Este protocolo en hierbas medición continua de circuitos genéticos en E.coli y el cálculo de la variabilidad de la señal y la relación señal-ruido en células bacterianas individuales para evaluar el rendimiento del circuito. Las principales ventajas de esta técnica son que es fácilmente adaptable a diferentes cepas y laboratorios, requiere un entrenamiento mínimo y sin equipo especial, y es relativamente barato. El ruido es un papel importante en la determinación de la funcionalidad de los sistemas biológicos.
Actualmente, existe interés en construir circuitos genéticos a gran escala. Estos sistemas pueden ser inhibidos por el ruido Asegúrese de secar bien las muestras, para mantener esas almohadillas frías a cuatro grados Celsius durante el mayor tiempo posible, y para cortar y dividir las partes paciente y suavemente. Para preparar la bacteria para el análisis inocular una sola colonia de un cultivo de E.coli transfectado.
Por ejemplo, un circuito con un reportero GFP. En un tubo de vidrio que contiene cinco mililitros de caldo LB complementarlo con los antibióticos relevantes. Cultivar las células a 37 grados Centígrados y 250 revoluciones por minuto en una incubadora temblorosa durante dos horas hasta que el caldo esté nublado.
Al final de la incubación, gire hacia abajo un mililitro de solución de dilución en una mini micro centrífuga de dos mililitros, y transfiera 30 microlitros de bacterias y todo el volumen de solución de dilución en un nuevo tubo de dos mililitros. Luego, incubar la cultura durante una hora con temblores antes de sembrar de 40 a 60 microlitros de esta suspensión en placas de cultivo M9. Para preparar la bacteria para el análisis, inocular una sola colonia de un cultivo de E.Coli transfectado.
Por ejemplo, un circuito con un reportero de GFP en un tubo de vidrio que contiene cinco mililitros de caldo LB complementado con los antibióticos pertinentes. Cultivar las células a 37 grados Centígrados y 250 revoluciones por minuto en una incubadora temblorosa durante dos horas hasta que el caldo esté nublado. Al final de la incubación, gire un mililitro de solución de dilución en un mini tubo de micro centrífuga de dos mililitros y transfiera 30 microlitros de bacterias y todo el volumen de solución de dilución a un nuevo tubo de dos mililitros.
Luego incubar la cultura durante una hora con temblores. Para preparar placas de microscopio, mezcle 112,5 miligramos de agar de baja fusión con 40 miligramos de agar y un mililitro de 2% de ácido casamino en un matraz Erlenmeyer de 25 mililitros. A continuación, añadir 8,92 mililitros de medio mínimo sobre los labios internos de un matraz Erlenmeyer de 25 mililitros y microondas la solución resultante en ráfagas cortas de dos a tres segundos.
A continuación, ajuste el baño de agua a 55 grados Celsius. Cuando la solución esté clara, coloque el matraz Erlenmeyer de 25 mililitros en un baño de agua de 60 grados Celsius y deje que la solución del agar se enfríe hasta que su temperatura baje a unos 45 a 50 grados centígrados. Mientras el agar se enfría, limpie el banco de laboratorio con un 70% de etanol y sume un trozo de cinta de laboratorio en el banco limpiado.
Coloque un resbalón de cubierta de vidrio en la cinta y coloque un segundo resbalón de cubierta cerca. Agregue la solución de agar refrigerado a los antibióticos y la solución adecuados. Vierta 1,5 mililitros de solución recién preparada para gelear la solución en el resbalón de la cubierta colocado sobre la cinta y coloque el segundo resbalón de la cubierta en el gel, teniendo cuidado de evitar burbujas.
Devuelva el Erlenmeyer al baño de agua caliente y cubra los resbalones de la cubierta durante 20 minutos. Voltea los resbalones de la cubierta durante una hora de incubación a cuatro grados centígrados. Al final de la incubación, retire los resbalones de la cubierta del gel seco y corte una pequeña almohadilla de la agarose.
Durante la incubación, agregue seis gotas de microlitro de la suspensión bacteriana preparada en un plato de 35 milímetros y deje que las gotas se sequen durante al menos 15 a 30 minutos. A continuación, coloque cuidadosamente la almohadilla a la vez en una gota de bacterias y deje que las muestras se ajusten durante 20 minutos a temperatura ambiente. Para colocar la cama de agar sin manchar la muestra, coloque cuidadosamente la almohadilla fría en la gota con suave roscado.
Para tomar imágenes de las muestras, retire el matraz del agua y deje que la solución de gel se enfríe a temperatura corporal. Vierta tres milímetros del gel sobre el perímetro de la placa de muestra. Cuando la agarose se haya solidificado, selle la placa con cinta adhesiva y utilice una aguja del calibre 25 para meter varios agujeros en la cinta.
Luego coloque la placa boca abajo a cuatro grados Celsius durante al menos 30 minutos para permitir que la agarose se solidifique completamente, evitando la mitosis celular. Dentro de las 24 horas, utilice un microscopio confocal de fluorescencia para localizar la muestra en el aumento más bajo e activar el sistema de enfoque automático del microscopio. Aplique aceite al objetivo adecuado y utilice el controlador de plataforma para mover la placa para extender cuidadosamente el aceite.
A continuación, vuelva a activar el enfoque automático y siga la sugerencia predeterminada de secciones transversales de paso Z para tomar imágenes del ejemplo. La E.coli debe aparecer como formas oblongas negras sobre un fondo blanco apagado. Y el rango dinámico de la luminancia debe mostrar un pico en su centro.
Los eventos de mitosis se pueden detectar primero mediante microscopía de fluorescencia después de 30 minutos. Aunque las células individuales pueden ser difíciles de detectar con baja magnificación. Los cultivos celulares bacterianos preparados con una relación de dilución incorrecta pueden demostrar un número inmutable de células, y las muestras preparadas sin sellado de placas pueden presentar una contracción excesiva, lo que resulta en una pérdida de enfoque.
Las células también pueden indentar el gel en su búsqueda de nutrientes, lo que resulta en el apilamiento de las células bacterianas uno encima del otro y comprometer la monocapa celular, evitando eficazmente la detección celular y la medición confiable de la señal fluorescente. Como sugieren estos datos, la etapa de celda en el ciclo de división no afecta al nivel de ruido, ya que diferentes rangos de área muestran la misma tendencia. Además, no se observa ningún cambio sustancial en la relación señal-ruido entre GFP y GFP superfoplicado, como ilustran estos datos representativos.
Al realizar este procedimiento, tenga cuidado de determinar la relación de dilución correcta para la cepa bacteriana utilizada para el experimento. La comparación de la relación señal-ruido de cada circuito regulado con esta línea base permite seleccionar el mejor circuito de rendimiento y puede revelar fenómenos interesantes
