Investigación para Prevención de la Ceguera, la asistencia Experimental de Takayuki Nagasaki; Esta investigación cumple con la Declaración de ARVO para el Uso de Animales en Investigación Oftalmológica y Visual. KJW es apoyado por el NIH subvenciones 5T32EY013933 y 5T32DK007647-20. VBM es apoyado por el NIH subvención K08EY020530.

1. Montar dispositivos para la inyección subretiniana <ol><li> Compre o haga una aguja de 100 m de diámetro de un tubo capilar de vidrio. Esto se puede hacer manualmente mediante el uso de un Sutter P-97 extractor de pipeta u otro equipo similar. El extremo del tubo capilar se calienta y se retiró hasta que alcanza el diámetro deseado (100 micras). Una aguja de diámetro más pequeño se puede utilizar para vectores de terapia génica, sin embargo, este es el diámetro recomendado para la inyección de células sin daño a las células o al ojo. En comparación con agujas de acero, la aguja capilar de vidrio tiene una punta muy fina, pero romo, para permitir la visualización de la inyección de fluido y el acceso al espacio subretiniano sin causar la rotura retiniana. Limpie estas agujas tiradas si es necesario el uso del 70% de etanol, y guárdelo en un recipiente estéril. A 15 cm estéril placa de cultivo de tejido con cinta adhesiva para sujetar las agujas en su lugar es una forma en que para mantener las agujas de inyección cubierto y en un ambiente estéril. En este punto, complete la puesta a punto dentro de la sala de operaciones donde el procedimiento se llevará a cabo. Es más fácil mantener todo el equipo en la sala quirúrgica en todo momento con el fin de que siga siendo estéril, sobre todo si este procedimiento se realiza dentro de una instalación de barrera. </li><li> Aspirar de silicona a la aguja de inyección y expulsar la silicona para dejar un revestimiento a lo largo de las paredes internas de la aguja. El revestimiento de silicona maximiza el paso de células y virus a través del orificio de agujas, que de otro modo se pegan a las paredes capilares de vidrio interiores. </li><li> Obtener una longitud de aproximadamente 8 cm de tubo de plástico estéril mediante la reducción de un 25 ¾ de calibre de recogida de sangre con luer-lock en el punto directamente después de la aguja (retirar la aguja de la tubería). </li><li> Llenar un 1 ml Sub-Q-26 5/8-gauge deslizamiento punta de la jeringa con solución salina estéril y retirar la aguja de la jeringa. </li><li> Coloque la aguja de inyección en el extremo cortado de la tubería de plástico y unir la jeringa al luer-lock en el otrofinal. </li><li> Aspirar solución salina estéril para llenar el espacio muerto de la aguja y el tubo capilar, expulsando algunos salina a través de la aguja para asegurarse de que esté correctamente colocado sin fugas. A continuación, se aspira una pequeña cantidad de aproximadamente 1 l de aire, en la punta de la aguja de inyección. Esto separa la solución salina desde el fluido de inyección y proporcionar una señal visual que indica el final de la inyección de fluido durante el procedimiento quirúrgico. El aparato de inyección debe mantenerse en una superficie limpia limpiados con etanol al 70% durante el procedimiento quirúrgico. Además, todo el equipo usado durante el procedimiento quirúrgico se debe limpiar antes y después con etanol al 70%, para la excepción de las agujas de inyección que ya debe mantenerse estéril y listo para su uso. Estas agujas deben desecharse después de la cirugía, y no volver a utilizarse. </li><li> Finalmente, aspirar solución inyectable que contiene el vector empaquetado deseado terapia génica viral o células madre. Esto se puede hacer portomando la solución de inyección en una punta de pipeta estéril, y después de pipeteado de la solución sobre la superficie de una placa de cultivo celular estéril. La solución puede ser fácilmente trasladada a la aguja de inyección con la jeringa. La cantidad necesaria variará dependiendo de la edad del ratón. Para nuestros propósitos utilizar post-natales día 5 ratones, que pueden ser inyectados con 0.5-0.8 l de fluido de inyección. Las cantidades más pequeñas, l 0,5 o menos, pueden ser utilizados para ratones más jóvenes y cantidades mayores, tales como 1 l, se puede utilizar para ratones adultos. El título viral o el número de células tiene que ser determinado con base en el virus / células se inyectan y el tejido objetivo deseado, como partículas virales de más o de células en un volumen pequeño puede conducir a la toxicidad para las células de la retina. En el vídeo, para propósitos de visualización, se han utilizado 1,5 l, una mayor cantidad de colorante que es necesario inyectar en el ojo. </li></ol> 2. Acceso al espacio subretiniano <ol><li> Dentro de la sala quirúrgica estéril,estabilizar o anestesiar al ratón de acuerdo con el protocolo de manipulación de animales aprobado localmente, que varían según la edad del ratón. Anestesia común para ratones adultos incluye el uso de gas isoflurano o una inyección intra-peritoneal de 0,1 ml/10g peso corporal de ketamina (100 mg / ml) y xilazina (20 mg / ml) en solución salina estéril. Para los ratones perinatales, las técnicas comunes de anestesia incluyen el uso de gas isoflurano o crioanestesia (hipotermia). Todas las técnicas de anestesia debe ser aprobado por el comité local de IACUC antes de su uso. Por lo general el uso post-natal días (P) 5 ratones, aunque técnicas similares puede ser aplicada a los ratones tan jóvenes como P0 o ratones adultos. El procedimiento quirúrgico no puede comenzar hasta que el ratón ha dejado de mover las extremidades y ya no responde a los pies pellizcos. Para los ratones perinatales, se vuelven notablemente más ligero en color, ya que el flujo de sangre se ralentizará, otra de las claves para saber que están completamente bajo anestesia. </li><li> En ratones perinatales, use tijeras Vannas consecutivos para make un aproximado de 1,5 mm de incisión a lo largo de la fisura tapa cerrada. Tenga cuidado de cortar a la sangría, donde el ojo naturalmente se abrirá en el futuro. Esto asegura que las tapas se cura y abrir correctamente durante el desarrollo del ratón. Una cuchilla quirúrgica puede ser utilizado para este propósito, aunque preferimos tijeras de Vannas ya que reducen el riesgo de perforar el ojo durante este procedimiento. En el video, las tijeras se utilizan para pinchar directamente y corte a lo largo del borde del párpado. Cuando el aprendizaje de esta técnica, el fórceps se debe utilizar para levantar el párpado antes de cortar y reducir el riesgo de dañar el ojo. </li><li> Separar los párpados con pinzas curvas para vestirse proptose los ojos y apretar los párpados ligeramente por debajo del ojo para mantenerlo proptosed para inyección. Si la incisión tapa hecha en el paso dos es demasiado grande, el ojo se deslice de nuevo bajo las tapas y prevenir la exposición adecuada durante el procedimiento de inyección. Para los ratones adultos, aplicando una ligera presión alrededor de los ojos con el Dr.essing fórceps puede mantener el ojo proptosed para inyección. </li><li> Hacer una pequeña incisión escleral en o posterior al ecuador del globo por el rascado de la superficie con una cuchilla de microcirugía 15-grado. Esta incisión debe ser suficientemente grande para pasar la punta de la aguja de inyección, pero no más que eso. Si se prefiere, una aguja pequeña, afilado tal como una aguja de acupuntura se puede utilizar para hacer la incisión en el espacio subretiniano en lugar de la hoja de microcirugía. En los animales con pigmentación oscura, de color marrón oscuro-pigmentada tejido (la coroides-epitelio pigmentario retinal) se hará visible en el punto de incisión. En más ligeros ratones pigmentados o albino, un rotulador quirúrgico de marcado puede ser aplicado a la punta de la hoja de microcirugía para dejar una mancha de tinta que indica el lugar de la incisión. Si transparente (vítreo) reflujos de fluido desde el lugar de la incisión, la cuchilla se coloca demasiado profunda y entró en la cavidad vítrea y el virus terapéutico o células pueden entrar en el espacio durante la inyección intravítrea. Para visualizatien fin, hemos hecho la incisión hasta este punto en el video. Todavía es posible completar una inyección subretiniana en este caso, sin embargo, el desprendimiento de la retina causado por la presencia del fluido de inyección no puede curarse completamente en este ratón. Por lo tanto, se debe tener cuidado para cortar solamente la superficie exterior del ojo y no a través de la retina antes de la inyección. </li><li> Con cuidado, inserte la aguja en el sitio de la incisión y avanzar en paralelo a la pared externa del ojo para entrar en el espacio subretiniano. Avanzando demasiado cerca de la pared exterior o demasiado profundo dentro del ojo vaya a dirigir la inyección en el lugar equivocado. El mejor método para comprender si la aguja está en la ubicación correcta es practicar la técnica. Practicar en ratones ligeramente pigmentadas o albino puede ayudar a que las inyecciones precisas y exactas en el espacio subretiniano. Esto es porque el fluido de la aguja y la inyección es visible dentro de estos ojos. </li><li> Aplique una leve presión sobre el émbolo de la jeringa ygin inyección del fluido deseado. Si la aguja está colocada correctamente en el espacio subretiniano, la contrapresión moderado se sentía. Si la aguja está dentro del vítreo, habrá contrapresión significativamente menor y potencialmente algo de reflujo del fluido durante la inyección. Si hay contrapresión importante, mantenga la aguja en su lugar por lo menos durante otros 15 segundos antes de retirar la aguja lentamente. Esto permitirá que la alta presión intraocular para igualar en lugar de a reflujo el virus inyecta o células de nuevo fuera del sitio de la incisión. Parte del aire y la solución salina puede ser inyectado en el espacio subretiniano debido al aumento de la presión requerida durante el procedimiento de inyección. Se debe tener cuidado de no sobre-inyectar aire o solución salina, ya que puede eliminar el virus inyecta o células del ojo. También es posible hacer que el desprendimiento de retina permanente de la presencia de demasiado líquido inyectado en el espacio subretiniano. Para fines de visualización, el exceso de tinte y se inyectó aire into el espacio subretiniano en el vídeo. Se puede ver claramente cómo parte del tinte se enjuaga de nuevo fuera del espacio subretinal si se inyecta demasiado, sino también cómo la burbuja de aire permanece dentro del espacio subretinal y no desaparece en el vítreo. Esto se utiliza para enfatizar que estas inyecciones eran todos a la ubicación correcta de los ojos, así que uno puede visualizar cómo la aguja debe entrar en el sitio de la incisión. Todas las inyecciones en el espacio subretiniano causar un desprendimiento de retina temporal debido a la presencia del fluido de inyección. Si el procedimiento de inyección se ha completado correctamente, este desprendimiento de retina temporal se cura dentro de 24 horas y los ratones pueden ser utilizados para todos los experimentos posteriores. El ojo puede permanecer suave durante aproximadamente una semana debido a la intervención quirúrgica, por lo que una segunda inyección se deben evitar durante este período de tiempo. </li><li> Para los ratones recién nacidos, utilice las pinzas curvas aderezo para empujar suavemente el ojo detrás de los párpados y en la órbita. Puede ser útilesperar un minuto con el fin de permitir que el virus a establecerse dentro del espacio subretinal y no causar que sea purgada del sitio de la incisión cuando se presiona suavemente el ojo de vuelta a su órbita. Después de la cirugía, una gota de 0,5% de bupivacaína (marcaína) diluido al 0,25% en solución salina estéril con una aguja de calibre 25-puede ser colocado en el sitio de inyección. Los ratones no muestran signos evidentes de angustia después de la cirugía subretiniana y el uso de bupivacaína como un analgésico tópico de larga duración ha sido amplia en los últimos tres años. Ratones siempre deben ser controlados después del procedimiento quirúrgico para observar cualquier signo de peligro, tales como las infecciones, inflamación, o una disminución en las actividades cotidianas del ratón. Si esto ocurre, el veterinario debe ser notificado y otras medicaciones de dolor como la buprenorfina (0,05 mg / kg) puede administrarse como una inyección intraperitoneal. </li><li> Despierta el ratón de la anestesia local, según el protocolo aprobado manipulación de animales. El ratón se debe mantener en un p calefacciónanuncio para mantener la temperatura normal del cuerpo como se despierta de la anestesia. El procedimiento quirúrgico debe tomar menos de cinco minutos para completar, sin contar el tiempo para el ratón para someterse a la anestesia. Por lo tanto, una resistencia de calentamiento no es necesario durante el procedimiento en sí, pero puede ser necesaria mientras que uno está aprendiendo la técnica como el procedimiento podría tener una mayor duración de tiempo. El ratón no se debe volver a colocar en una jaula limpia hasta que ha comenzado a moverse por sí mismo. Para los recién nacidos, pellizcos suaves dedos le ayudará para que puedan recuperarse completamente de la anestesia, y deben recuperar su color rosado y el movimiento antes de ser colocado de nuevo con la madre. Los ratones deben ser controlados a través del tiempo en busca de signos de malestar como se indica anteriormente. </li></ol>

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	<li>Abe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+retina+using+pigment+epithelial+cell+transplantation.">Regeneration of the retina using pigment epithelial cell transplantation.</a> Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 106, 778-803 (2002).</li><li>Jacobson, S. G., Cideciyan, A. V., Ratnakaram, R., Heon, E., Schwartz, S. B., Roman, A. J., Peden, M. C., Aleman, T. S., Boye, S. L., Sumaroka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+Leber+congenital+amaurosis+caused+by+RPE65+mutations:+safety+and+efficacy+in+15+children+and+adults+followed+up+to+3+years.">Gene therapy for Leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years.</a> Arch. Ophthalmol. 130, 9-24 (2011).</li><li>Schwartz, S. D., Hubschman, J. P., Heilwell, G., Franco-Cardenas, V., Pan, C. K., Ostrick, R. M., Mickunas, E., Gay, R., Klimanskaya, I., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration:+a+preliminary+report.">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379, 713-720 (2012).</li><li>Wang, N. K., Tosi, J., Kasanuki, J. M., Chou, C. L., Kong, J., Parmalee, N., Wert, K. J., Allikmets, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+reprogrammed+embryonic+stem+cells+improves+visual+function+in+a+mouse+model+for+retinitis+pigmentosa.">Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa.</a> Transplantation. 89, 911-919 (2010).</li><li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy.">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).</li><li>Tosi, J., Sancho-Pelluz, J., Davis, R. J., Hsu, C. W., Wolpert, K. V., Sengillo, J. D., Lin, C. S., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+expression+of+cDNA+and+shRNA+slows+degeneration+in+retinitis+pigmentosa.">Lentivirus-mediated expression of cDNA and shRNA slows degeneration in retinitis pigmentosa.</a> Exp. Biol. Med. 236, 1211-1217 (2011).</li><li>Tucker, B. A., Park, I. H., Qi, S. D., Klassen, H. J., Jiang, C., Yao, J., Redenti, S., Daley, G. Q., Young, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+adult+mouse+iPS+cell-derived+photoreceptor+precursors+restores+retinal+structure+and+function+in+degenerative+mice.">Transplantation of adult mouse iPS cell-derived photoreceptor precursors restores retinal structure and function in degenerative mice.</a> PLoS One. 6, e189992 (2011).</li><li>Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. , (2010).</li><li>Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+degeneration+mutants+in+the+mouse.">Retinal degeneration mutants in the mouse.</a> Vision Res. 42, 517-525 (2002).</li><li>Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+fundus+photography+and+angiography:+a+catalogue+of+normal+and+mutant+phenotypes.">Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes.</a> Mol. Vis. 5, 22 (1999).</li><li>Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+resources+for+vision+research.">Mouse model resources for vision research.</a> J. Ophthalmol. 2011, 391384 (2011).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Esta técnica de vídeo proporciona instrucciones para completar el procedimiento de inyección subretiniana quirúrgica con éxito, y asegurar que el vector de terapia génica o de células madre se colocan en la posición necesaria para tratar eficazmente la enfermedad oftálmica. Esta técnica permite la focalización de las células de la retina tales como el RPE o fotorreceptores, puesto que coloca los vectores de terapia génica o tejidos derivados de células madre en la proximidad de estas células. Los métodos...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> 0.8-1.10 x 100 mm Tubo capilar (vidrio) </td><td> Kimble Glass, Inc. </td><td> 34502 99 </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / Brown Micropipeta Puller </td><td> Sutter Instrument </td><td> P-97 </td><td> Narishige microforge se puede utilizar en su lugar. Catálogo # MF-900 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma Aldrich </td><td> SL2-25ML </td><td> Silicona </td></tr><tr><td> Fosfato de Dubecco salina tamponada con cloruro de calcio y cloruro de magnesio </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 14040-133 </td><td></td></tr><tr><td> Safety-Lok 3/4G 25 x 12 &quot;, set de muestras de sangre </td><td> BD Vacutainer </td><td> 367298 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml Sub-Q 265/8G Slip-punta de la jeringa </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 309597 </td><td></td></tr><tr><td> 0.5-10 l Finnpipette II-Volumen ajustable pipeteador </td><td> Fisherbrand </td><td> 21-377-815 </td><td></td></tr><tr><td> 1-200 mu l puntas biseladas Naturales </td><td> EE.UU. Scientific, Inc. </td><td> 1111-1700 </td><td></td></tr><tr><td> Discovery.V8 Microscopio estéreo </td><td> Zeiss </td><td> MC1500 </td><td></td></tr><tr><td> 60 mm x 15 mm Estilo de células tratadas placa de cultivo de poliestireno </td><td> Corning Incorporated </td><td> 430166 </td><td></td></tr><tr><td> Vannas rectas Tijeras </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3383 S </td><td></td></tr><tr><td> Pinza Dressing curva con dientes delicados </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1408 </td><td></td></tr><tr><td> 15 Grado Cuchillo Microcirugía </td><td> Wilsen Oftálmica Corp. </td><td> 091204 </td><td></td></tr><tr><td> La ketamina </td><td> Ketaset III </td><td> NADA # 45-290 </td><td></td></tr><tr><td> Xilazina </td><td> Lloyd Laboratorios </td><td> NADA # 139-236 </td><td></td></tr><tr><td> Bupivacaína (bupivacaína) </td><td> AstraZeneca </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> La buprenorfina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B9275 </td><td></td></tr></tbody></table>

subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye

La pérdida de visión afecta aproximadamente a 3,4 millones de personas en los Estados Unidos y se espera que aumente en los próximos años. 1 Recientemente, la terapia génica y el trasplante de células madre se han convertido en importantes herramientas terapéuticas para el tratamiento de la ceguera como resultado de las enfermedades degenerativas de retina. Varias formas de trasplante autólogo para la degeneración macular relacionada con la edad (AMD), como iris trasplante de células del epitelio pigmentario, han generado resultados alentadores, y los ensayos clínicos humanos han comenzado a otras formas de terapias con células madre y genes. 2 Estos incluyen RPE65 sustitución de genes terapia en pacientes con amaurosis congénita de Leber y un trasplante de células RPE humanas usando madre embrionarias (ES) de células en la enfermedad de Stargardt. 3-4 Ahora que hay vectores de terapia génica y células madre disponibles para el tratamiento de pacientes con enfermedades de la retina, es importante verificar estas terapias potenciales en modelos animales antes de aplicarIng. ellos en estudios con humanos. El ratón se ha convertido en un importante modelo científico para probar la eficacia terapéutica de los vectores de terapia génica y trasplante de células madre en el ojo. 5-8 En este artículo de vídeo, se presenta una técnica para inyectar vectores de terapia génica o células madre en el espacio subretiniano de el ojo del ratón mientras que minimiza el daño al tejido circundante.

Un dibujo del ojo del ratón se muestra con grandes estructuras marcadas para referencia, con flechas que muestran las ubicaciones de los procedimientos de inyección intravítrea tanto subretinal y quirúrgicos (puntas de flecha, Figura 1). Vectores de terapia génica, tales como el vector lentiviral lacZ (Figura 2), se puede inyectar el uso de estas ubicaciones. Además, las células madre, tales como células madre embrionarias de ratón (Figura 3), también...

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Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

Esta técnica quirúrgica ilustra la inyección de vectores de terapia génica y las células madre en el espacio subretiniano del ojo del ratón.

Inyección subretiniana de vectores de terapia génica y células madre en el ojo del ratón

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

subretinal-injection-gene-therapy-vectors-stem-cells-perinatal-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

32.9K vistas.  Columbia University. Esta técnica quirúrgica ilustra la inyección de vectores de terapia génica y las células madre en el espacio subretiniano del ojo del ratón.

Video: Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a number of gene therapy clinical trials. More recently, a number of additional AAV serotypes have also been isolated, which have been shown to exhibit selective tissue-tropism in various small and large animal models1. Of the 10 most commonly used AAV serotypes, AAV3 is by far the least efficient in transducing cells and tissues in vitro as well as in vivo.
However, in our recently published studies, we have documented that AAV3 vectors transduce human liver cancer - hepatoblastoma (HB) and hepatocellular carcinoma (HCC) - cell lines extremely efficiently because AAV3 utilizes human hepatocyte growth factor receptor as a cellular co-receptor for binding and entry in these cells2,3.
In this article, we describe the steps required to achieve high-efficiency transduction of human liver cancer cells by recombinant AAV3 vectors carrying a reporter gene. The use of recombinant AAV3 vectors carrying a therapeutic gene may eventually lead to the potential gene therapy of liver cancers in humans.

In this article, we describe the identification of the adeno-associated virus serotype 3 (AAV3) as the most efficient vector for targeting human liver cancer cells.

De alta eficiencia de transducción de las células de cáncer de hígado por recombinante serotipo del virus adeno-asociado 3 Vectores

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

Investigación

Medicina

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Establecimiento y propagación de los tumores del retinoblastoma humanos en ratones con deficiencia inmune

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive molecules contain an oxygen and include H2O2 (hydrogen peroxide), NO (nitric oxide), O2- (oxide anion), peroxynitrite (ONOO-), hydrochlorous acid (HOCl), and hydroxyl radical (OH-).
Oxidative species are produced not only under pathological situations (cancers, ischemic/reperfusion, neurologic and cardiovascular pathologies, infectious diseases, inflammatory diseases 1, autoimmune diseases 2, etc&hellip;) but also during physiological (non-pathological) situations such as cellular metabolism 3, 4. Indeed, ROS play important roles in many cellular signaling pathways (proliferation, cell activation 5, 6, migration 7 etc..). ROS can be detrimental (it is then referred to as "oxidative and nitrosative stress") when produced in high amounts in the intracellular compartments and cells generally respond to ROS by upregulating antioxidants such as superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione (GSH) that protects them by converting dangerous free radicals to harmless molecules (i.e. water). Vitamins C and E have also been described as ROS scavengers (antioxidants).
Free radicals are beneficial in low amounts 3. Macrophage and neutrophils-mediated immune responses involve the production and release of NO, which inhibits viruses, pathogens and tumor proliferation 8. NO also reacts with other ROS and thus, also has a role as a detoxifier (ROS scavenger). Finally NO acts on vessels to regulate blood flow which is important for the adaptation of muscle to prolonged exercise 9, 10. Several publications have also demonstrated that ROS are involved in insulin sensitivity 11, 12.
Numerous methods to evaluate ROS production are available. In this article we propose several simple, fast, and affordable assays; these assays have been validated by many publications and are routinely used to detect ROS or its effects in mammalian cells. While some of these assays detect multiple ROS, others detect only a single ROS.

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Here we propose simple methods to test and evaluate the presence of reactive oxygen species in cells.

Producción y la detección de especies reactivas del oxígeno (ROS) en los cánceres

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and acquired diseases. Apart from congenital or inherited abnormalities with the requirement for long-term expression of the delivered gene, several non-inherited perinatal conditions, where short-term gene expression or pharmacological intervention is sufficient to achieve therapeutic effects, are considered as potential future indications for this kind of approach. Candidate diseases for the application of short-term prenatal therapy could be the transient neonatal deficiency of surfactant protein B causing neonatal respiratory distress syndrome1,2 or hyperoxic injuries of the neonatal lung3. Candidate diseases for permanent therapeutic correction are Cystic Fibrosis (CF)4, genetic variants of surfactant deficiencies5 and &alpha;1-antitrypsin deficiency6.
Generally, an important advantage of prenatal gene therapy is the ability to start therapeutic intervention early in development, at or even prior to clinical manifestations in the patient, thus preventing irreparable damage to the individual. In addition, fetal organs have an increased cell proliferation rate as compared to adult organs, which could allow a more efficient gene or stem cell transfer into the fetus. Furthermore, in utero gene delivery is performed when the individual's immune system is not completely mature. Therefore, transplantation of heterologous cells or supplementation of a non-functional or absent protein with a correct version should not cause immune sensitization to the cell, vector or transgene product, which has recently been proven to be the case with both cellular and genetic therapies7.
In the present study, we investigated the potential to directly target the fetal trachea in a mouse model. This procedure is in use in larger animal models such as rabbits and sheep8, and even in a clinical setting9, but has to date not been performed before in a mouse model. When studying the potential of fetal gene therapy for genetic diseases such as CF, the mouse model is very useful as a first proof-of-concept because of the wide availability of different transgenic mouse strains, the well documented embryogenesis and fetal development, less stringent ethical regulations, short gestation and the large litter size.
Different access routes have been described to target the fetal rodent lung, including intra-amniotic injection10-12, (ultrasound-guided) intrapulmonary injection13,14 and intravenous administration into the yolk sac vessels15,16 or umbilical vein17. Our novel surgical procedure enables researchers to inject the agent of choice directly into the fetal mouse trachea which allows for a more efficient delivery to the airways than existing techniques18.

We developed a novel surgical approach for intratracheal administration of bioactive agents into the mouse fetus. The delivery route is more efficient in targeting the fetal mouse lungs than the commonly used intra-amniotic injection. This procedure has to date not been described in a mouse model.

Un nuevo enfoque quirúrgico para la administración intratraqueal de agentes bioactivos en un modelo de ratón fetal

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

Desprendimiento de Retina modelo en roedores por inyección subretiniana de Hialuronato de Sodio

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability in industrialized countries. Replacement of degenerated photoreceptors by cell transplantation represents a possible treatment option in future clinical applications. Indeed, recent preclinical studies demonstrated that immature photoreceptors, isolated from the neonatal mouse retina at postnatal day 4, have the potential to integrate into the adult mouse retina following subretinal transplantation. Donor cells generated a mature photoreceptor morphology including inner and outer segments, a round cell body located at the outer nuclear layer, and synaptic terminals in close proximity to endogenous bipolar cells. Indeed, recent reports demonstrated that donor photoreceptors functionally integrate into the neural circuitry of host mice. For a future clinical application of such cell replacement approach, purified suspensions of the cells of choice have to be generated and placed at the correct position for proper integration into the eye. For the enrichment of photoreceptor precursors, sorting should be based on specific cell surface antigens to avoid genetic reporter modification of donor cells. Here we show magnetic-associated cell sorting (MACS) - enrichment of transplantable rod photoreceptor precursors isolated from the neonatal retina of photoreceptor-specific reporter mice based on the cell surface marker CD73. Incubation with anti-CD73 antibodies followed by micro-bead conjugated secondary antibodies allowed the enrichment of rod photoreceptor precursors by MACS to approximately 90%. In comparison to flow cytometry, MACS has the advantage that it can be easier applied to GMP standards and that high amounts of cells can be sorted in relative short time periods. Injection of enriched cell suspensions into the subretinal space of adult wild-type mice resulted in a 3-fold higher integration rate compared to unsorted cell suspensions.

Cell transplantation represents a strategy for the treatment of retinal degeneration characterized by photoreceptor loss. Here we describe a method for enrichment of transplantable photoreceptors and their subretinal grafting into adult mice.

Trasplante Subretinal De Macs Purificado Fotorreceptores Precursores De Células En La Retina Del Ratón Adulto

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

Realizar Subretinal Inyecciones en roedores administrar células de la retina epitelio pigmentario en Suspensión

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

El estudio de cáncer de páncreas Tallo Características de las células para el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on animal models. The identification of PD-associated genes has led to the development of genetic PD models. Most transgenic &#945;-SYN mouse models develop gradual &#945;-SYN pathology but fail to display clear dopaminergic cell loss and dopamine-dependent behavioral deficits. This hurdle was overcome by direct targeting of the substantia nigra with viral vectors overexpressing PD-associated genes. Local gene delivery using viral vectors provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. Specific brain regions can be targeted (e.g. the substantia nigra), expression can be induced in the adult setting and high expression levels can be achieved. Further, different vector systems based on various viruses can be used. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based alpha-synuclein animal model for Parkinson&#39;s disease.

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson&#039;s Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson's disease.

Desarrollo de un modelo basado en la rata alfa-sinucleína para la enfermedad de Parkinson mediante inyección estereotáctica de un vector viral adeno-asociado recombinante

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

Un Paso a Paso Protocolo para la cirugía subretiniana en conejos

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...