2) y 1830 (MUT3) de la secuencia de dispositivos (de datos) y se modificaron de la siguiente manera por mutaciones silenciosas. Mut1 Pst I sitio CTGCAG cambiado en CGTCTG Mut2 Pst I sitio CTGCAG cambiado en CAGCAG Mut3 Eco RI GAATTC sitio cambiado en GAATT </li><li> Ejecutar a través de la simulación de traducción utilizando el software Clone Manager (Funcionamiento&gt; moléculas de procesos&gt; Traducir moléculas). Utilice la secuencia de alineación BLAST programa para comprobar la homología perfecta entre la proteína de tipo salvaje curli y las proteínas codificadas por el operón sintético. </li><li> Pide el operón sintético. Los servicios comerciales de síntesis de genes están disponibles en numerosas compañías a nivel mundial, nuestro compañero estaba Genecust (Luxemburgo). 4 g del operón artificial (3165 bp) se recibió semanas más tarde y se insertó en pUC57 (pIG2). </li></ol>2. Visualizar y cuantificar bacterias adheridas en poliestireno <ol><li> Llenar cada pocillo de una placa de poliestireno de 24 pocillos con 2 ml de medio mínimo M63 (glucosa 0,2%) e inocular cada pocillo con 106 células de un cultivo durante la noche. Crecer las bacterias a 30 º C durante 18 a 48 horas sin agitación. Cada columna (4 pocillos) representa una modalidad. Añadir la cantidad apropiada de cobalto (25 a 100 mM) y antibióticos (ampicilina 100 μg.L -1) cuando sea necesario. Las 3 primeras filas de la placa de 24-así se utilizan para cuantificar las bacterias adherentes por el promedio de las 3 repeticiones, la última fila de la izquierda se utiliza para visualizar la biopelícula. </li><li> Para las 3 primeras filas de la placa de 24-así: para cada pocillo, recuperar el sobrenadante que contiene las células planctónicas. </li><li> Enjuagar cuidadosamente cada pocillo con 1 ml de M63 y la piscina de lavado de 1 ml con el sobrenadante inicial obtenida en 2,2). Esta agrupación se denominan células de natación (= S). </li><li> Recuperar el biofilm en 1 ml of M63 raspando y pipetear hacia arriba y hacia abajo (= B). Vortex 15 sec. Estimar el número de bacterias adheridas en la superficie o natación desde la densidad óptica a 600 nm (DO600) para dar el porcentaje de adherencia correspondiente a cada modalidad. </li><li> El porcentaje de adhesión se calcula utilizando la fórmula: BX100 / (3xs + B). </li><li> Sólo para la última fila de la placa de 24 pocillos: descartar las células planctónicas. </li><li> Enjuague con 1 ml de M63 el biofilm que se había desarrollado en la parte inferior de la placa. </li><li> Secar la placa abierta durante 1 hora a 80 ° C. </li><li> Añadir 100 ml de cristal violeta al 20% durante 2 min en cada pocillo seguido de lavados extensivos con agua para visualizar las bacterias adheridas en la superficie. Tres ensayos independientes (placas) tienen que ser realizadas para asegurar la reproducibilidad. </li></ol> 3. Visualice las bacterias adheridas sobre el vidrio por Microscopía <ol><li> Obtener un chasis fluorescente. La E. coli SCC1 e cepa que constitutively expresa la proteína verde fluorescente (GFP), sin diferencia observable a partir de la cepa madre MG1655 20 es un huésped adecuado para el plásmido que lleva el operón sintético curli. </li><li> SCC1 transformar con el plásmido pIG2 (= operón sintético curli insertado en el fragmento Eco RI / Pst I sitio del plásmido pUC57) para obtener la cepa S23. Transformar SCC1 con un plásmido control (pUC18) para obtener la cepa de control S24 21. </li><li> Crecer precultivos de la noche a la mañana S23 y del control (S24) de las cepas a 30 º C en M63 suplementado con glucosa (0,2%) y ampicilina (100 μg.L -1). </li><li> Inocular 15 ml del mismo medio en placas de Petri con 100 l de los precultivos. Añadir la concentración adecuada de cobalto (es decir, 25 mM) y no se olvide el control negativo sin cobalto. Introducir 3 cubreobjetos de vidrio rectangular en cada placa de Petri. Incubar durante una noche a 30 ° C sin agitación. </li><li> Quite el cubreobjetos de aquí para allám la placa de Petri y cuidadosamente drenarlo. Limpie cuidadosamente la cara inferior con un pequeño algodón impregnado cosas con etanol 70 ° frotando cada residuo bacteriano. Para la observación confocal, limpiar ambos extremos superiores en unos pocos milímetros para permitir la fijación adicional de la cubreobjetos. </li><li> Bacterias adherentes pueden ser visualizados directamente pero rápidamente bajo microscopio de fluorescencia, pero cuidadosamente evitar el secado de la muestra. </li><li> Para la observación confocal, depositar el cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio con la cara superior cubierta por la biopelícula coloca boca arriba. La biopelícula se cubre con un cubreobjetos más grande, que está fijado a la placa de vidrio con el barniz. Invertir la configuración de modo que el biofilm estará ahora en la cara inferior. </li><li> Coloque la configuración en el microscopio láser confocal. Un derecho Axioplan2 LSM510 (Zeiss) microscopio láser confocal se utilizó en la plataforma Platim f. </li><li> Configuración. Excite GFP a 488 nm, y recoger la fluorescencia de bacterias en el intervalo de 500 a 600 nm<html> . Utilice objetivo de 40x de inmersión en aceite para la adquisición de imágenes en modo de escaneo láser confocal. Analizar los generales estructuras tridimensionales de las biopelículas de la superficie sólida a la interfaz con el medio de crecimiento, utilizando un paso de 1 m. </li><li> Realizar proyecciones tridimensionales con Imaris software (Bitplane, Zürich, Suiza). Determine el espesor de la biopelícula por el análisis de la media del valor z a lo largo de secciones longitudinales estadísticos. Cuantificación de biovolumes biopelícula puede ser extraído de confocal z-pilas tal como se describe en otra parte 22. </li></ol> un RegulonDB proporciona información mecanicista sobre operón organización y su descomposición en unidades de transcripción, promotores y su tipo sigma, los genes y sus sitios de unión al ribosoma, terminadores, sitios de unión específicos de reguladores transcripcionales, así como su organización en frases reguladoras.et = &quot;_blank&quot;&gt; http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp b La base de datos Ecogene contiene información actualizada acerca de la E. coli K-12 del genoma y proteoma secuencias de genes, incluyendo bibliografías extensas. Un enfoque Ecogene importante ha sido la re-evaluación de los sitios de inicio de traducción. <a href="http://ecogene.org/" target="_blank">http://ecogene.org/</a> c <a href="http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm" target="_blank">http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm</a> d <a href="http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix" target="_blank">http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix</a> e Regalo de Chun Chau Sze, Nan Yang Universidad Técnica de Singapur. f Platim microscópico plataforma UMS3444 BioSciences Gerland - Lyon Sud.

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No hay conflictos de interés declarado.

Los pasos críticos El paso más crítico en este enfoque de la biología sintética es el diseño de genes. Diseño gen sintético tiene que ser meticuloso para asegurar una producción eficiente del sistema. Dos genes que codifican los monómeros de fibras y tres genes que codifican proteínas implicadas en su sistema de secreción han sido ensamblados con un promotor fuerte y metal-inducible para crear una nueva unidad funcional para una aplicación novedosa: la bio-descontaminación de eflu...

La adherencia bacteriana al apoyo abiótico juega un papel importante en las celdas de combustible de biorremediación, biocatálisis o microbiana. Procesos de biorremediación utilizar las capacidades de los microorganismos para degradar las sustancias orgánicas, o para modificar la distribución de metal (inmovilización, volatilización) o especiación. Estas actividades beneficiosos se observan en los ecosistemas acuáticos y terrestres, sino también en los sistemas artificiales desarrollados para tratar el agua contaminada de los residuos industriales y domésticos. La intensidad y la calidad de la de la actividad microbiana dependerá de factores físico-químicas, sino también en el estilo de vida de los microorganismos (libre flotación o incrustados en biofilm). La formación de biopelículas se asocia con un metabolismo de promover la resistencia a los biocidas por diversos mecanismos. Este fenómeno lo tanto, se recomienda en la mayoría de procesos de biorremediación. Además, la ingeniería células de Escherichia coli para controlar la formación de biopelículas se ha aplicado con éxito ainmovilizar células enteras sensores de biochips 2-3. La adaptación de los microorganismos a alta concentración de metales se produce a través de diversos mecanismos tales como la adsorción a los componentes de la matriz extracelular, la activación de la bomba de eflujo o portadores específicos capaces de concentrar el metal en la célula. Impulsar estas actividades bacterianas a través de la ingeniería genética permite el tratamiento eficaz y barato de contaminación por metales a escala de laboratorio, especialmente en el caso de metales altamente tóxicos en cantidad débil tal como se describe por Raghu et al. 2008 4. Remediación bacteriana representa en este caso un método de ahorro competitivo y rentable en comparación con los procesos químicos clásicos utilizando resinas de intercambio iónico. Los autores describen una E. chasis coli genéticamente modificada para la captación y retención de cobalto primero por la anulación de la bomba de eflujo gen que codifica RCNA, y luego por la transformación con un exceso de producción de múltiples copias de plásmido que permite unatransportador con una captación preferencial para el cobalto. Tal cepa aparece como una alternativa eficaz a resinas de intercambio iónico para el tratamiento de efluentes radiactivos, pero un problema no resuelto es la clave de recuperación de bacterias contaminadas al final del proceso 4. El objetivo de nuestro trabajo fue por lo tanto, para diseñar una cepa de diseño personalizado capaz de pegarse a soportes abióticos tales como vidrio o plástico. Entre el conjunto de adhesinas y fimbrias adherentes identificado en bacterias Gram-, se optó por diseñar un sistema que permita la producción curli. Curli son fibras amiloides delgadas (2-5 nm de diámetro) y agregación altamente que sobresalen de la E. coli y Salmonella como 5-7 superficie de una matriz no cristalina e insoluble. Curli también están involucrados en la colonización de superficies abióticas y el desarrollo de biopelículas 8. Curli se demostró recientemente que unirse a los iones de mercurio 9. Los amiloides son de hecho se sabe que poseen altoafinidad por los iones de metales tales como Cu 2 +, Zn 2 + y Fe 3 + 10. Esta propiedad podría mejorar aún más la descontaminación de metales de efluentes contaminados. El clúster csg es responsable de la producción de fibras de curli y está constituido de dos operones divergentemente transcritos (Figura 1). El CSGB, csgA y genes CSGC constituyen el operón de sentido, que codifican las dos subunidades curli, csgA y CSGB. CSGC parece estar involucrado en la actividad redox en el sistema de biogénesis curli y afectar al comportamiento CsgG poro 11. Sin embargo, la ausencia de CSGC en la mayoría de las bacterias productoras de curli indica que la proteína correspondiente proporciona sólo un nivel secundario de control sobre la biogénesis curli. Para simplificar el sistema, que han sido elegidos para trabajar con el mínimo número de genes. El csgDEFG operonencodes proteínas esenciales en la regulación y transportede csgA y CSGB a la superficie celular. CsgD es un activador transcripcional del operón csgBAC y desempeña un papel clave en el control de la formación de biopelículas mediante el control de la producción de fimbrias curli y otros componentes de la biopelícula como la celulosa y 12 por inhibición de la producción flagelo 13. CSGE, CSGF y CsgG constituyen un aparato secretor curli-específico en la membrana externa a través de la cual la mayor curli subunidad de la proteína csgA se secreta como una proteína soluble. La polimerización de csgA es dependiente in vivo en la membrana CSGB nucleador proteína (revisado en 14). Complejas vías reguladoras que involucran varios sistemas de dos componentes se han demostrado para controlar la expresión de genes curli 15-16. Estas complejas regulaciones permiten que las bacterias forman biofilms gruesas a través de la producción curli en respuesta a señales ambientales, pero son difíciles de controlar para aplicaciones industriales. Para facilitar la recuperación de la metal-rellenas bacterias durante un proceso industrial, la fijación de bacterias a un soporte sólido de hecho tiene que ser controlada por el parámetro bien definido (s). Las propiedades de adherencia de curli están vinculados a su naturaleza amiloide 17 y se podría utilizar para mejorar los procesos de biorremediación, pero un dispositivo más simple y controlado fácilmente tiene que ser creado. Entre estos 7 genes 18, un conjunto de 5 absolutamente necesario genes para la síntesis de curli (CSGB y csgA monómeros de fibra de codificación) y exportación (CSGE CSGF y csgG, que codifica el complejo de la secreción de curli) fueron seleccionados para construir el operón sintético. Para escapar de la &quot;natural&quot; regulación de curli, un operón sintético que comprende estos genes CSG 5 bajo el control de un promotor fuerte y cobalto overinducible-(Figura 2) fue diseñado y sintetizado. El análisis paso a paso de la región de codificación de curli y el procedimiento de diseño de un funcional SYNtético operón se describen. Dos métodos para visualizar y cuantificar la adherencia bacteriana al poliestireno cristal y se explican.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios (opcional) </td></tr><tr><td> pIG2 </td><td></td><td></td><td> pUC57 (ori pMB1, 2710 pb) con un 3165 pb EcoRI / PstI que contiene el fragmento sintético RCN P - csgBAEFG operón; Amp r </td></tr><tr><td> pUC18 </td><td></td><td></td><td> Plásmido multicopia (pMB1 ori, 2686 bp), Ampr </td></tr><tr><td> S23 </td><td></td><td></td><td> SSC1 (= GFP-etiquetados MG1655, regalo de CC Sze) / pIG2 </td></tr><tr><td> S24 </td><td></td><td></td><td> SSC1/pUC18 </td></tr><tr><td> CoCl 2 </td><td> Sigma </td><td></td><td> 0,1 M solución de mantenerse a temperatura ambiente </td></tr><tr><td> M63 </td><td></td><td></td><td> 29 </td&gt; </tr><tr><td> 24-así placa </td><td> Nunc </td><td> 55429 </td><td> Poliestireno de 24 pocillos </td></tr></tbody></table>

engineering adherent bacteria by creating a single synthetic curli operon

El método descrito aquí consiste en el rediseño de E. propiedades de adherencia coli mediante el ensamblaje de un número mínimo de genes curli bajo el control de un promotor fuerte y metal overinducible-, y en la visualización y cuantificación de la ganancia resultante de la adherencia bacteriana. Este método aplica los principios adecuados de ingeniería de la abstracción y la normalización de la biología sintética, y los resultados de la BioBrick BBa_K540000 (Mejor dispositivo BioBrick nuevo, creado, iGEM 2011). El primer paso consiste en el diseño del operón sintético dedicado a la sobreproducción curli en respuesta a metal, y por lo tanto, en el aumento de las capacidades de adherencia de la cepa de tipo salvaje. El original operón curli fue modificada in silico con el fin de optimizar las señales de transcripción y traducción y escapar de la &quot;natural&quot; la regulación de curli. Este enfoque permitió poner a prueba con éxito nuestra comprensión actual de la producción curli. Moreover, simplificar la regulación curli cambiando el promotor endógeno complejo (más de 10 reguladores transcripcionales identificados) a un simple metal-regulado promotor hace que la adherencia mucho más fácil de controlar. El segundo paso incluye la evaluación cualitativa y cuantitativa de las capacidades de adherencia por aplicación de métodos simples. Estos métodos son aplicables a una amplia gama de bacterias adherentes independientemente de las estructuras biológicas que participan en la formación de biopelículas. La adhesión de ensayo en placas de poliestireno de 24 pocillos proporciona una rápida visualización preliminar del biofilm bacteriano después de la tinción de cristal violeta. Esta prueba cualitativa puede ser intensificada por la cuantificación del porcentaje de adherencia. Tal método es muy simple, pero más precisa que la tinción con violeta de cristal como se describió anteriormente 1 tanto con una buena repetibilidad y reproducibilidad. Visualización de las bacterias buenas prácticas agrarias de etiquetado sobre portaobjetos de vidrio por fluorescencia o conf lásermicroscopía vecinal permite reforzar los resultados obtenidos con la prueba de la placa 24-bien por observación directa del fenómeno.

En silico anotación de la secuencia de tipo salvaje de E. csg coli K12 asociada con la optimización de las señales de transcripción y de la traducción ha permitido diseñar el único operón sintético curli P RCN-csg muestra en la Figura 3 (secuencia completa en los datos suplementarios). Protocolo 2 y 3 protocolo se utiliza para visualizar y cuantificar la adherencia asociada con la producción de curli. Uso de la tinción de cristal violeta en placas de poliestireno de...

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Engineering Adherent Bacteria by Creating a Single Synthetic Curli Operon

El diseño de un operón que codifica sintético tanto el aparato secretor y los monómeros estructurales de fibras curli se describe. La sobreproducción de estos amiloides y polímeros adherentes permite una ganancia apreciable de adhesión de la<em&gt; E. coli</em&gt; Chasis<sup&gt; 1</sup&gt;. Una manera fácil de visualizar y cuantificar la adherencia se explican.

Ingeniería bacterias adherentes mediante la creación de un único operón sintético curli

The  method described here consists in redesigning E. coli adherence properties by assembling the minimum number of  curli genes under the control of a ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.4K vistas.  Université de Lyon. El diseño de un operón que codifica sintético tanto el aparato secretor y los monómeros estructurales de fibras curli se describe. La sobreproducción de estos amiloides y polímeros adherentes permite una ganancia apreciable de adhesión de la E. coli Chasis 1. Una manera fácil de visualizar y cuantificar la adherencia se explican.

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Procedure for Lung Engineering

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths annually; chronic obstructive pulmonary disease is currently the fourth leading cause of death in the United States1. Contributing to this mortality is the fact that lungs do not generally repair or regenerate beyond the microscopic, cellular level. Therefore, lung tissue that is damaged by degeneration or infection, or lung tissue that is surgically resected is not functionally replaced in vivo. To explore whether lung tissue can be generated in vitro, we treated lungs from adult rats using a procedure that removes cellular components to produce an acellular lung extracellular matrix scaffold. This scaffold retains the hierarchical branching structures of airways and vasculature, as well as a largely intact basement membrane, which comprises collagen IV, laminin, and fibronectin. The scaffold is mounted in a bioreactor designed to mimic critical aspects of lung physiology, such as negative pressure ventilation and pulsatile vascular perfusion. By culturing pulmonary epithelium and vascular endothelium within the bioreactor-mounted scaffold, we are able to generate lung tissue that is phenotypically comparable to native lung tissue and that is able to participate in gas exchange for short time intervals (45-120 minutes). These results are encouraging, and suggest that repopulation of lung matrix is a viable strategy for lung regeneration. This possibility presents an opportunity not only to work toward increasing the supply of lung tissue for transplantation, but also to study respiratory cell and molecular biology in vitro for longer time periods and in a more accurate microenvironment than has previously been possible.

We have developed a decellularized lung extracellular matrix and novel biomimetic bioreactor that can be used to generate functional lung tissue. By seeding cells into the matrix and culturing in the bioreactor, we generate tissue that demonstrates effective gas exchange when transplanted in vivo for short periods of time.

Procedimiento para la Ingeniería de pulmón

Lung tissue, including lung cancer and chronic lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease, cumulatively account for some 280,000 deaths ...

Investigación

Bioingeniería

Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1 While microcontact printing can be employed to directly print a large number of molecules, including proteins,2 DNA,3 and silanes,4 the formation of self-assembled monolayers (SAMs) from long chain alkane thiols on gold provides a simple way to confine proteins and cells to specific patterns containing adhesive and resistant regions. This confinement can be used to control cell morphology and is useful for examining a variety of questions in protein and cell biology. Here, we describe a general method for the creation of well-defined protein patterns for cellular studies.5 This process involves three steps: the production of a patterned master using photolithography, the creation of a PDMS stamp, and microcontact printing of a gold-coated substrate. Once patterned, these cell culture substrates are capable of confining proteins and/or cells (primary cells or cell lines) to the pattern.
The use of self-assembled monolayer chemistry allows for precise control over the patterned protein/cell adhesive regions and non-adhesive regions; this cannot be achieved using direct protein stamping. Hexadecanethiol, the long chain alkane thiol used in the microcontact printing step, produces a hydrophobic surface that readily adsorbs protein from solution. The glycol-terminated thiol, used for backfilling the non-printed regions of the substrate, creates a monolayer that is resistant to protein adsorption and therefore cell growth.6 These thiol monomers produce highly structured monolayers that precisely define regions of the substrate that can support protein adsorption and cell growth. As a result, these substrates are useful for a wide variety of applications from the study of intercellular behavior7 to the creation of microelectronics.8
While other types of monolayer chemistry have been used for cell culture studies, including work from our group using trichlorosilanes to create patterns directly on glass substrates,9 patterned monolayers formed from alkane thiols on gold are straight-forward to prepare. Moreover, the monomers used for monolayer preparation are commercially available, stable, and do not require storage or handling under inert atmosphere. Patterned substrates prepared from alkane thiols can also be recycled and reused several times, maintaining cell confinement.10

Self-assembled monolayers (SAMs) formed from long chain alkane thiols on gold provide well-defined substrates for the formation of protein patterns and cell confinement. Microcontact printing of hexadecanethiol using a polydimethylsiloxane (PDMS) stamp followed by backfilling with a glycol-terminated alkane thiol monomer produces a pattern where protein and cells adsorb only to the stamped hexadecanethiol region.

La creación de dos dimensiones con dibujos sustratos para el confinamiento de proteínas y células

Microcontact printing provides a rapid, highly reproducible method for the creation of well-defined patterned substrates.1  While microcontact printing ...

Synthetic, Multi-Layer, Self-Oscillating Vocal Fold Model Fabrication

Sound for the human voice is produced via flow-induced vocal fold vibration. The vocal folds consist of several layers of tissue, each with differing material properties 1. Normal voice production relies on healthy tissue and vocal folds, and occurs as a result of complex coupling between aerodynamic, structural dynamic, and acoustic physical phenomena. Voice disorders affect up to 7.5 million annually in the United States alone 2 and often result in significant financial, social, and other quality-of-life difficulties. Understanding the physics of voice production has the potential to significantly benefit voice care, including clinical prevention, diagnosis, and treatment of voice disorders.
Existing methods for studying voice production include in vivo experimentation using human and animal subjects, in vitro experimentation using excised larynges and synthetic models, and computational modeling. Owing to hazardous and difficult instrument access, in vivo experiments are severely limited in scope. Excised larynx experiments have the benefit of anatomical and some physiological realism, but parametric studies involving geometric and material property variables are limited. Further, they are typically only able to be vibrated for relatively short periods of time (typically on the order of minutes).
Overcoming some of the limitations of excised larynx experiments, synthetic vocal fold models are emerging as a complementary tool for studying voice production. Synthetic models can be fabricated with systematic changes to geometry and material properties, allowing for the study of healthy and unhealthy human phonatory aerodynamics, structural dynamics, and acoustics. For example, they have been used to study left-right vocal fold asymmetry 3,4, clinical instrument development 5, laryngeal aerodynamics 6-9, vocal fold contact pressure 10, and subglottal acoustics 11 (a more comprehensive list can be found in Kniesburges et al. 12)
Existing synthetic vocal fold models, however, have either been homogenous (one-layer models) or have been fabricated using two materials of differing stiffness (two-layer models). This approach does not allow for representation of the actual multi-layer structure of the human vocal folds 1 that plays a central role in governing vocal fold flow-induced vibratory response. Consequently, one- and two-layer synthetic vocal fold models have exhibited disadvantages 3,6,8 such as higher onset pressures than what are typical for human phonation (onset pressure is the minimum lung pressure required to initiate vibration), unnaturally large inferior-superior motion, and lack of a "mucosal wave" (a vertically-traveling wave that is characteristic of healthy human vocal fold vibration).
In this paper, fabrication of a model with multiple layers of differing material properties is described. The model layers simulate the multi-layer structure of the human vocal folds, including epithelium, superficial lamina propria (SLP), intermediate and deep lamina propria (i.e., ligament; a fiber is included for anterior-posterior stiffness), and muscle (i.e., body) layers 1. Results are included that show that the model exhibits improved vibratory characteristics over prior one- and two-layer synthetic models, including onset pressure closer to human onset pressure, reduced inferior-superior motion, and evidence of a mucosal wave.

The methodology for fabricating synthetic vocal fold models is described. The models are life-sized and mimic the multi-layer structure of the human vocal folds. Results show the models to self-oscillate at pressures comparable to lung pressure and demonstrate flow-induced vibratory responses that are similar to those of human vocal folds.

Sintético, multi-capa, auto-oscilante Fabricación Vocal Modelo Doble

Sound for the human voice is produced via flow-induced vocal fold vibration. The vocal folds consist of several layers of tissue, each with differing ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to antigen presenting cells1-5. Internalization of nanoparticles (NP) by antigen presenting cells is a critical step in generating an effective immune response to the encapsulated antigen. To determine how changes in nanoparticle formulation impact function, we sought to develop a high throughput, quantitative experimental protocol that was compatible with detecting internalized nanoparticles as well as bacteria. To date, two independent techniques, microscopy and flow cytometry, have been the methods used to study the phagocytosis of nanoparticles. The high throughput nature of flow cytometry generates robust statistical data. However, due to low resolution, it fails to accurately quantify internalized versus cell bound nanoparticles. Microscopy generates images with high spatial resolution; however, it is time consuming and involves small sample sizes6-8. Multi-spectral imaging flow cytometry (MIFC) is a new technology that incorporates aspects of both microscopy and flow cytometry that performs multi-color spectral fluorescence and bright field imaging simultaneously through a laminar core. This capability provides an accurate analysis of fluorescent signal intensities and spatial relationships between different structures and cellular features at high speed.
	Herein, we describe a method utilizing MIFC to characterize the cell populations that have internalized polyanhydride nanoparticles or Salmonella enterica serovar Typhimurium. We also describe the preparation of nanoparticle suspensions, cell labeling, acquisition on an ImageStreamX system and analysis of the data using the IDEAS application. We also demonstrate the application of a technique that can be used to differentiate the internalization pathways for nanoparticles and bacteria by using cytochalasin-D as an inhibitor of actin-mediated phagocytosis.

In this article, we describe a method utilizing multi-spectral imaging flow cytometry to quantify the internalization of polyanhydride nanoparticles or bacteria by RAW 264.7 cells.

El análisis de la internalización celular de nanopartículas y bacterias en un Multi-espectral de Citometría de Flujo de imágenes

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix structure (e.g. composition, concentration, or stiffness of the matrix) vary over space, would enable a wide range of investigations concerning how these variables affect cell differentiation, migration, and other phenomena. The major challenge in creating layered matrices is maintaining the structural integrity of layer interfaces without diffusion of individual components from each layer1. Current methodologies to achieve this include photopatterning2-3, lithography4, sequential functionalization5, freeze drying6, microfluidics7, or centrifugation8, many of which require sophisticated instrumentation and technical skills. Others rely on sequential attachment of individual layers, which may lead to delamination of layers9. 
DGMP overcomes these issues by using an inert density modifier such as iodixanol to create layers of varying densities10. Since the density modifier can be mixed with any prepolymer or bioactive molecule, DGMP allows each scaffold layer to be customized. Simply varying the concentration of the density modifier prevents mixing of adjacent layers while they remain aqueous. Subsequent single step polymerization gives rise to a structurally continuous multilayered scaffold, in which each layer has distinct chemical and mechanical properties. The density modifier can be easily removed with sufficient rinsing without perturbation of the individual layers or their components. This technique is therefore well suited for creating hydrogels of various sizes, shapes, and materials.
A protocol for fabricating a 2D-polyethylene glycol (PEG) gel, in which alternating layers incorporate RGDS-350, is outlined below. We use PEG because it is biocompatible and inert. RGDS, a cell adhesion peptide11, is used to demonstrate spatial restriction of a biological cue, and the conjugation of a fluorophore (Alexa Fluor 350) enables us to visually distinguish various layers. This procedure can be adapted for other materials (e.g. collagen, hyaluronan, etc.) and can be extended to fabricate 3D gels with some modifications10.

Density Gradient Multilayered Polymerization DGMP: A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Here we describe a unique strategy for creating biocompatible, layered matrices with continuous interfaces between distinct layers for tissue engineering. Such a scaffold could provide an ideal customizable environment to modulate cell behavior by various biological, chemical or mechanical cues

Gradiente de densidad multicapa polimerización (DGMP): una técnica novedosa para la creación de multi-compartimiento, Andamios personalizables para Ingeniería de Tejidos

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a model microorganism. The biosensor relies on direct binding of the target bacteria cells onto its surface, while no pretreatment (e.g.&#160;by cell lysis) of the studied sample is required. A mesoporous Si thin film is used as the optical transducer element of the biosensor. Under white light illumination, the porous layer displays well-resolved Fabry-P&#233;rot fringe patterns in its reflectivity spectrum. Applying a fast Fourier transform (FFT) to reflectivity data results in a single peak. Changes in the intensity of the FFT peak are monitored. Thus, target bacteria capture onto the biosensor surface, through antibody-antigen interactions, induces measurable changes in the intensity of the FFT peaks, allowing for a &#39;real time&#39; observation of bacteria attachment.
The mesoporous Si film, fabricated by an electrochemical anodization process, is conjugated with monoclonal antibodies, specific to the target bacteria. The immobilization, immunoactivity and specificity of the antibodies are confirmed by fluorescent labeling experiments. Once the biosensor is exposed to the target bacteria, the cells are directly captured onto the antibody-modified porous Si surface. These specific capturing events result in intensity changes in the thin-film optical interference spectrum of the biosensor. We demonstrate that these biosensors can detect relatively low bacteria concentrations (detection limit of 104 cells/ml) in less than an hour.

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor for rapid bacteria detection is introduced. The biosensor is based on a nanostructured porous Si, which is designed to directly capture the target bacteria cells onto its surface. We use monoclonal antibodies, immobilized onto the porous transducer, as the capture probes. Our studies demonstrate the applicability of these biosensors for the detection of low bacterial concentrations within minutes with no prior sample processing (such as cell lysis).

Detección óptica de<em&gt; E. coli</em&gt; Bacterias por mesoporosos Silicon Biosensores

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Nanomanipulation of Single RNA Molecules by Optical Tweezers

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be increasingly important. As RNA function often depends on its ability to adopt alternative structures, it is difficult to predict RNA three-dimensional structures directly from sequence. Single-molecule approaches show potentials to solve the problem of RNA structural polymorphism by monitoring molecular structures one molecule at a time. This work presents a method to precisely manipulate the folding and structure of single RNA molecules using optical tweezers. First, methods to synthesize molecules suitable for single-molecule mechanical work are described. Next, various calibration procedures to ensure the proper operations of the optical tweezers are discussed. Next, various experiments are explained. To demonstrate the utility of the technique, results of mechanically unfolding RNA hairpins and a single RNA kissing complex are used as evidence. In these examples, the nanomanipulation technique was used to study folding of each structural domain, including secondary and tertiary, independently. Lastly, the limitations and future applications of the method are discussed.

Optical tweezers have been used to study RNA folding by stretching individual molecules from their 5&#8217; and 3&#8217; ends. Here common procedures are described to synthesize RNA molecules for tweezing, calibration of the instrument, and methods to manipulate single molecules.

Nanomanipulación de Soltero moléculas de ARN por Pinzas Ópticas

A large portion of the human genome is transcribed but not translated. In this post genomic era, regulatory functions of RNA have been shown to be ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Ingeniería de tejidos por intrínseca Vascularización en una<em&gt; En Vivo</em&gt; Cámara Ingeniería de Tejidos

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

Ingeniería Molecular Recognition con polímeros biomiméticos en una sola pared nanotubos de carbono

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

Using Synthetic Biology to Engineer Living Cells That Interface with Programmable Materials

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is made by creating two modules: a synthetically engineered strain of E. coli cells and a functionalized material interface. Within this paper, we detail a protocol for genetically engineering selected behaviors within a strain of E. coli using molecular cloning strategies. Once developed, this strain produces elevated levels of biotin when exposed to a chemical inducer. Additionally, we detail protocols for creating two different functionalized surfaces, each of which is able to respond to cell-synthesized biotin. Taken together, we present a methodology for creating a linked, abiotic-biotic system that allows engineered cells to control material composition and assembly on nonliving substrates.

This paper presents a series of protocols for developing engineered cells and functionalized surfaces that enable synthetically engineered E. coli to control and manipulate programmable material surfaces.

El uso de la biología sintética para Ingeniero células vivas que interactúan con materiales programables

We have developed an abiotic-biotic interface that allows engineered cells to control the material properties of a functionalized surface. This system is ...