Doy las gracias a Dr. Vincent Seutin por su constante apoyo, Christelle Gillissen y Laurent Massotte por su excelente asistencia técnica, doctores Jean Defourny y Sandra Ormenese por los consejos con el microscopio confocal, Dr. Jacques Destiné por el don del segundo amplificador Axopatch 200B, el GIGA-Imaging plataforma para compartir el microscopio confocal y el software Imaris y el Dr. Stephen Freeman para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por becas de los FRS belgas - FNRS (U.N002.13 y T.N0015.13) y publicado con el apoyo de la Fundación Universidad belga (Publié avec le concours de la Fundación Universitaria de Belgique).

El autor declara que no tiene intereses financieros en competencia.

Este informe describe un protocolo paso a paso para implementar registros de célula entera somatodendríticos duales y grabaciones dendríticas locales. Es útil para la determinación de la influencia de los canales iónicos (es decir, I H) en el curso temporal de los potenciales postsinápticos y mapeo de la distribución del canal iónico (I h) a lo largo del dominio somatodendrítica de neuronas DA nigrales, respectivamente. Resultantes mediciones electrofisiológicas se combinan para publicar histoquímica hoc para recuperar la morfología celular. Se empleó el procedimiento para investigar las neuronas DA situados en la sustancia negra, pero puede ser generalizada para las neuronas de la sustancia negra vecinos de GABA, las neuronas DA área tegmental ventral o otras neuronas del cerebro medio. Todos los pasos también pueden ser seguidos para examinar otros canales iónicos expresados en dendritas de las neuronas de la sustancia negra sin modificaciones importantes. Visualización post hoc es particularmente pertinente para las neuronas con axones de soportedendritas, como las neuronas de la sustancia negra, 25,26 interneuronas del hipocampo Oriens-alveus 21 o algunas neuronas piramidales CA1 67. Curiosamente, las neuronas que comparten esta característica parece ser más común de lo que generalmente se piensa 67. El análisis morfológico revela también la posición exacta de los electrodos y del axón. La detección de este último puede ser optimizado por el etiquetado de las proteínas expresadas en el segmento axonal inicial (canales de Na + dependientes de voltaje o Ankyrin G) mediante inmunohistoquímica 68,69. La fiabilidad de los datos recogidos con grabaciones dendríticas y etiquetado neuronal posterior siempre depende de la calidad de la rebanada. esfuerzo máximo necesita, por tanto, que debe aplicarse para preservar la viabilidad de las células dentro del tejido. Esto se consigue con un manejo suave de los animales sanos, herramientas de alta calidad y reactivos, la oxigenación suficiente de las temperaturas del tejido y heladas durante la preparación de las rebanadas. condiciones de grabación estables dependen de la selección de las neuronas sanas. En el modo de células enteras, la resistencia serie debe inicialmente ser tan bajo como sea posible y mantenido constante durante todo el experimento. La estabilidad de las grabaciones depende más de manipuladores de alta calidad carentes de deriva y las vibraciones. Estas perturbaciones pueden ser reducidos mediante la optimización de la estabilidad de la pipeta: comprobar la conexión a soporte de pipeta y para cabezal de la platina, el control de cables que son micromanipulador holgura, evitar cambios bruscos de temperatura o movimiento de la platina y de comprobar el mecanismo del manipulador. Para grabaciones duales, metilsulfato 13,15,21 se ha incluido en la solución intracelular, pero gluconato 9,14,25 alternativamente se pueden emplear. Sin embargo, el anión principal puede alterar el potencial de membrana 70,71 y algunas corrientes dependientes de voltaje 72. solución intracelular puede ser complementado con ATP, GTP y fosfocreatina para preservar la physiologicas funciones de las neuronas. Además, la adición de un colorante fluorescente en la solución de la pipeta (por ejemplo, Alexa 594 o sulforodamina 101 41) para visualizar las dendritas durante una grabación somática puede ser útil por ejemplo para colocar una aplicación de presión (Figura 7 en la Ref. 41) o un estimulante eléctrico pipeta. La solución de la pipeta para las grabaciones adjunta células contiene una alta concentración de K + y Na + sin registrar grandes I h. Cabe destacar la relación de la concentración de Na + / K + influye en la amplitud de la corriente 10, el potencial de inversión de la corriente 11 y la compuerta de I h 73. Alternativamente, I h también se pueden grabar utilizando fuera de espera 10. En esta configuración de grabación sin embargo, el medio intracelular en la proximidad de los canales puede ser perturbado. En consecuencia, las diferencias en la activación dependiente de la tensión de I &lt;sub&gt; h se observa cuando se comparan las corrientes obtenidas usando parches adjunta células y fuera de espera 10. Hinchazón de las neuronas se encuentra ocasionalmente durante la grabación de patch-clamp, y, a menudo surge de causas distintas, tales como la baja calidad del agua, fuerte desequilibrio de la osmolaridad o pH entre el 39 soluciones o errores intra y extracelular en la composición de las soluciones. La calidad de los registros electrofisiológicos tiene una incidencia directa sobre la calidad de la morfología de las neuronas recuperados. Alta resistencia pipetas somáticas se utilizan para grabaciones duales (6 - 10 mO, como en Refs 6,11.) Y para las grabaciones somáticos individuales después de grabaciones adjunta células para reducir al mínimo la dilución del medio intracelular 14. Por lo tanto, la grabación somática de células enteras después de la grabación adjunta celular se mantiene corto (&lt;10 min). parches exterior hacia fuera tanto de la somáticas y pipetas dendríticas son esenciales para el cierre correcto de la cmembrana ell y la posterior recuperación de la morfología celular. Además de la estructura de la célula, el contenido neuroquímico se puede determinar para las neuronas registradas 59,74. Por ejemplo, el intracelular tirosina hidroxilasa proteína se puede immunolabeled para la identificación inequívoca de las neuronas DA 13. Neuronas DA se concentran principalmente en la SN pars compacta, con una densidad mucho más baja presente en el SN pars reticulata, donde se entremezclan con un mayor número de neuronas GABA 75. Mientras que el cuerpo celular de las neuronas DA es a menudo mayor que el de neuronas GABA, la identificación visual de estas células con IR-videomicroscopy es incierto y parcialmente impedido por la opacidad de los pars compacta. Para evitar estas limitaciones, la pre-selección de las neuronas DA puede ser facilitada por el uso de ratones transgénicos que expresan un marcador fluorescente en una población específica de neuronas (TH 65 o DAT para neuronas DA, GADpara las neuronas GABA) y la iluminación de epifluorescencia. Alternativamente, un colorante fluorescente puede ser incluido en la solución del electrodo somática para facilitar la visualización de las dendritas. El aumento de la resolución de la célula fluorescente es traído por hilatura Nipkow confocal de disco 14,22,30 o microscopía de dos fotones 7 combinado con IR-DGC 6. Varias ventajas están relacionadas con DGC en comparación con DIC. En primer lugar, ya que no se requieren prismas DIC, la imagen IR-DGC puede ser superpuesta con una imagen de fluorescencia 49,52,53,76. En segundo lugar, DGC se puede combinar con la fotoestimulación y optogenética 77. Una desventaja de rebanada preparación es la preservación de la integridad de las neuronas. Neuronas DA extienden sus dendritas en los tres planos del espacio 78,79 y por lo tanto el truncamiento del compartimiento dendríticas no pueden evitarse por completo en rodajas 80. La elección de la orientación de las rebanadas (coronal, horizontal o parasagital) es un trade-off. El origen de la inervación y el diseño experimental se debe considerar para seleccionar la orientación correcta de las rebanadas. parches dendríticas directa es la técnica utilizada para mapear la distribución de los canales iónicos funcionales en los diferentes compartimientos de las células. Además, esta técnica ofrece para determinar la variabilidad en las propiedades funcionales de los canales 20. Como complemento de la ubicación y densidad de los canales iónicos se pueden determinar mediante inmunohistoquímica en los niveles de luz y microscopía electrónica 17,23. Este enfoque también ofrece la posibilidad de determinar la densidad de canales en las estructuras de pequeño calibre que son inaccesibles para las pipetas de parche. Sin embargo, estos canales pueden estar en un estado funcional distinta 24 o incluso inactivos en comparación con los registrados utilizando técnicas de patch-clamp. Ambas técnicas son, por tanto, necesaria para obtener una imagen completa de la ubicación y las propiedades decanales iónicos en una región celular específica 17. Con el desarrollo de colorantes sensibles al voltaje, de formación de imágenes de tensión se ha utilizado para examinar la propagación de puntos de acceso y los EPSP en las neuronas en múltiples lugares 81. Como alternativa a las grabaciones de doble patch-clamp, este enfoque aún se puede implementar para dendritas finas que no son accesibles a las pipetas de parche, pero requieren una calibración precisa de la señal y el promedio. Si bien las neuronas DA en el SN y el área tegmental ventral son ampliamente investigados a través de grabaciones somáticas en el contexto fisiológicos y fisiopatológicos, las propiedades funcionales de sus dendritas sigue siendo en gran parte desconocidos en ambas condiciones. Parches de dendritas se ha implementado para las neuronas dopaminérgicas nigrales por varios grupos con éxito 13,25,26 y sigue siendo el método de elección para diseccionar propiedades excitables de estas estructuras subcelulares finas 8. grabaciones dendríticas proporcionan una mayor opportunidad de controlar la eficiencia y la plasticidad de la transmisión sináptica y la plasticidad de la excitabilidad dendríticas 82,83.

Las neuronas reciben información sináptica predominantemente en sus dendritas. Excitatorios e inhibitorios señales sinápticas extendido de su sitio de generación en el sitio de integración, donde los potenciales de acción (AP) son evocados como la señal de salida. En su camino, los potenciales sinápticos están influenciados tanto por la estructura de las dendritas y la interacción entre propiedades de la membrana pasivos y activos. La combinación de estos parámetros muy variables ensancha la potencia de cálculo de las neuronas 1,2. Sin embargo, el pequeño diámetro de las dendritas impide sin embargo el estudio de sus propiedades eléctricas. El continuo desarrollo de la técnica de patch-clamp 3, la óptica 4 y el perfeccionamiento de los métodos para la preparación rebanada 5 durante las últimas décadas han permitido a las grabaciones de muy delgada (0,7 - 3 m Ø) 6,7 dendritas. Estos métodos eran, y son, en gran medida todavía utilizan para examinar la excitabilidad de las dendritas en una variedad of 8 neuronas. Grabaciones directas dendríticas son esenciales para determinar la distribución 9-19 y las diferencias en las propiedades funcionales de los canales iónicos 20-22 en compartimentos neuronales distintas. Estos datos son el complemento necesario de la distribución de los canales iónicos detectada por inmunohistoquímica, combinado a la luz y microscopía electrónica 23,24. Grabaciones somatodendríticos duales se han implementado para explorar la propagación de los potenciales de acción 9,13-15,21,22,25-27 y propagación de los potenciales sinápticos 13,16,18 a lo largo del dominio somatodentrítica de las neuronas, la obtención de modelos detallados de cable pasivas 28- 30 e investigar la resolución temporal de la integración neuronal 31. La sustancia negra (SN) es una región situada en el cerebro medio implicado en diversas funciones tales como el control de movimiento, la codificación de la recompensa y comportamientos habituales. La disminución de la dopamina debido a la específicala pérdida de neuronas dopaminérgicas (DA) en el SN está asociado con los trastornos motores observados en los pacientes que sufren de la enfermedad 32 de Parkinson. El circuito nigral se compone de dos tipos de células principales: dopaminérgicas y GABAérgicas neuronas. Curiosamente, estas neuronas tienen varias características que las distinguen de otras neuronas. El axón de una gran proporción de las neuronas DA y algunas neuronas GABA origina a partir de un sitio dendríticas que indica que el árbol dendrítico es heterogénea (axón-cojinete y dendritas axón-carente) 25,26,33. La morfología de estas neuronas, por lo tanto contrasta con la organización típica de las neuronas en el que la transferencia de información sigue la ley de la polarización dinámica emitida por Cajal: a partir de las dendritas, al soma y finalmente a 34 axón. También se conocen las neuronas DA a la liberación de dopamina a partir de sus dendritas 35, generar actividad de ruptura 36 y la plasticidad 37 NMDA-receptor. la disecciónción de estos fenómenos es difícil de alcanzar sin grabaciones directas desde el lugar en que se iniciaron. Para hacerse una idea de la relación entre la ubicación exacta y las propiedades funcionales de los canales iónicos y su papel en la excitabilidad y la información de la transferencia dendríticas en las neuronas de la sustancia negra, grabaciones dendríticas directos son el método de elección. Este informe describe un procedimiento detallado que se puede utilizar para obtener grabaciones de uno y dos patch-clamp de dendritas de las neuronas de la sustancia negra y el etiquetado de post hoc biocitina correspondiente. Los principios básicos para parchear el somática y la membrana dendríticas son muy similares. sin embargo la práctica, las grabaciones de sitios dendríticas requieren optimización específica en comparación con las grabaciones somáticas. grabaciones dendríticas exitosas dependen de la calidad de las rodajas, de ajuste óptimo de la óptica, de aproximación suave de la pipeta de parche y la estabilidad de las grabaciones.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="621">
	<tbody>
		<tr height="137">
			<td height="137" style="height:138px;width:156px;">Double-distillated water</td>
			<td style="width:143px;">Millipore</td>
			<td style="width:137px;">Super Q</td>
			<td style="width:187px;">&#160;Resistivity &#62;14 M&#937; cm, ideal 18.2 M&#937; cm at 25&#176;C, filtered (0.22 &#181;m), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Microfilter candles</td>
			<td style="width:143px;">Robu</td>
			<td style="width:137px;">Porosity 3, 6 mm or 13 mm diameter</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:156px;">Tissue slicer with vibroprobe</td>
			<td style="width:143px;">Leica</td>
			<td style="width:137px;">VT1200</td>
			<td style="width:187px;">cutting parameters: speed 0.07, amplitude 1.40</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Tissue slicer</td>
			<td style="width:143px;">Dosaka</td>
			<td style="width:137px;">DTK-1000</td>
			<td style="width:187px;">cutting parameters: speed 4, frequency 7</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Razor blades</td>
			<td style="width:143px;">Gilette</td>
			<td style="width:137px;">Super Silver</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Dissection tools</td>
			<td style="width:143px;">Braun, Aesculap</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Reserve chamber</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Custom-made</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">PP beckers</td>
			<td style="width:143px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">213-1725</td>
			<td style="width:187px;">400 ml</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Syringe filter</td>
			<td style="width:143px;">Merk Millipore</td>
			<td style="width:137px;">Millex - GV 0,22 &#181;m</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Cyanoacrylate glue&#160;</td>
			<td style="width:143px;">UHU</td>
			<td style="width:137px;">&#34;Sekunden Kleber&#34;</td>
			<td style="width:187px;">liquid glue</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Recording chamber&#160;</td>
			<td style="width:143px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:137px;">Slice mini chamber</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Horizontal pipette puller</td>
			<td style="width:143px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:137px;">Brown-Flaming P-97</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Pipettes</td>
			<td style="width:143px;">Hilgenberg</td>
			<td style="width:137px;">1807524</td>
			<td style="width:187px;">2 mm o.d./1 mm i.d. glass capilaries, ends firepolished, washed</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Dental wax</td>
			<td style="width:143px;">Colt&#232;ne/Whaledent</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">orthodontic tray wax strips</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Platinum grid</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">to anchor slices in the recording chamber, custom made with a platinum disk</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Microforge</td>
			<td style="width:143px;">Narishige</td>
			<td style="width:137px;">MF-830</td>
			<td style="width:187px;">to fire-polish pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:156px;">Potassium methyl sulfate</td>
			<td style="width:143px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:137px;">215481</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:156px;">Biocytin</td>
			<td style="width:143px;">Molecular probes</td>
			<td style="width:137px;">B1592</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:156px;">Manometer</td>
			<td style="width:143px;">GREISINGER electronic</td>
			<td style="width:137px;">GDH 13 AN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:156px;">Microscope</td>
			<td style="width:143px;">Zeiss</td>
			<td style="width:137px;">FS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:156px;">Dodt Gradient Contrast</td>
			<td style="width:143px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Manipulators</td>
			<td style="width:143px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:137px;">LN Mini 25</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;width:156px;">Frame grabber</td>
			<td style="width:143px;">The Imaging Source</td>
			<td style="width:137px;">DFG/USB2pro</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Camera</td>
			<td style="width:143px;">DAGE-MTI</td>
			<td style="width:137px;">NC-70</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;width:156px;">Condenser</td>
			<td style="width:143px;">Zeiss</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">high numerical aperture condenser working with oil</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:156px;">Objective</td>
			<td style="width:143px;">Zeiss</td>
			<td style="width:137px;">W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR</td>
			<td style="width:187px;">63x magnification, long-distance, high numerical aperture 1.0 water-immersion objective&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:156px;">Fourfold-changer</td>
			<td style="width:143px;">Luigs &#38; Neumann</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">between the camera and the microscope</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:156px;">Black &#38; white video monitor</td>
			<td style="width:143px;">Sony</td>
			<td style="width:137px;">SSM-175CE</td>
			<td style="width:187px;">16-inch, 850 TV lines, analog</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:51px;width:156px;">Sample Bottles, Amber Glass, with Cap</td>
			<td style="width:143px;">VWR</td>
			<td style="width:137px;">215-2409</td>
			<td style="width:187px;">to transfer slices from the setup to histology room</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">The Axon Guide</td>
			<td style="width:143px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Book</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:46px;width:156px;">Stimfit</td>
			<td style="width:143px;">https://github.com/neurodroid/stimfit</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Analysis of electrophysiological data</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:156px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:143px;">Sigma</td>
			<td style="width:137px;">441244</td>
			<td style="width:187px;">see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:26px;width:156px;">Well cell culture plate</td>
			<td style="width:143px;">Greiner-Bio-One</td>
			<td style="width:137px;">662160</td>
			<td style="width:187px;">for the staining of fixed slices</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:143px;">Merk</td>
			<td style="width:137px;">108643</td>
			<td style="width:187px;">see SAFETY DATA SHEET and Dangerous Substances Directive (EU) before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">mouse anti-TH monoclonal primary</td>
			<td style="width:143px;">Immunostar</td>
			<td style="width:137px;">22941</td>
			<td style="width:187px;">working concentration: 1/1000</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">goat anti-mouse secondary antibody - Alexa Fluor 568</td>
			<td style="width:143px;">Invitrogen - Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">A-11031</td>
			<td style="width:187px;">working concentration: 1/500</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Normal goat serum</td>
			<td style="width:143px;">Dako</td>
			<td style="width:137px;">X0907</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">ProLong Diamond Antifade</td>
			<td style="width:143px;">Molecular Probes - Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:137px;">P36961</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:156px;">Fluorescein Avidin DCS</td>
			<td style="width:143px;">Vector Lab</td>
			<td style="width:137px;">A-2011</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:156px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:143px;">Olympus</td>
			<td style="width:137px;">FV1000</td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:45px;width:156px;">ImageJ</td>
			<td style="width:143px;">http://imagej.nih.gov/ij/</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:156px;">NeuronJ</td>
			<td style="width:143px;">http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">plugin for ImageJ</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Imaris</td>
			<td style="width:143px;">http://www.bitplane.com</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Reconstruction of biocytin filled neurons</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:156px;">Neuromantic</td>
			<td style="width:143px;">http://www.reading.ac.uk/neuromantic/</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Reconstruction of biocytin filled neurons</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:61px;width:156px;">WinWCP</td>
			<td style="width:143px;">http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:187px;">Analysis of electrophysiological data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

subcellular patch-clamp recordings from the somatodendritic domain of nigral dopamine neurons

Dendritas de las neuronas dopaminérgicas reciben y transmiten la entrada sináptica, el apoyo potencial de acción de propagación hacia atrás y la liberación de neurotransmisores. La comprensión de estas funciones fundamentales arrojará luz sobre la transferencia de información en estas neuronas. patch-clamp grabaciones dendríticas ofrecen la posibilidad de examinar directamente las propiedades eléctricas de las dendritas y los canales iónicos dependientes de voltaje subyacentes. Sin embargo, estas estructuras finas no son de fácil acceso para las pipetas de parche debido a su pequeño diámetro. Este informe describe un procedimiento paso a paso para recoger grabaciones estables y fiables a partir de las dendritas de las neuronas dopaminérgicas en rodajas agudas. Las medidas electrofisiológicas se combinan con la recuperación post hoc de la morfología celular. experimentos exitosos se basan en la mejora de la preparación de las rebanadas, soluciones y pipetas, el ajuste adecuado de la óptica y la estabilidad de la pipeta en contacto con la estructura grabada. principios estándar de somgrabación de patch-clamp ATIC se aplican a las dendritas pero con un enfoque más suave de la pipeta. Estas técnicas versátiles pueden ser implementadas para abordar diversas cuestiones relativas a las propiedades de las dendritas excitables.

El protocolo descrito anteriormente tiene la intención de facilitar la recogida de datos utilizando patch-clamp grabaciones dendríticas. Esta técnica, combinada con post hoc histoquímica, ayuda a hacerse una idea de los mecanismos de muchas señales eléctricas se originan o se extienden en las dendritas. Acceso directo a las dendritas con pipetas de parche es difícil, pero especial atención a varios aspectos metodológicos mejorará la tasa de éxito de las grabaciones. Un experimentador suficiente experiencia en la grabación somática estable puede esperar obtener una alta resistencia sellos (GΩ) y experimentos completos en la mayoría de los intentos. Una o dos grabaciones dendríticas de alta calidad pueden ser recogidos por la disección. La disponibilidad de cortes de cerebro de alta calidad que contienen los cuerpos celulares y dendritas saludable es un requisito previo para acceder a estas estructuras finas (Figura 1). el Criteriuna para la selección de estas neuronas son una superficie lisa y homogénea por toda la célula y un soma y dendritas con bajo contraste cuando se observa con ajustado óptimas óptica (Figura 1A y 1B). Selección de las neuronas contrastan con demasiada fuerza generalmente conduce a grabaciones inestables (Figura 1C y 1C). Por lo tanto este tipo de neuronas deben ser evitados. En comparación con otras neuronas, las neuronas DA nigrales exhiben características morfológicas y electrofisiológicas específicos. Estas características normalmente evaluados con una sola pipeta somática también se pueden observar en dual somática (Figura 2) y grabaciones somatodendríticos (Figura 3). Largas inyecciones actuales inducen una hiperpolarización potencial rectificación membrana llamada &#39;hundimiento&#39; (Figuras 2B y 5D). El axón se origina, en la mayoría de los casos, en un sitio dendríticas como se identificautilizando criterios complementarios 13,25,26, lo que indica que el compartimiento dendríticas en estas neuronas es heterogénea (Figura 3A - 3B). Como consecuencia de ello, el compartimento donde se observa la AP primero corresponde al compartimento en el que el axón surge (Figura 3C - 3D) 13,25,26. El axón está generalmente terminada por una ampolla axonal causada por un corte de la axón durante el rebanado 64, pero esta estructura no se detecta sistemáticamente. El pandeo pronunciado observado en las neuronas DA nigrales consecutiva a la activación de I h sugiere una alta expresión de las subunidades HCN. Para determinar la influencia de I h en la integración de señales sinápticas, la corriente (EPSC) formas de onda sinápticas-como se generaron y se inyectaron a través del electrodo de registro dendríticas durante las grabaciones de doble somatodendríticos 55 (&lt;strong&gt; Figura 4). La cinética de estos EPSCs simulados se basaron en las constantes de la subida y el tiempo de desintegración de EPSCs espontáneas reales. El aEPSP resultante se registró con el electrodo somática. Bath aplicación de la I h bloqueador de ZD 7288 aumentó la duración de la aEPSP, indicando la contribución de I h a la evolución temporal de señales sinápticas (Figura 4B). ZD 7288 abolió también el potencial de membrana de rectificación que confirma que los resultados de colgar en la activación de I h (Figura 4C). Los resultados obtenidos con los EPSP simuladas pueden ser correlacionados a los experimentos utilizando los EPSP evocados eléctricamente 65. Para asignar la distribución precisa de la canal en el dominio somatodendrítica de neuronas DA, grabaciones adjunta células se llevaron a cabo (Figura 5). Un sello de alta resistencia (&gt;&gt; 1 GΩ) es una necesidad absoluta para las grabaciones adjunta células (Figura 5B </strong&gt;). En las dendritas de las neuronas DA, I h activa lentamente con pasos de voltaje de hiperpolarización de largo y se alcanza el estado estacionario actual después de cientos de ms (Figura 5C), como se indica anteriormente 66. Esta observación indica que los canales HCN expresadas en las dendritas de las neuronas DA tienen diferentes subunidades en comparación con los de las neuronas piramidales u otros tipos de células 10,16,66. Como la distribución del canal podría ser no homogénea en el compartimiento dendríticas y como el compartimiento dendríticas es en sí misma heterogénea, la identidad de la dendrita (axón-cojinete o dendrita nonaxon-cojinete) se revela mediante la comparación de la imagen de IR-DGC con la imagen confocal después de la tinción biocitina (Figura 3A y B). La recuperación de la morfología celular es por lo tanto necesario que ambas grabaciones somatodendríticos duales y para las grabaciones adjunta células a través de grabaciones de células enteras somáticas posteriores. Figura 1. La visualización de las dendritas Soma y proximal de la sustancia negra neuronas dopaminérgicas Uso de infrarrojos videomicroscopia. (A) Imagen IR-DGC de una neurona DA nigral que muestra el soma y dendritas proximal y ambos pipetas somáticas y dendríticas. Una grabación somatodendrítica dual se realizó con éxito en esta neurona saludable. Observar el bajo contraste y la superficie lisa en todo el dominio somatodendrítica de la célula. (B) Otro ejemplo de una neurona DA saludable. (C) DA neurona con una superficie más rugosa y desigual y un contraste más fuerte. Si bien se ha obtenido una grabación dual, la estabilidad fue subóptima, y la duración de la grabación fue corto (~ 15 min) debido a un aumento gradual de la resistencia de acceso en ambos pipetas. (D) Segundo ejemplo de una neurona DA que muestra una fuerte contrastado soma y dendritas proximales. En este caso, se observó un fuerte aumento de la resistencia de acceso poco después de la ruptura en el modo de células enteras. Un intento de disminuir la resistencia acceso de presión negativa no tuvo éxito. Las neuronas en el panel C y D podrían haber sufrido daños durante el procedimiento de corte en lonchas y se deben evitar para los experimentos. (E) de grabación somática doble simultánea en una neurona DA saludable, al principio de la grabación. (F) La misma neurona como en el panel E con un cuerpo celular hinchada después de ~ 17 min. Tenga en cuenta la completa ausencia de contraste, la apariencia similar a una bola del soma y la presencia del gran núcleo que no es evidente en las neuronas sanas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig2.jpg" /> Figura 2. </strong&gt; simultánea doble somática Grabación desde una neurona DA. (A) Imagen IR-DGC durante la grabación de doble somática a partir de una neurona DA. (B) hiperpolarizante y despolarizar largos inyecciones actuales 1 s (-160 a 80 pA, incremente 80 pA) y cambios de voltaje correspondientes grabar simultáneamente con las dos pipetas de parche. Cabe destacar la presencia del hueco en la traza de tensión con la larga etapa hyperpolarizing actual y el gran servicio post-hiperpolarización después de la AP durante el impulso de corriente de despolarización. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig3.jpg" /> Figura 3. Dual S grabación omatodendritic en una neurona DA. (A) Imagen IR-DGC de una neurona DA. La distancia entre el dendríticas y somapipeta tic es 29 micras imagen. (B) confocal z-proyección de la neurona en el panel A marcada con avidina conjugada con isotiocianato de fluoresceína (FITC). La neurona se llenó con biocitina durante la grabación. El axón originó a partir de una dendrita proximal cerca de la soma como se indica por la flecha. (C) de grabación de voltaje de células enteras somatodendrítica dual simultánea de la neurona en el panel A. AP registrada en el soma (trazas de tensión negro) y dendrita (tensión rojo trazas) en respuesta a la larga etapa de inyección de corriente de un 1 s a través de la somática (de izquierda; negro traza actual) y la pipeta, alternativamente, dendrítica (derecha; rojo traza actual) (D) somático y AP dendríticas que se muestran en la escala de tiempo ampliado.. Con cualquiera somática o de inyección de corriente dendrítica, el AP somática (negro) precedió a la AP dendríticas (rojo). El retraso entre los puntos de acceso en esta neurona fue de 120 mu s y 210 mu s con somática y la inyección de corriente dendríticas, respectivamente. Los retrasosse midieron a AP amplitud máxima media durante la fase ascendente de la AP. El AP se observó por primera vez en el compartimiento cerca de la cual emerge el axón, lo que confirma observaciones anteriores 25,26. En este caso, la grabación dendríticas se hace de una dendrita axón-deficiente. Un ejemplo de una grabación de una de las dendritas axón-cojinete está en la Ref. 13 (en su Fig. 1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig4.jpg" /> Figura 4. Propagación de EPSP artificiales A lo largo del eje del somatodendrítica DA neuronas. Imagen IR-DGC de una neurona DA (A). La distancia entre el dendríticas y la pipeta somática es 45 micras. Ambos pipetas de parche están en el modo de células enteras de grabación actual-clamp. (B) actualgrabado con la pipeta dendríticas en corriente-clamp y utilizado para generar la EPSP artificial (parte superior). La corriente se obtiene por la inyección de una forma de onda EPSC-como (t altura = 0,6 ms; tau decaimiento = 3 ms; amplitud = 100 pA) a través de la pipeta de grabación dendríticas 55. En la parte inferior, aEPSPs registrados en el soma en el control de las condiciones (negro) propagada y después de la aplicación del baño de la ZD7288 I h bloqueador (30 M; trazo rojo). Cada traza de tensión es el promedio de 40 barridos individuales. Observe el gran aumento en la duración del EPSP en presencia de ZD7288 que indica la contribución de I h a la evolución temporal de los EPSP. (C) Tensión trazas grabadas desde el soma en condiciones de control (negro) y después de la aplicación de ZD 30 M 7288 ( rojo) en respuesta a una larga (30 pA; 1 s) paso actual de hiperpolarización. Nótese la ausencia de potencial de membrana de rectificación (sag) después de que el bloqueo de I &lt;sub&gt; h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig5.jpg" /> Figura 5. Presencia de I h en las dendritas de las neuronas DA. (A) Imagen IR-DGC de una neurona DA pipeta sobre las dendritas proximales. (B) y las corrientes capacitivas de fuga durante un comando de tensión 5 mV en configuración de conexión celular. La resistencia del sello fue 5 GΩ en este ejemplo la etapa (C) de voltaje hiperpolarizante. (90 mV; parte superior) a partir de un potencial de membrana de 0 mV indujo una activación lentamente I h. La traza actual se invirtió y equipado con una sola función exponencial dando una constante de tiempo de tau = 632 ms. (D) Tensiónrespuestas del soma registrada de células enteras (panel A) a 1 s hiper e impulsos de corriente de despolarización (-160 a 120 pA, 40 de incremento PA). La grabación de células enteras somática se realizó después de la grabación adjunta por células. Nótese la ausencia de puntos de acceso debido a la aplicación extracelular de TTX y Cd 2+ para suprimir la activación espontánea durante la grabación adjunta por células. Estos voltaje Na + y Ca 2+ se añadieron bloqueadores actuales para suprimir las corrientes de acción. Los paneles A - D son de la misma neurona (E) la imagen IR-DIC de otra neurona DA y una pipeta dendríticas corrientes (F) dependiente de la tensión activa mediante un impulso de prueba a 0 mV a partir de un prepulso de 50 ms a -120 mV.. en un parche en el exterior hacia fuera extirpado de la dendrita proximal de la neurona en el panel E. Holding potencial de -80 mV. Tenga en cuenta la inactivación dependiente del tiempo de la corriente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una más grande</a>versión de esta figura. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Sustancia </td><td> g / mol </td><td> Concentración </td><td> para 1 L </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58.443 </td><td> 125 mM </td><td> 7.305 g </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> 84.007 </td><td> 25 mM </td><td> 2.100 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74.551 </td><td> 2,5 mM </td><td> 0,186 g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 137.99 </td><td> 1,25 mM </td><td> 0,172 g </td></tr><tr><td> glucosa </td><td> 198.17 </td><td> 25 mM </td><td> 4,95 g </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M (solución) </td><td> 1 mM </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 1 M (solución) </td><td> 2 mM </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolaridad: ~ 310 mOsmol / L (rango óptimo: 314-325 mOsmol / L), pH = 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabla 1: líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Sustancia </td><td> g / mol </td><td> Concentración </td><td> para 1 L </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 58.443 </td><td> 87 mM </td><td> 5.084 g </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> 84.007 </td><td> 25 mM </td><td> 2.1001 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 7.551 </td><td> 2,5 mM </td><td> 0,18637 g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 </td><td> 137.99 </td><td> 1,25 mM </td><td> 0,17248 g </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M (solución) </td><td> 7 mM </td><td> 7 ml </td></tr><tr><td> glucosa </td><td> 198.17 </td><td> 10 mM </td><td> 1,9817 g &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> sacarosa </td><td> 342,29 </td><td> 75 mM </td><td> 25,672 g </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 1 M (solución) </td><td> 0,5 mM </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolaridad: ~ 326 mOsmol / L, pH = 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabla 2: sacarosa-ACSF para preparar rodajas. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Sustancia </td><td> g / mol </td><td> Concentración </td><td> para 100 ml </td></tr><tr><td> KMeSO 4 </td><td> 150,2 </td><td> 120 mM </td><td> 1,8024 g </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74.56 </td><td> 20 mM </td><td> 0,14912 g </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M (solución) </td><td> 2 mM </td><td> 200 l </td></tr><tr><td> Na 2 ATP </td><td> 551.1 </td><td> 2 mM </td><td> 0,1102 g </td></tr><tr><td> Na 2 GTP </td><td> 523,2 </td><td> 0,5 mM </td><td> 0,02661 g </td></tr><tr><td> Na 2 -Phosphocreatine </td><td> 255.1 </td><td> 5 mM </td><td> 0,1275 g </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 380,4 </td><td> 0.1 mM </td><td> 3.803 mg </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 238,31 </td><td> 10 mM </td><td> 0,23831 g </td></tr><tr><td> biocitina </td><td> 1 mg / mL </td><td></td><td> 0,1 g </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolaridad: ~ 302 mOsmol / L, pH = 7,2 ajustado con KOH </td></tr></tbody></table> Tabla 3: solución intracelular para las grabaciones duales. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Sustancia </td><td> g / mol </td><td> Concentración </td><td> para 100ml </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 74.56 </td><td> 120 mM </td><td> 0,8947 g </td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 1 M (solución) </td><td> 2 mM </td><td> 200 l </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 1 M (solución) </td><td> 1 mM </td><td> 100 l </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 238,31 </td><td> 10 mM </td><td> 0.23831 </td></tr><tr><td> TEA-Cl </td><td> 165,7 </td><td> 20 mM </td><td> 0,3314 g </td></tr><tr><td> 4-AP </td><td> 94.11 </td><td> 5 mM </td><td> 0,04705 g </td></tr><tr><td> BaCl2 </td><td> 244.26 </td><td> 1 mM </td><td> 0,02443 g </td></tr><tr><td> CdCl2 </td><td> 183.32 </td><td> 0.02 mM </td><td> 0.3666 mg </td></tr><tr><td> TTX </td><td> 1 mM </td><td> 200 nM </td><td> 20 l </td></tr><tr><td colspan="4"> Osmolaridad: ~ 290 mOsmol / l, ajustado con D-glucosa (Ref. 16); pH = 7,4 </td></tr></tbody></table> Tabla 4: solución de electrodos para grabaciones unido por células.

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Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subcelulares patch-clamp grabaciones desde el dominio somatodendrítica de la sustancia nigra dopamina Neuronas

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.8K vistas.  Quartier Hôpital, 














University
of Liege. Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro. 

Video: Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Grabaciones de patch clamp de neuronas de ratón de retina en una rebanada preparación adaptada a la oscuridad

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Investigación

Neurociencias

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

Emparejados grabaciones patch clamp de neurona motora y el músculo esquelético de destino en el pez cebra

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

Grabaciones de patch clamp en Inner células del oído pelo Aislado de pez cebra

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

Mitochondria are involved in many important cellular functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most important mitochondrial functions are related to the efficient production of ATP, the energy currency of the cell, by oxidative phosphorylation, and the mediation of signals for programmed cell death3.
The enzyme primarily responsible for the production of ATP is the F1FO-ATP synthase, also called ATP synthase4-5. In recent years, the role of mitochondria in apoptotic and necrotic cell death has received considerable attention. In apoptotic cell death, BCL-2 family proteins such as Bax enter the mitochondrial outer membrane, oligomerize and permeabilize the outer membrane, releasing pro-apoptotic factors into the cytosol6. In classic necrotic cell death, such as that produced by ischemia or excitotoxicity in neurons, a large, poorly regulated increase in matrix calcium contributes to the opening of an inner membrane pore, the mitochondrial permeability transition pore or mPTP. This depolarizes the inner membrane and causes osmotic shifts, contributing to outer membrane rupture, release of pro-apoptotic factors, and metabolic dysfunction. Many proteins including Bcl-xL7 interact with F1FO ATP synthase, modulating its function. Bcl-xL interacts directly with the beta subunit of F1FO ATP synthase, and this interaction decreases a leak conductance within the F1FOATPasecomplex, increasing the net transport of H+ by F1FO during F1FO ATPase activity8 and thereby increasing mitochondrial efficiency. To study the activity and modulation of the ATP synthase, we isolated from rodent brain submitochondrial vesicles (SMVs) containing F1FO ATPase. The SMVs retain the structural and functional integrity of the F1FO ATPase as shown in Alavian et al. Here, we describe a method that we have used successfully for the isolation of SMVs from rat brain and we delineate the patch clamp technique to analyze channel activity (ion leak conductance) of the SMVs.

F1FO ATPase Vesicle Preparation and Technique for Performing Patch Clamp Recordings of Submitochondrial Vesicle Membranes

A method to isolate submitochondrial vesicles enriched in F1FO ATP synthase complexes from rat brain is described. These vesicles allow the study of the activity of F1FO ATPase complex and its modulation using the technique of patch clamp recording.

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub&gt; ATPasa preparación de vesículas y técnica para realizar Patch clamp grabaciones de membranas de la vesícula submitocondriales

Mitochondria are involved in many important cellular  functions including metabolism, survival1, development and, calcium signaling2. Two of the most ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

El aislamiento de las neuronas sensoriales de<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Se Patch clamp grabaciones de Corrientes glutamatérgicos

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

Patch Clamp Las grabaciones de las células embrionarias de pez cebra Mauthner

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Plenario de células patch-clamp grabaciones de Morphologically- e identificados-neuroquímicamente interneuronas del hipocampo

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Electrofisiológico y Caracterización Morfológica de microcircuitos neuronales en el infarto agudo rodajas de cerebro Usando Emparejados patch-clamp grabaciones

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Las grabaciones de células enteras Patch-clamp en rodajas de cerebro

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.