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Declaración de Ética: Todas las pruebas de muestras humanas se llevó a cabo después de obtener la aprobación Institutional Review Board (IRB). 1. Extracción de ADN a partir de FFPE de tejido, sangre periférica y la médula ósea Aspirar <ol><li> Para el hueso tejido FFPE ósea con el kit de extracción de ADN FFPE <ol><li> Comienza con el tejido FFPE a partir de diapositivas no teñidas (5 - 10 secciones a 5 - 10 espesor m). NOTA: Si comienzo con virutas de tejido, el uso del 3 - 6 secciones a las 5 - espesor de 10 micras y vaya al paso 1.1.6. </li><li> Colocar los portaobjetos en una cesta portaobjetos y preparar cuatro depósitos de lavado (dos para Xileno y dos para 100% de alcohol). Añadir un volumen mínimo de 600 ml de solución para cada cesta. </li><li> Desparafinar las diapositivas haciendo un lavado xileno 5 min en la primera bandeja. Transferir los portaobjetos al segundo depósito de lavado xileno durante 5 min adicionales. </li><li> Después de la desparafinación, lavar los portaobjetos con alcohol 100% durante 5 min. Transferir los portaobjetos a la segundadepósito de lavado con alcohol para un 5 minutos adicionales. </li><li> Permitir que las diapositivas se sequen por completo bajo una campana antes de raspar con una hoja de afeitar en un tubo de microcentrífuga. NOTA: Si un tobogán H &amp; E con la región del tumor indicado está disponible, alinee las diapositivas y raspar solamente la región del tumor. </li><li> Continúe con las instrucciones del fabricante folleto incluido en el kit. </li></ol></li><li> Para BM aspirado y sangre periférica <ol><li> Extracto de acuerdo con las instrucciones del fabricante folleto con estas especificaciones. NOTA: Hay numerosos kits y métodos para la extracción de ADN a partir de células y tejidos FFPE disponibles comercialmente. Prácticamente, todos pueden ser utilizados. Utilizar un método que se establece en el laboratorio. <ol><li> Utilice 200 sangre l periférica (PB) o 100! L BM + 100! L de PBS. </li><li> Usar 4 l de RNasa una solución madre. </li><li> Se eluyó con tampón de elución 100 l. </li></ol></li></ol></li><li> Cuantificación de ADN<ol><li> Medir las concentraciones de ADN utilizando un espectrofotómetro asegurar a / 280 nm relación de 260 nm de aproximadamente 1,8 (para el ADN puro). Si la relación es apreciablemente menor, puede indicar la presencia de proteína, fenol, u otros contaminantes que pueden interferir con las aplicaciones posteriores. </li><li> Ajustar las concentraciones de ADN a aproximadamente el 50 - 100 ng / l con tampón de elución apropiado. </li></ol></li></ol> 2. Wild-Type bloqueo PCR <ol><li> Diseño de cebadores <ol><li> Diseño y obtener cebadores para genes de interés de acuerdo con la anteriormente describen directrices generales de PCR primer diseño 13. Incluir M13-cebadores directo e inverso de secuenciación universales en los cebadores de PCR. NOTA: El ensayo MYD88 fue desarrollado para amplificar el exón 5 de MYD88 (G259 - N291) y 110 nucleótidos situada en la región 5&#39; intrónica para cubrir el sitio de empalme y parte del intrón 4. El cebadores directo e inverso se diseñaron con un 5&#39; -M13 secuencia (M13-forward: tgt aaa acg acg gcc agt; M13-inverso: cag gaa aca gct atg acc) para permitir la hibridación de los cebadores de secuenciación complementarios (véase Materiales Tabla). </li></ol></li><li> Diseño de oligonucleótidos nucleico cerrado Ácido <ol><li> Diseñar el oligonucleótido de bloqueo a ser de aproximadamente 10 - 15 bases de longitud y complementario a la plantilla WT donde se desea el enriquecimiento de mutantes. NOTA: Un oligo más corto mejorará la discriminación desajuste. Para lograr una alta especificidad de la diana, es importante no usar demasiado nucleótidos de bloqueo ya que esto puede dar lugar a un oligonucleótido muy &quot;pegajosa&quot;. El contenido y la longitud y el nucleótido de bloqueo debería ser optimizar de acuerdo con el nucleótido específico que necesitan ser bloqueado. Es importante para lograr una alta especificidad de unión sin comprometer la estructura secundaria y el riesgo de auto-complementariedad. </li><li> Diseñar el oligo de bloqueo para tener una T m 10 - 15 ° C por encima de la temperat extensiónUre durante el termociclado. Ajuste el T m por adición o eliminación de bases de bloqueo o por sustitución de bases de bloqueo para el ADN, evitando largos tramos (3 - 4 bases) de bloqueo de G o C bases. <ol><li> Vaya al sitio web herramientas de oligo (véase la Tabla de Materiales) y seleccione la función &quot;bloqueo Oligo Tm Predicción&quot;. </li><li> Pegar la secuencia de la plantilla WT que se desea para ser bloqueado en el cuadro &quot;Oligo Secuencia&quot;. Añadir &quot;+&quot; delante de las bases para indicar las bases de bloqueador. </li><li> Seleccione el botón &quot;Calcular&quot; para determinar la aproximado Tm del híbrido de ADN-bloqueante. </li></ol></li><li> Diseñar el oligo de bloqueo para evitar la formación de estructuras secundarias o auto-dímeros. <ol><li> Vaya al sitio web herramientas de oligo (véase la Tabla de Materiales) y seleccione la función &quot;bloqueo Oligo Optimizer&quot;. </li><li> Pegar la secuencia de la plantilla WT que se desea para ser bloqueado en el cuadro. Añadir &quot;+&quot; delante de las bases para indicar las bases de bloqueo. </li><li> Seleccione las dos cajas para &quot;Estructura Secundaria&quot; y &quot;Propio&quot;. Pulse el botón Analizar para revisar el oligo de estructuras secundarias potencialmente problemáticos o auto-dímeros. NOTA: Las puntuaciones representan cálculos muy aproximados de la Tm &#39;s de las estructuras secundarias y auto-dímeros. Las puntuaciones más bajas son, por tanto óptima y se pueden conseguir mediante la limitación de emparejamiento bloqueador-bloqueante. El oligonucleótido de bloqueo para MYD88 [MYD88blocker (TCAGA + AG + C + G + A + C + T + G + A + T + CC / invdT /)] fue diseñado para cubrir los aminoácidos Q262-I266 y cuenta con un extremo 3 &#39;invertida dT para inhibir tanto la extensión por la ADN polimerasa y la degradación por exonucleasa 3 &#39;. Este oligo bloqueo específico es un 17 mer con 10 bases de bloqueo que se indican como &quot;+ N&quot;. Los 7 bases restantes son nucleótidos de ADN ordinarios. </li></ol></li></ol></li><li> Configuración WTB-PCR y termociclado <ol><li> Preparar una WTB-PCR mi masterx (MMX) usando 2,5 l PCR tampón de reacción 10x w / 20 mM de MgCl2, 250 mM dNTPs, 0,2 M hacia delante y cebador inverso, 1,2 M MYD88blocker, y DNAsa, libre de RNasa, H ultra-pura 2 O para crear una final volumen de solución de 21,75 l por reacción. NOTA: Trabajar concentraciones son para el volumen de reacción final de 25 l (después de la adición de la plantilla de ADN y la polimerasa). Convencional PCR MMX se prepara simplemente omitiendo la adición de bloqueador. Todos los pasos del protocolo permanecen idénticas tanto para WTB y PCR convencional. Esto se puede utilizar en la validación y la determinación de enriquecimiento obtenido mediante la adición de bloqueador. <ol><li> Al calcular la cantidad de MMX para preparar asegurarse de dar cuenta de 3 reacciones adicionales (controles positivos y negativos y un control no plantilla para comprobar la contaminación) y al menos 1 de reacción adicional para el error de pipeteado. </li></ol></li><li> Vortex MMX a fondo. El MMX se puede almacenar a -80 ° C durante un máximo de Ayoreja. </li><li> Añadir 0,25 l de Taq ADN polimerasa por reacción a la MMX e invierta para mezclar. Una vez que la polimerasa se ha añadido a la MMX, mantener en hielo. </li><li> Poner una nueva placa de PCR 96 en un plato frío y la pipeta 22 l de MMX con polimerasa a cada pocillo de reacción. </li><li> Añadir 3 l de ADN genómico (50 - 100 ng / l a cada uno de los pocillos que contienen el MMX con polimerasa. </li><li> Sellar la placa y centrifugar brevemente para asegurar que la solución alcance la parte inferior de cada pocillo. </li><li> Cargar la placa de PCR en un termociclador. <ol><li> Establecer las condiciones de termociclado para la reacción de WTB-PCR como sigue: desnaturalización inicial a 95 ° C durante 6 min; 40 ciclos de desnaturalización a 95 ° C durante 30 s, el cebador de recocido a 56 ° C durante 30 s, y extensión a 72 ° C durante 1 min 20 s; extensión final a 72 ° C durante 10 min. NOTA: La mejor práctica consiste en completar el resto del protocolo en una zona físicamente separada para evitar la contaminación amplicón in futuras configuraciones. </li></ol></li></ol></li><li> Realizar electroforesis en gel de acuerdo con los protocolos descritos previamente 14 con el fin de determinar si WTB-PCR fue un éxito y para confirmar la falta de amplificación en el control no plantilla. </li><li> La purificación del producto de PCR por perlas magnéticas <ol><li> Eliminar perlas magnéticas de 4 ° C y llevar a temperatura ambiente. </li><li> Transferir 10 producto l PCR a una nueva placa de PCR. </li><li> Vortex las perlas magnéticas vigorosamente para resuspender completamente de las partículas magnéticas. </li><li> Añadir 18! L de perlas magnéticas a cada pocillo en la placa nueva. Pipeta de mezcla 10 veces. </li><li> Incubar a temperatura ambiente durante 5 min. </li><li> Coloque la placa de PCR sobre la placa de imán bordeado lateral durante 2 min a perlas separadas de la solución. </li><li> Aspirar el sobrenadante con una pipeta multicanal, evitando el sedimento de perlas. </li><li> Dispensar 150! L 70% de etanol en cada pocillo y se incuba a temperatura ambiente for al menos 30 s. Aspirar el etanol con una pipeta multicanal y desechar consejos. Repita este procedimiento de lavado una vez más. </li><li> Usando una pipeta multicanal 20 l aspirar el etanol restante de cada pocillo y desechar consejos. </li><li> Una vez los pocillos están secos (~ 10 min), retirar de la placa de imán y añadir 40 l de agua libre de nucleasa a cada mezcla bien y pipeta de 15 veces o vórtice suavemente. </li><li> Incubar a temperatura ambiente durante 2 min. </li><li> Coloque la placa de PCR sobre la placa de imán para 1 min a perlas separadas de la solución. </li><li> Transferencia de 35 l de producto purificado a una nueva placa de PCR. Esto es producto de PCR purificado está ahora listo para proceder con la secuenciación bidireccional o se puede almacenar a -20 ° C hasta que se necesite. NOTA: En el desarrollo de un nuevo ensayo, puede ser necesaria la cuantificación del producto de PCR purificado. De 1 - 3 ng / ADN amplicón l es óptima para la secuenciación bidireccional. Si la concentración es consistentemente baja, aumentar de productos y magnéticos perlas de PCR proportionalmente (1: 1,8). Si la concentración es siempre alta, se eluye con un mayor volumen de agua. </li></ol></li></ol> 3. La secuenciación de WTB-PCR Producto <ol><li> La secuenciación bidireccional NOTA: El siguiente protocolo es una forma modificada de las instrucciones del fabricante que ha sido optimizado para utilizar menos reactivos. <ol><li> Preparar adelante y atrás reacción de secuenciación se mezcla con 0,25 l Ready mezcla de reacción, 1,88 l Sequencing Buffer, 1,78 mu M M13-F o M13-R cebadores de secuenciación y añadir y ADNasa, libre de ARNasa, H ultra-pura 2 O para crear una solución final volumen de 9 l por reacción. Esta mezcla de reacción de secuenciación se puede almacenar a -20 ° C durante un máximo de un año. </li><li> Pipetear 9 l de la mezcla de reacción de secuenciación hacia adelante en cada pocillo de una nueva placa de PCR de 96 para la reacción de secuenciación hacia adelante. Repetir en una placa separada para la reacción de secuenciación inversa. </li><li> Añadir 1 l de la purificado WTB-PCR producto to cada pocillo tanto en el avance y placas inversa. </li><li> Sellar la placa y centrifugar brevemente para asegurar que la solución alcance la parte inferior de cada pocillo. </li><li> Cargar la placa de PCR en un termociclador. <ol><li> Establecer las condiciones de termociclado para la reacción de secuenciación de la siguiente manera: 96 ° C durante 1 min; 30 ciclos de 96 ° C durante 10 s, 50 ° C durante 5 s, 60 ° C durante 4 min; mantener a 4 ° C hasta que esté listo para la purificación. </li></ol></li></ol></li><li> Purificar los productos de secuenciación <ol><li> Preparar una solución fresca 01:25 de acetato de sodio 3 M (pH 5,2) y 100% de etanol. </li><li> Se prepara una solución fresca de etanol al 70%. </li><li> Añadir 30 l de acetato de sodio / 100% de solución de etanol a cada pocillo de ambos el avance y retroceso placas de secuenciación y mezcla de pipeta de 5 veces. </li><li> Volver a sellar la placa y se incuba en la oscuridad a temperatura ambiente durante 20 min. </li><li> Centrifugar la placa a 2.250 xg durante 15 min. </li><li> Quitar el sellador de placas y se invierte sobre un desperdicioenvase. NOTA: Invertir sólo una o la pastilla puede aflojarse de los fondos de los pocillos. </li><li> Coloque la placa invertida sobre una toalla de papel limpia y centrifugar a 150 xg durante 1 min. </li><li> Añadir 150! L 70% de etanol a cada pocillo. </li><li> Volver a sellar la placa y centrifugado a 2250 xg durante 5 min. </li><li> Repita los pasos 3.2.6 y 3.2.7. </li><li> Si los pozos no están completamente secos, permitir que se seque al aire a temperatura ambiente. Asegúrese de que las muestras se protegieron de la luz durante el secado. </li><li> Añadir 10 l formamida a cada pocillo y pipeta de mezcla 10 veces. Volver a sellar la placa. </li><li> Desnaturalizar en termociclador a 95 ° C durante 3 min, seguido de 4 ° C durante 5 min. </li><li> Después de la desnaturalización, reemplazar el sellador de placas con un septos y la secuencia en la plataforma de secuenciación de acuerdo con las instrucciones del fabricante 15. </li></ol></li></ol> 4. Análisis de los resultados de la secuenciación <ol><li> Visualizar trazas de secuenciación usando un dat secuenciaciónun software de análisis de acuerdo con las instrucciones del fabricante 16 y alinear a las respectivas secuencias de referencia. Alinear MYD88 a secuencia de referencia NCBI &quot;NM_002468&quot;. </li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligation+of+a+primer+at+a+mutation:+a+method+to+detect+low+level+mutations+in+DNA.">Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA.</a> Mutagenesis. 17 (5), 365-374 (2002).</li><li>Albitar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Sensitivity+Testing+Shows+Multiclonal+Mutations+in+Patients+with+CLL+Treated+with+BTK+Inhibitor+and+Lack+of+Mutations+in+Ibrutinib-Naive+Patients.">High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients.</a> Blood. 126 (23), 716 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

El ensayo WTB-PCR descrito aquí utiliza un conjunto genérico de cebadores con un oligo de bloqueo diseñado para bloquear la amplificación de ADN durante la extensión WT (Figura 1). El producto WTB-PCR se secuencia a continuación para el análisis mutacional. La utilidad de WTB-PCR / Sanger radica en su simplicidad, de alta sensibilidad, y de alto rendimiento. Usando las directrices que se describen aquí, la mayoría de los ensayos basados ​​en Sanger existentes pueden ser simplemente modifica...

secuenciación de Sanger ha sido tradicionalmente el estándar de oro en las pruebas de ambas mutaciones somáticas conocidos y desconocidos. Una de las limitaciones de secuenciación de Sanger es su límite de detección (~ 10 - 20% de alelo mutante en un fondo de WT) 1. Este nivel de sensibilidad es apropiado para la detección de mutaciones somáticas bajo nivel que pueden estar presentes en las muestras de los tejidos premalignos o pacientes con pocas células tumorales circulantes, o cuando la médula ósea (BM) es irregular. Esto también hace que la evaluación de la enfermedad residual después de la terapia o la detección de mutaciones de resistencia emergentes durante el tratamiento difícil por secuenciación convencional solo 2. Mediante la sustitución de PCR convencional con ácido nucleico bloqueado (LNA) mediada de tipo salvaje bloqueo de PCR (WTB-PCR) en la secuenciación de Sanger, sensibilidades de hasta 0,1% alelo mutante en un fondo de WT pueden lograrse 2, 3, 4. EnWTB-PCR, el enriquecimiento para los alelos mutantes se consigue mediante la adición de un corto (~ 10 - 14 NT) de bloqueo (LNA) oligonucleótido que se une preferentemente a ADN WT evitando de este modo la amplificación de ADN WT. El producto enriquecido WTB-PCR mutante puede ser entonces secuenciado. Mediante el bloqueo de DNA WT en lugar de seleccionar para mutaciones específicas WTB-PCR permite el enriquecimiento de ambas mutaciones conocidos y desconocidos presentes en fracciones de células minuto. Múltiples métodos se utilizan actualmente para la detección de mutaciones en pequeñas fracciones células. Esto incluye PCR, el sistema específico de alelo de amplificación refractario a la mutación (ARMS), desnaturalización cromatografía líquida de alto rendimiento (DHPLC), cuentas, emulsiones, amplificación y magnetismo (BEAMing), la liberación inducida por el campo eléctrico y la medición (Efirm), de alta resolución punto de fusión y otros. Sin embargo, la mayoría de estos métodos están limitados por los falsos positivos y la capacidad de detectar sólo una mutación que el ensayo fue diseñado para 4 </sup&gt;. WTB-PCR, sin embargo, permite al usuario visualizar las trazas de secuenciación que permite la detección de múltiples tipos de mutación y pueden ayudar en descartar falsos positivos debido a artefactos o eventos de desaminación. secuenciación de próxima generación (NGS) puede ofrecer una alternativa adecuada a la secuenciación convencional, sin embargo, sustancialmente mayores costos, la complejidad y tiempo de ensayo más largo hacen que sea una opción innecesaria para muchos tipos de enfermedades con pocos marcadores moleculares distintos o para la monitorización de pacientes en terapia para emergente mutaciones de resistencia. Además, las altas tasas de falsos positivos cuando la detección de variantes con frecuencias de los alelos mutantes de menos del 5% pueden plantear un problema para NGS a base de amplicón 5, 6. Aquí se demuestra el incremento en la sensibilidad alcanzado por WTB-PCR en la detección de mutaciones en la diferenciación mieloide gen del factor 88 como se describe por Albitar et al. Mutatio 3 MYD88ns son importantes factores de diagnóstico y pronóstico en macroglobulinemia de Waldenstrom (WM), IgM gammapatía monoclonal de significado desconocido (IgM-GMSI), esplénica linfoma de la zona marginal (SMZL), y linfoma difuso de células B grandes (DLBCL). mutaciones MyD88 se encuentran en casi todos los casos de WM y aproximadamente el 50% de los pacientes con inmunoglobulina M (IgM) secretoras de GMSI. En contraste, las mutaciones MyD88 se encuentran en solamente 0-6% de los pacientes con SMZL y están ausentes en el mieloma múltiple 7, 8. Debido a la superposición morfológica, inmunofenotípicos, citogenéticas y las características clínicas entre WM y SMZL o mieloma IgM-múltiple a menudo puede complicar el diagnóstico diferencial, la presencia de una mutación MYD88 puede servir como un factor de identificación útil 9. MyD88 mutaciones también se han asociado con una mayor carga de la enfermedad en pacientes con DLBCL y la mala supervivencia global después de la terapia 7, </sup&gt; 10. Además, debido a mutaciones MyD88 se encuentran con más frecuencia en DLBCL activado de células B-como (ABC) de centro germinal de células B-como (GCB) DLBCL o linfoma mediastínico de células B primario (PMBL), estado de la mutación MYD88 puede servir como una marcador sustituto para el subtipo ABC 11, 12. El protocolo detallada proporcionada aquí sirve como una plantilla a partir de la que los nuevos ensayos pueden ser desarrolladas o la mayoría de los ensayos de secuenciación existentes se pueden adaptar fácilmente para detectar con precisión mutaciones de baja frecuencia en varios tipos de muestras. El enfoque también se puede utilizar para el seguimiento y la detección de mutaciones resistentes que se pueden desarrollar en tumores o incluso las bacterias que se pueden desarrollar mientras que los pacientes están siendo tratados con terapia dirigida o antibióticos. Además, que aborda y remedios muchos de los problemas asociados con el enriquecimiento de mutación, en particular en tejido embebido en parafina fijado con formalina (FFPE).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 or 2 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05-402-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% alcohol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-084</td>
			<td>Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3730XL sequencer</td>
			<td>ABI</td>
			<td></td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agencourt AMPure XP</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td>For magnetic bead PCR purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminum sealing foils</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>T-2451-1</td>
			<td>For PCR and cold storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4337455</td>
			<td>For bi-directional sequencing. With 5X Sequencing Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5804 Series</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>A-2-DWP rotor (for PCR plate)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold plate for 96 well plates</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z606634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse, RNAse-free, ultra-pure water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs (100mM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10297-117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-96 Side-Skirted Magnet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12027</td>
			<td>For use in PCR Purification.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol Absolute&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E7023</td>
			<td>200 proof, for molecular biology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exiqon website Oligo Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.exiqon.com/oligo-tools">www.exiqon.com/oligo-tools</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastStart Taq DNA polymerase (5 U/ul)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>12032937001</td>
			<td>With10X concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2% agarose gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRead DNA FFPE extraction Kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>180134</td>
			<td>Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hi-Di Formamide</td>
			<td>ABI</td>
			<td>4311320</td>
			<td>For sequencing.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LNA oligonucleotide</td>
			<td>Exiqon</td>
			<td>500100</td>
			<td>5&#39;-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13-F Sequencing Primer</td>
			<td>ABI</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-tgt aaa acg acg gcc agt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M13-R Sequencing Primer</td>
			<td>ABI</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-cag gaa aca gct atg acc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mastercycler Pro S Thermocycler</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>E950030020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Model 5430</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 ml microcentrifuge tubes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000 Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR forward primer</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR reverse primer</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR plates</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>T-3107-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20, 200, 1000 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate septa, 96 well</td>
			<td>ABI</td>
			<td>4315933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>51304</td>
			<td>For BM aspirate and peripheral blood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeqScape Sortware v3.0</td>
			<td>ABI</td>
			<td>4474978</td>
			<td>For sequencing analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide basket</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate (3M, pH 5.2)&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile filtered pipette tips&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>20, 200, 1000 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex genie</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>SI-0236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash reservoir</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>~1000 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89370-088</td>
			<td>Histology grade</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

wild-type blocking pcr combined with direct sequencing as a highly sensitive method for detection of low-frequency somatic mutations

La detección precisa y la identificación de mutaciones de baja frecuencia puede ser problemático cuando la evaluación de la enfermedad residual después de la terapia, la detección de mutaciones de resistencia emergentes durante el tratamiento, o cuando los pacientes tienen pocas células tumorales circulantes. el bloqueo de PCR de tipo salvaje seguido de análisis de secuenciación ofrece alta sensibilidad, flexibilidad y simplicidad como metodología para la detección de estas mutaciones de baja frecuencia. Mediante la adición de un diseño personalizado bloqueado oligonucleótido de ácido nucleico a un ensayo de secuenciación basado en la PCR convencional nuevos o previamente establecido, sensibilidades de aproximadamente 1 alelo mutante en un fondo de 1.000 alelos WT pueden lograrse (1: 1000). artefactos de secuenciación asociados con eventos de desaminación encuentran comúnmente en tejidos embebidos en parafina fijadas con formalina se puede remediar en parte por el uso de uracilo ADN glicosilasa durante los pasos de extracción. El protocolo optimizado aquí es específico para la detección de mutación MYD88, pero puede servir como una plantilla para diseñar cualquierensayo de WTB-PCR. Ventajas del ensayo WTB-PCR sobre otros ensayos comúnmente utilizados para la detección de mutaciones de baja frecuencia que incluyen PCR específica de alelo y PCR cuantitativa en tiempo real incluyen un menor número de ocurrencias de falsos positivos, mayor flexibilidad y facilidad de implementación, y la capacidad de detectar tanto conocidos y mutaciones desconocidas.

Una visión general conceptual de WTB-PCR durante la extensión se presenta en la Figura 1. Debido a que un único desajuste de nucleótidos en el híbrido bloqueador-DNA disminuye en gran medida su temperatura de fusión (? T m = 20 - 30 ° C), la amplificación del alelo WT está bloqueada mientras que el ADN plantilla mutante es libre para completar la extensión 17. De esta manera, el ADN mutante se amplifica exponencialmente mientr...

Watch this Scientific Journal Video about Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations at JoVE.com

Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

El bloqueo de tipo salvaje PCR Combinado con la secuenciación directa como un método altamente sensible para la detección de baja frecuencia mutaciones somáticas

Accurate detection and identification of low frequency mutations can be problematic when assessing residual disease after therapy, screening for emerging ...

wild-type-blocking-pcr-combined-with-direct-sequencing-as-highly

Research

JoVE Journal

Genetics

11.6K vistas.  NeoGenomics Laboratories. Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

Video: Wild-type Blocking PCR Combined with Direct Sequencing as a Highly Sensitive Method for Detection of Low-Frequency Somatic Mutations

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

Detección del número de copias alteraciones Uso de Secuenciación de los organismos unicelulares

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Investigación

Genética

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been investigated in various organs and tissues in rat. However, standard methods for the purification of miRNAs and detection of their expression in rat peritoneal membrane have not been well established. We have developed an effective and reliable method to purify and quantify miRNAs using quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) in rat peritoneal membrane. This protocol consists of four steps: 1) purification of peritoneal membrane sample; 2) purification of total RNA including miRNA from peritoneal membrane sample; 3) reverse transcription of miRNA to produce cDNA; and 4) qRT-PCR to detect miRNA expression. Using this protocol, we successfully determined that the expression of six miRNAs (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327, and miRNA-34a-5p) increased significantly in the peritoneal membrane of a rat peritoneal fibrosis model compared with those in control groups. This protocol can be used to study the profile of miRNA expression in the peritoneal membrane of rats in many pathological conditions.

Here we present a protocol for the detection of microRNA expression in rat peritoneal membrane using quantitative real-time reverse-transcription polymerase chain reaction. This method is suitable for studying the microRNA expression profile in rat peritoneal membrane in several pathological conditions.

Detección de la expresión de microARN en la membrana peritoneal de ratas mediante PCR cuantitativa en tiempo real

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

Robusto de ADN y la secuenciación de alto rendimiento biblioteca construcción de especímenes de herbario

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

Detección de eventos raros usando ADN Error corregido y secuenciación de ARN

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a routine procedure is widely utilized throughout the world and its main limitation resides in the poor efficacy of transgene integration, resulting in a low yield of founder animals. Only few percent of animals born after implantation of injected fertilized oocytes have integrated the transgene. In contrast, lentiviral vectors are powerful tools for integrative gene transfer and their use to transduce fertilized oocytes allows highly efficient production of founder transgenic mice with an average yield above 70%. Furthermore, any mouse strain can be used to produce transgenic animal and the penetrance of transgene expression is extremely high, above 80% with lentiviral mediated transgenesis compared to DNA microinjection. The size of the DNA fragment that can be cargo by the lentiviral vector is restricted to 10 kb and represents the major limitation of this method. Using a simple and easy to perform injection procedure beneath the zona pellucida of fertilized oocytes, more than 50 founder animals can be produced in a single session of microinjection. Such a method is highly adapted to perform, directly in founder animals, rapid gain and loss of function studies or to screen genomic DNA regions for their ability to control and regulate gene expression in vivo.

Here, we present a protocol to promote transgene integration and production of founder transgenic mice with high efficacy by a simple injection of a lentiviral vector in the perivitelline space of a fertilized oocyte.

Lentivirales mediación producción de ratones transgénicos: un método Simple y altamente eficiente para el estudio directo de los fundadores

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near full-length (intact and defective), HIV-1 proviruses. FLIPS allows determination of the genetic composition of integrated HIV-1 within a cell population. Through identifying defects within HIV-1 proviral sequences that arise during reverse transcription, such as large internal deletions, deleterious stop codons/hypermutation, frameshift mutations, and mutations/deletions in cis acting elements required for virion maturation, FLIPS can identify integrated proviruses incapable of replication. The FLIPS assay can be utilized to identify HIV-1 proviruses that lack these defects and are&#160;therefore potentially replication-competent. The FLIPS protocol involves: lysis of HIV-1 infected cells, nested PCR of near full-length HIV-1 proviruses (using primers targeted to the HIV-1 5&#39; and 3&#39; LTR), DNA purification and quantification, library preparation for Next-generation Sequencing (NGS), NGS, de novo assembly of proviral contigs, and a simple process of elimination for identifying replication-competent proviruses. FLIPS provides advantages over traditional methods designed to sequence integrated HIV-1 proviruses, such as single-proviral sequencing. FLIPS amplifies and sequences near full-length proviruses enabling replication competency to be determined, and also uses fewer amplification primers, preventing the consequences of primer mismatches. FLIPS is a useful tool for understanding the genetic landscape of integrated HIV-1 proviruses, especially within the latent reservoir, however, its utilization can extend to any application in which the genetic composition of integrated HIV-1 is required.

Full-length individual proviral sequencing (FLIPS) provides an efficient and high-throughput method for the amplification and sequencing of single, near full-length (intact and defective) HIV-1 proviruses and allows for determination of their potential replication-competency. FLIPS overcomes limitations of previous assays designed to sequence the latent HIV-1 reservoir.

Amplificación de cerca integrales provirus VIH-1 para secuenciación de próxima generación

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation into thousands of nano-sized water-in-oil individual reactions. Recently, ddPCR has become one of the most accurate and sensitive tools for circulating tumor DNA (ctDNA) detection. One of the major limitations of the standard ddPCR technique is the restricted number of mutations that can be screened per reaction, as specific hydrolysis probes recognizing each possible allelic version are required. An alternative methodology, the drop-off ddPCR, increases throughput, since it requires only a single pair of probes to detect and quantify potentially all genetic alterations in the targeted region. Drop-off ddPCR displays comparable sensitivity to conventional ddPCR assays with the advantage of detecting a greater number of mutations in a single reaction. It is cost-effective, conserves precious sample material, and can also be used as a discovery tool when mutations are not known a priori.

Here, we present a protocol to accurately quantify multiple genetic alterations of a target region in a single reaction using drop-off ddPCR and a unique pair of hydrolysis probes.

Reacción en cadena polimerasa Digital sola gota para la detección integral y simultánea de mutaciones en las regiones de Hotspot

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to perform and its ability to standardize the fitness of many strains to a wild-type organism. The technique is limited, however, by available phenotypic markers and the number of strains that can be assessed simultaneously, creating the need for a great number of replicate experiments. Concurrent with large numbers of experiments, the labor and material costs for quantifying bacteria based on phenotypic markers are not insignificant. To overcome these negative aspects while retaining the positive aspects, we have developed a molecular-based approach to directly quantify microorganisms after engineering genetic markers onto bacterial chromosomes. Unique, 25 base pair DNA barcodes were inserted at an innocuous locus on the chromosome of wild-type and mutant strains of Salmonella. In vitro competition experiments were performed using inocula consisting of pooled strains. Following the competition, the absolute numbers of each strain were quantified using digital PCR and the competitive indices for each strain were calculated from those values. Our data indicate that this approach to quantifying Salmonella is extremely sensitive, accurate, and precise for detecting both highly abundant (high fitness) and rare (low fitness) microorganisms. Additionally, this technique is easily adaptable to nearly any organism with chromosomes capable of modification, as well as to various experimental designs that require absolute quantification of microorganisms.

Digital PCR-based Competitive Index for High-throughput Analysis of Fitness in Salmonella

This molecular-based approach for determining bacterial fitness facilitates precise and accurate detection of microorganisms using unique genomic DNA barcodes that are quantified via digital PCR. The protocol describes calculating the competitive index for Salmonella strains; however, the technology is readily adaptable to protocols requiring absolute quantification of any genetically-malleable organism.

Indice competitivo basado en PCR digital para el análisis de alta producción de la aptitud en Salmonella

A competitive index is a common method used to assess bacterial fitness and/or virulence. The utility of this approach is exemplified by its ease to ...

Validating Whole Genome Nanopore Sequencing, using Usutu Virus as an Example

Whole genome sequencing can be used to characterize and to trace viral outbreaks. Nanopore-based whole genome sequencing protocols have been described for several different viruses. These approaches utilize an overlapping amplicon-based approach which can be used to target a specific virus or group of genetically related viruses. In addition to confirmation of the virus presence, sequencing can be used for genomic epidemiology studies, to track viruses and unravel origins, reservoirs and modes of transmission. For such applications, it is crucial to understand possible effects of the error rate associated with the platform used. Routine application in clinical and public health settings require that this is documented with every important change in the protocol. Previously, a protocol for whole genome Usutu virus sequencing on the nanopore sequencing platform was validated (R9.4 flowcell) by direct comparison to Illumina sequencing. Here, we describe the method used to determine the required read coverage, using the comparison between the R10 flow cell and Illumina sequencing as an example.

We previously validated a protocol for amplicon-based whole genome Usutu virus (USUV) sequencing on a nanopore sequencing platform. Here, we describe the methods used in more detail and determine the error rate of the nanopore R10 flow cell.

Validación de la secuenciación de nanoporos del genoma completo, utilizando el virus Usutu como ejemplo

Whole genome sequencing can be used to characterize and to trace viral outbreaks. Nanopore-based whole genome sequencing protocols have been described for ...

Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples

Gene expression analysis by RNA sequencing (RNA-seq) enables unique insights into clinical samples that can potentially lead to mechanistic understanding of the basis of various diseases as well as resistance and/or susceptibility mechanisms. However, FFPE tissues, which represent the most common method for preserving tissue morphology in clinical specimens, are not the best sources for gene expression profiling analysis. The RNA obtained from such samples is often degraded, fragmented, and chemically modified, which leads to suboptimal sequencing libraries. In turn, these generate poor quality sequence data that may not be reliable for gene expression analysis and mutation discovery. In order to make the most of FFPE samples and obtain the best possible data from low quality samples, it is important to take certain precautions while planning experimental design, preparing sequencing libraries, and during data analysis. This includes the use of appropriate metrics for precise sample quality control (QC), identifying the best methods for various steps during the sequencing library generation, and careful library QC. In addition, applying correct software tools and parameters for sequence data analysis is critical in order to identify artifacts in RNA-seq data, filter out contamination and low quality reads, assess uniformity of gene coverage, and measure the reproducibility of gene expression profiles among biological replicates. These steps can ensure high accuracy and reproducibility for profiling of very heterogeneous RNA samples. Here we describe the various steps for sample QC, library preparation and QC, sequencing, and data analysis that can help to increase the amount of useful data obtained from low quality RNA, such as that obtained from FFPE-RNA tissues.

This method describes the steps to improve the quality and quantity of sequence data that can be obtained from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) RNA samples. We describe the methodology to more accurately assess the quality of FFPE-RNA samples, prepare sequencing libraries, and analyze the data from FFPE-RNA samples.

Optimización para la secuenciación y el análisis de muestras de FFPE-ARN degradadas

Gene expression analysis by RNA sequencing (RNA-seq) enables unique insights into clinical samples that can potentially lead to mechanistic understanding ...